周 濟(jì)， 張雪明， 耿江予， 牛萍萍， 孫 瑤

（上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔種植科，上海 200072）

頜面部腫瘤的放療及唾液腺結(jié)石均會(huì)造成唾液腺的嚴(yán)重不可逆性損傷， 導(dǎo)致唾液分泌功能降低、腺體纖維化等[1]，促進(jìn)唾液腺功能修復(fù)成為臨床上亟待解決的問(wèn)題。 現(xiàn)階段臨床上針對(duì)唾液腺損傷主要以藥物、手術(shù)治療為主，近年來(lái)干細(xì)胞療法被提出，但唾液腺干/祖細(xì)胞在其再生過(guò)程中的作用機(jī)制尚不清楚。 角蛋白 14（cytokeratin 14，K14）細(xì)胞主要為唾液腺干細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞，K14+唾液腺干細(xì)胞可分化為導(dǎo)管細(xì)胞[2]。 前期研究表明，阻塞性下頜下腺在去除梗阻因素后具有再生能力，因此，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建下頜下腺主導(dǎo)管結(jié)扎-開(kāi)放模型，觀察唾液腺損傷及再生過(guò)程中K14+細(xì)胞表達(dá)分布特征并探討其在損傷修復(fù)中的潛在作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8 周齡雌性野生型小鼠（C57BL/6J）36 只，購(gòu)于上海南方模式生物研究中心， 飼養(yǎng)于同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院SPF 級(jí)動(dòng)物室。 晝夜節(jié)律正常， 室溫23 ℃，相對(duì)濕度55%，固體飼料喂養(yǎng)，消毒飲水。 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)同濟(jì)大學(xué)倫理委員會(huì)認(rèn)可批準(zhǔn)（TJLAC-017-027）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

HE 染色試劑盒（生工生物公司，中國(guó)），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （TaKaRa 公司， 日本），PCR SYBR Green-Master Mix （上海翊圣生物公司， 中國(guó)），PCR 引物（生工生物公司，中國(guó)），K14 抗體（賽默飛公司，美國(guó)），NGF 抗體（Abcam 公司，英國(guó)），AQP5 抗體（默克公司，德國(guó)），熒光二抗 IgG（Invitrogen 公司，美國(guó)），DAPI（Sigma 公司，美國(guó)），枸櫞酸鈉修復(fù)溶液（凱基，中國(guó)），小動(dòng)脈鈦夾（杭州康生醫(yī)療器械有限公司，中國(guó)）。

1.3 下頜下腺主導(dǎo)管結(jié)扎-開(kāi)放模型構(gòu)建

選取8 周齡雌性野生型小鼠， 腹腔注射1%戊巴比妥（80 mg/kg），頸部術(shù)區(qū)備皮、消毒，沿頸部中線剪開(kāi)小鼠皮膚，暴露筋膜下雙側(cè)下頜下腺，剝離舌下腺，分離雙側(cè)近心端下頜下腺主導(dǎo)管，用小動(dòng)脈鈦夾行雙側(cè)結(jié)扎（圖1），分層縫合[3-4]。主導(dǎo)管結(jié)扎14 d 后，對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉、備皮、消毒，去除雙側(cè)主導(dǎo)管鈦夾，分層縫合。

圖1 下頜下腺主導(dǎo)管結(jié)扎示意圖Figure 1 The schematic model of mouse SMG duct ligationdeligation

1.4 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色

將結(jié)扎 0、14 d 及開(kāi)放 3、28 和 56 d 的小鼠處死后取雙側(cè)下頜下腺， 將下頜下腺置于4%多聚甲醛溶液中，4 ℃放置48 h 后， 乙醇梯度脫水后進(jìn)行石蠟包埋。 石蠟組織連續(xù)切片， 每片厚度4 μm，53 ℃恒溫烤片 2 h，60 ℃烘箱 30 min， 二甲苯及梯度乙醇脫蠟后，進(jìn)行HE 染色。

1.5 免疫熒光染色

石蠟切片脫蠟后， 置入枸櫞酸鈉溶液中98 ℃抗原修復(fù)20 min， 恢復(fù)至室溫后磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗 3 次，每次 5 min，山羊血清37 ℃封閉1 h。 加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS 洗 3 次，熒光二抗室溫孵育 1 h，4′，6-二瞇基-2-苯基吲哚 （4′, 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復(fù)染5 min，封片后熒光顯微鏡拍照。

