王清 王宋平 曾超龍

（1 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸一科,四川 瀘州 646000;2 成都市龍泉驛區(qū)龍泉平安社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心住院部;3 成都市溫江區(qū)天府街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心）

肺腺癌是常見的肺臟原發(fā)惡性腫瘤之一〔1〕，惡性程度高，疾病進(jìn)展速度快，現(xiàn)有的治療手段尚不能取得滿意的遠(yuǎn)期療效〔2〕。因此，探究肺腺癌的分子疾病特征對提高我國肺癌治療水平有重要價值。微管不穩(wěn)定蛋白（Stathmin）是一種進(jìn)化上高度保守的可溶性蛋白質(zhì)〔3〕，研究發(fā)現(xiàn)Stathmin 在骨肉瘤〔4〕、食管癌〔5〕中有促癌作用。但Stathmin 在肺腺癌中的表達(dá)、臨床價值及生物學(xué)功能尚未見報道。本研究通過臨床數(shù)據(jù)分析及體外細(xì)胞學(xué)實驗等方法，旨在初步探索Stathmin 在肺腺癌中的臨床價值及對肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2015 年1 月1 日至2017 年1 月1日西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科行手術(shù)切除的肺腺癌組織及對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本50 例，患者年齡45～72 歲，中位年齡為54 歲。兔抗人SP 免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物科技有限公司；A549 細(xì)胞購自蘇州思瑞坦細(xì)胞公司；Stathmin 一抗（ab52630）購自美國Abcam 公司；RNA 提取試劑Trizol（#15596026）、轉(zhuǎn)染試 劑 LipofectamineTM3000（#L3000015）及RT-PCR 試劑盒（#10928042）均購自美國Invitrogen 公司；SYBR Green 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒（#1725120）購自美國BIO-RAD 公司；Stathmin 引物（上游5＇-TGATTCTCAGCCCTCGGT-3＇；下 游5＇-TCAAGACTTCCGCCTCAT-3＇），GAPDH 引物（上游5＇-CCAGGGCTGCTTTTAACTCT-3＇；下 游5＇-GGACTCCACGACGTACTCA-3＇）；Transwell 小室購自美國康寧公司；基質(zhì)膠購自美國B&D 公司；Stathmin shRNA 質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒購自廣州復(fù)能基因有限公司。

1.2 免疫組化檢測組織中Stathmin 表達(dá) 甲醛固定-石蠟包埋的組織切片常規(guī)脫蠟、水化及微波抗原修復(fù)，分別用3%過氧化氫及10%山羊血清封閉切片。用磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液按1 ∶100 比例配制Stathmin 一抗工作液，覆蓋組織切片，4℃搖晃、孵育過夜。PBS 溶液洗凈未結(jié)合一抗后，使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗結(jié)合相應(yīng)一抗，DAB 法顯示陽性蛋白。按文獻(xiàn)〔6〕方法計算切片染色得分:無陽性染色細(xì)胞為0 分，＜25%為1 分，25%～50%為2 分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量（qRT）-PCR 檢測Stathmin 表達(dá) 使用Trizol 試劑按操作指南提取A549細(xì)胞總RNA。取等量RNA 配制20 μl 的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA。cDNA 稀釋10 倍后取5 μl 配制實時熒光定量PCR 體系，按如下條件進(jìn)行PCR:95℃預(yù)變性30 s，1 循環(huán)；95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，40 循環(huán)。以GAPDH 作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算Stathmin mRNA 的相對表達(dá)量。

1.4 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染 A549 細(xì)胞以過夜培養(yǎng)達(dá)50%～70%密度接種于6 孔板中。Stathmin 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染分組:陰性對照（sh-ctrl）組每孔加入4.0 μg 的陰性對照質(zhì)粒及10 μl 轉(zhuǎn)染試劑，Stathmin（sh-Stathmin）組每孔加入4.0 μg 的Stathmin shRNA 質(zhì)粒及10 μl 轉(zhuǎn)染試劑；以無血清DMEM 培養(yǎng)基調(diào)整終體積為2 ml/孔。轉(zhuǎn)染48 h 后進(jìn)行下一步試驗。