1.6 RNA 提取及 qPCR 檢測(cè)

摘取結(jié)扎 0、14 d 及開(kāi)放 3、28、56 d 小鼠右側(cè)下頜下腺組織，提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。 使用 PCR SYBR Green Master Mix 和Lighter Cycler qPCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增， 以甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為每個(gè)基因的內(nèi)源性對(duì)照，分析靶基因相對(duì)mRNA 表達(dá)。 引物序列見(jiàn)表1。

表1 qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences of qPCR

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 兩組間比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析。 P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 K14+細(xì)胞在下頜下腺發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)特點(diǎn)

胚胎期16.5 d 下頜下腺中約53.9%的細(xì)胞表達(dá)K14（圖 2A、E），新生 1 周齡小鼠下頜下腺中 K14+細(xì)胞數(shù)量較胚胎期減少（圖2B），隨著年齡增長(zhǎng)，3 周齡小鼠下頜下腺中K14+細(xì)胞數(shù)量逐漸減少（圖2C），成年后8 周齡小鼠下頜下腺中僅有少量 （約4.2%）K14+細(xì)胞存在（圖 2D、E）。

圖2 下頜下腺發(fā)育過(guò)程中K14+細(xì)胞表達(dá)特點(diǎn)（×180）Figure 2 Expression characteristics of K14+cells during the development of SMG（×180）

2.2 小鼠下頜下腺主導(dǎo)管結(jié)扎-開(kāi)放模型中下頜下腺形態(tài)變化

8 周齡C57 小鼠， 用小型鈦夾夾閉主導(dǎo)管，14 d后小鼠腺體出現(xiàn)明顯萎縮， 腺體質(zhì)量/體質(zhì)量數(shù)值減少，表面見(jiàn)白色索狀條紋，質(zhì)地變韌（圖3A~E）；導(dǎo)管開(kāi)放 3、28 d 后腺體質(zhì)量/體質(zhì)量指數(shù)增加（圖 3E）；至開(kāi)放56 d 時(shí)，腺體質(zhì)量/體質(zhì)量數(shù)值基本恢復(fù)至對(duì)照組水平，腺體質(zhì)地變軟，顏色恢復(fù)正常，提示導(dǎo)管開(kāi)放56 d 小鼠下頜下腺可能基本恢復(fù)至正常水平（圖3D、E）。 在對(duì)照組中，下頜下腺腺泡結(jié)構(gòu)完整，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核位于基底部，各級(jí)導(dǎo)管結(jié)構(gòu)清晰（圖3F）； 小鼠下頜下腺主導(dǎo)管結(jié)扎14 d 后腺體萎縮明顯，HE 染色可見(jiàn)明顯纖維化組織形成， 導(dǎo)管擴(kuò)張，且腺泡形態(tài)皺縮甚至消失（圖3G）；導(dǎo)管開(kāi)放28 d及56 d 時(shí)，腺體形態(tài)學(xué)上逐漸恢復(fù)正常（圖3I、J）。

圖3 下頜下腺在主導(dǎo)管結(jié)扎-開(kāi)放模型中形態(tài)學(xué)變化Figure 3 Comparison of morphological variation of SMG in duct ligation-deligation model

2.3 下頜下腺損傷修復(fù)過(guò)程中分泌功能相關(guān)基因的表達(dá)

在對(duì)照組中，導(dǎo)管合成蛋白功能的標(biāo)志物神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）呈顆粒狀分布于導(dǎo)管細(xì)胞上，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（圖4A），腺泡分泌功能標(biāo)志物水通道蛋白 5（aguaporin5，AQP5）表達(dá)于腺泡細(xì)胞頂端和側(cè)端 （圖4F）。 免疫熒光染色觀察到， 下頜下腺主導(dǎo)管結(jié)扎 14 d 后，NGF 及 AQP5 的表達(dá)顯著減少，開(kāi)放56 d 后表達(dá)接近正常水平（圖4B~E，4G~J）；qPCR 結(jié)果顯示 NGF、 表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，Egf） 和 AQP5 mRNA 表達(dá)水平在下頜下腺結(jié)扎14 d 時(shí)顯著下調(diào)， 而開(kāi)放56 d 時(shí)表達(dá)量仍低于對(duì)照組（圖4L~N），提示下頜下腺組織形態(tài)基本恢復(fù)， 但功能尚未完全修復(fù)；角蛋白 5（cytokeratin5，K5） mRNA 表達(dá)量在結(jié)扎 14 d時(shí)顯著上調(diào)，腺體再生階段表達(dá)量逐漸降低（圖4K）。下頜下腺損傷后修復(fù)早期K14+細(xì)胞被激活參與再生。

圖4 小鼠下頜下腺損傷修復(fù)過(guò)程中分泌功能相關(guān)蛋白AQP5 和NGF 的表達(dá)Figure 4 Expression of secretory function-related proteins and genes during the injury and repair of mouse SMG

2.4 下頜下腺損傷及再生過(guò)程中的組織學(xué)變化

在對(duì)照組中， 導(dǎo)管中有少量K14+細(xì)胞， 且與Ki67 共染的K14+細(xì)胞約占細(xì)胞總量的 1.0%（圖5A、F）。在實(shí)驗(yàn)組中，小鼠下頜下腺主導(dǎo)管結(jié)扎14 d后，免疫熒光染色觀察到導(dǎo)管細(xì)胞中處于增殖狀態(tài)的K14+細(xì)胞約2.0%， 與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （圖5B、F）；導(dǎo)管開(kāi)放3 d 時(shí)，但仍有大量纖維化組織存在， 免疫熒光染色觀察到K14+及Ki67+細(xì)胞比率明顯增加，約為10.9%，提示K14+細(xì)胞在修復(fù)早期被激活，且處于增殖狀態(tài)（圖5C、F）。導(dǎo)管開(kāi)放28 d 及56 d 時(shí)，增殖狀態(tài)的K14+細(xì)胞比率逐漸減少（圖5D~F）。 qPCR 結(jié)果顯示，導(dǎo)管開(kāi)放 3 d 時(shí)，K14 基因表達(dá)顯著上調(diào)，開(kāi)放56 d 時(shí)恢復(fù)至正常水平。

圖5 小鼠下頜下腺損傷修復(fù)過(guò)程中K14+細(xì)胞分布特征Figure 5 Expression and distribution characteristics of K14+cells during the injury and regeneration process of mouse SMG

3 討論

唾液腺是分泌唾液的外分泌性腺體，唾液腺阻塞會(huì)導(dǎo)致腺體萎縮，分泌功能下降。 臨床上常見(jiàn)的唾液腺阻塞性疾病多為唾液腺結(jié)石，長(zhǎng)期唾液腺阻塞會(huì)導(dǎo)致不可逆性損傷，甚至并發(fā)感染[5]。 現(xiàn)階段采取的治療手段一般分為兩種：一種是摘除不可逆性損傷的腺體，另一種是去除阻塞性因素以促進(jìn)唾液腺再生[6]。 如果能夠探索下頜下腺再生機(jī)制，有效保留殘余腺體組織并促進(jìn)其再生，將能夠提高唾液腺阻塞性疾病的治療效果，改善患者的生活質(zhì)量。 唾液腺主導(dǎo)管結(jié)扎-開(kāi)放模型有效模擬唾液腺阻塞性疾病，為探索唾液腺再生機(jī)制提供了有效手段。 小鼠下頜下腺組織學(xué)結(jié)構(gòu)與人類(lèi)有所差別，小鼠擁有獨(dú)特的顆粒曲管結(jié)構(gòu)， 尤其在雄性小鼠中比較發(fā)達(dá)， 為避免顆粒曲管對(duì)研究結(jié)果觀察分析造成干擾，因此選取雌性小鼠作為研究對(duì)象[7]。