1.5 Transwell 遷移與侵襲小室實驗 收集轉(zhuǎn)染48 h后的A549 細(xì)胞，以無血清DMEM 培養(yǎng)基重懸后調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml，按250 μl 每孔接種于Transwell 小室上室中，24 孔板內(nèi)每孔加入750 μl 含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后棄去上室內(nèi)培養(yǎng)基，PBS 洗滌2 遍后采用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，棉棒擦去上室面殘余細(xì)胞，在200×顯微鏡下觀察下室面細(xì)胞并計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)目。用1×DMEM 按8 ∶1稀釋50 mg/L 的基質(zhì)膠，按100 μl 每孔包被Transwell 小室底膜上室面，4℃風(fēng)干后放入24 孔板內(nèi)，重復(fù)上述步驟，計數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)目。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行χ2檢驗、t檢驗、Kaplan-Meier 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Stathmin 在肺腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義 肺腺癌組織Stathmin 平均表達(dá)水平（3.82±0.39）明顯高于對應(yīng)癌旁組織（1.23±0.41，t=6.228，P=0.004）。見圖1。以肺腺癌組織Stathmin 平均表達(dá)值為截斷點，分為Stathmin 高表達(dá)組和Stathmin 低表達(dá)組。Stathmin 高表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P=0.036）。見表1。Kaplan-Meier 分析顯示，高表達(dá)Stathmin 的肺癌患者術(shù)后總體生存期（HR=2.333，P=0.004）及無病生存期（HR=2.125，P=0.006）均較短。見圖2。

圖1 Stathmin 在肺腺癌組織中表達(dá)(DAB,×400)

圖2 Stathmin 表達(dá)水平對肺腺癌患者預(yù)后的影響

表1 Stathmin 異常表達(dá)在肺腺癌中的臨床意義〔n(%)〕

2.2 沉默Stathmin 抑制A549 細(xì)胞遷移和侵襲 sh-ctrl 組A549 細(xì)胞內(nèi)Stathmin 表達(dá)水平（0.86±0.24）明顯高于sh-Stathmin 組（0.21±0.11，t=4.414，P=0.013）。見圖3。sh-Stathmin 組遷移細(xì)胞數(shù)目〔（21.11±3.25）個〕明顯低于sh-ctrl 組〔（42.38±5.01）個，t=2.511，P=0.032〕；sh-Stathmin 組侵襲細(xì)胞數(shù)目〔（10.29 ±2.04）個〕 明顯低于sh-ctrl組〔（23.46±3.18）個，t=2.623，P=0.028〕。見圖4。

圖3 Western 印跡檢測各組Stathmin 的表達(dá)

圖4 沉默Stathmin 表達(dá)影響A549 細(xì)胞遷移及侵襲(結(jié)晶紫,×200)

3 討論

生物學(xué)文獻(xiàn)〔7〕表明，Stathmin 是一種對生物體器官發(fā)育有關(guān)鍵調(diào)控作用的基因，其基因的突變、異常修飾及缺失將引起多種先天性疾病的發(fā)生。本研究結(jié)果證實Stathmin 高表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者不良預(yù)后密切相關(guān)。研究顯示，Stathmin 高表達(dá)的宮頸癌患者臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高、5 年生存率更低〔8〕，在胃癌〔9〕和結(jié)腸癌〔10〕中也有相似的研究結(jié)果。提示Stathmin 可能是一種潛在的腫瘤標(biāo)志物。研究還顯示，Stathmin 在動物體內(nèi)還有抑制腫瘤增殖的能力〔11〕。綜上，Stathmin 表達(dá)下調(diào)與肺腺癌惡性臨床特征密切相關(guān)，其作為一種促癌基因，在抗肺腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要作用。研究〔12，13〕結(jié)果指出miRNA 的異常表達(dá)可能是Stathmin 在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的原因之一，值得在今后的研究中進(jìn)一步探索。