目前普遍認(rèn)為唾液腺穩(wěn)態(tài)是唾液腺干細(xì)胞依賴(lài)性的，但干細(xì)胞對(duì)于維持唾液腺穩(wěn)態(tài)的貢獻(xiàn)尚未明確。 Pringle 等[8]提出，在唾液腺損傷修復(fù)過(guò)程中，新生腺泡細(xì)胞及導(dǎo)管細(xì)胞均由腺體中干細(xì)胞分化而來(lái)，然而干細(xì)胞對(duì)唾液腺細(xì)胞更新所作貢獻(xiàn)的機(jī)制尚不清楚；Aure 等[9]利用基因脈沖追蹤技術(shù)，證明了導(dǎo)管結(jié)扎損傷后腺泡細(xì)胞通過(guò)自我復(fù)制來(lái)維持腺體內(nèi)穩(wěn)態(tài)， 存活的腺泡細(xì)胞可增殖以促進(jìn)腺體再生；Kwak 等[10]通過(guò)譜系示蹤技術(shù)，發(fā)現(xiàn) K14+導(dǎo)管細(xì)胞僅能生成導(dǎo)管細(xì)胞， 而在腺體遭受?chē)?yán)重?fù)p傷后，導(dǎo)管細(xì)胞可在唾液腺中產(chǎn)生腺泡細(xì)胞[11]。上述研究表明，唾液腺再生過(guò)程中腺泡細(xì)胞主要有兩種來(lái)源：一類(lèi)是殘余腺泡細(xì)胞增殖而來(lái)[9，12]，另一類(lèi)是導(dǎo)管中干/祖細(xì)胞分化為腺泡細(xì)胞，這與唾液腺發(fā)育過(guò)程相似[2，13]。 K14+細(xì)胞分為干/祖細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞，其中干/祖細(xì)胞主要分布于排泄管基底側(cè)和閏管[14]，能夠分化為腺泡細(xì)胞的主要是肌上皮細(xì)胞。 小鼠唾液腺發(fā)育過(guò)程中， 胚胎15 d 前K14+細(xì)胞可分化為導(dǎo)管細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞和腺泡細(xì)胞，胚胎16 d 開(kāi)始K14+細(xì)胞具有譜系限制性，僅能夠分化為導(dǎo)管細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞[10]。 有研究表明唾液腺?lài)?yán)重?fù)p傷后，K14+導(dǎo)管干/祖細(xì)胞分化能力增強(qiáng)， 由單能干/祖細(xì)胞誘導(dǎo)形成多能干/祖細(xì)胞，可分化為導(dǎo)管細(xì)胞以及腺泡細(xì)胞[11，15]；同時(shí)肌上皮細(xì)胞可轉(zhuǎn)分化為祖細(xì)胞樣細(xì)胞，可分化為腺泡細(xì)胞促進(jìn)腺體再生[2，16-18]。 本研究發(fā)現(xiàn)下頜下腺主導(dǎo)管開(kāi)放早期，腺體中K14 表達(dá)顯著增高， 且在導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)中能觀察到K14+細(xì)胞，這表明唾液腺長(zhǎng)期阻塞后，仍保留了有一定再生能力的腺體組織，并且導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)參與了組織的再生，這提示K14 可作為唾液腺早期再生修復(fù)的一個(gè)標(biāo)志[19-20]。

下頜下腺長(zhǎng)期結(jié)扎會(huì)導(dǎo)致腺體萎縮，本研究中組織學(xué)結(jié)果顯示，下頜下腺主導(dǎo)管結(jié)扎14 d 后腺體萎縮，質(zhì)量減輕，腺泡結(jié)構(gòu)部分消失，導(dǎo)管結(jié)構(gòu)擴(kuò)張，纖維結(jié)締組織增加。 基因表達(dá)分析顯示，腺體功能標(biāo)志物 AQP5、NGF、Egf 表達(dá)量明顯下調(diào)[21-23]，導(dǎo)管開(kāi)放后，AQP5、NGF 和Egf 基因表達(dá)量在主導(dǎo)管開(kāi)放56 d 內(nèi)均保持較低水平；免疫熒光染色觀察到AQP5 和NGF 表達(dá)量在導(dǎo)管開(kāi)放28 d 時(shí)逐漸增加，腺體組織學(xué)形態(tài)在開(kāi)放56 d 時(shí)基本恢復(fù)。 因此，盡管唾液腺組織學(xué)形態(tài)恢復(fù)至正常狀態(tài)，但腺泡分泌功能和導(dǎo)管合成蛋白的能力尚未恢復(fù)，這提示K14+細(xì)胞可能在唾液腺早期形態(tài)恢復(fù)中發(fā)揮作用，但唾液腺功能的恢復(fù)是一個(gè)長(zhǎng)期過(guò)程，K14+細(xì)胞在這過(guò)程中的作用有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明唾液腺主導(dǎo)管結(jié)扎后，其組織學(xué)形態(tài)及功能均會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)管開(kāi)放后殘余的腺體組織具有再生能力，K14+細(xì)胞顯著增加可作為唾液腺再生過(guò)程開(kāi)始的早期標(biāo)志。