宋恭帥 劉家源 袁雅雯 濮發(fā)祥 王丹麗 蔡瑞康 肖功年 龔金炎,*

(1浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310023；2浙江遂昌利民藥業(yè)有限公司，浙江 麗水 323302)

梔子黃色素是一種重要的水溶性天然色素，其含有α-藏花素、藏花酸、綠原酸及黃酮等活性成分，主要提取自茜草科植物的果實(shí)[1]。桅子黃色素顏色鮮艷、安全無毒，具有良好的藥用活性，如保肝利膽、活血化瘀、抗神經(jīng)衰弱及抑制腫瘤細(xì)胞增殖等[2-3]，已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、工業(yè)和化妝品等重要領(lǐng)域。然而，梔子黃色素水溶液對(duì)光照、溫度、酸堿度等較為敏感，穩(wěn)定性差，限制了其在保健食品、藥品等領(lǐng)域的應(yīng)用[4-5]。

脂質(zhì)體是一種具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)、內(nèi)部包含水相的閉合囊泡，具有高細(xì)胞親和性、組織相容性和低免疫原性等特點(diǎn)，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化工等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值[6]。通常，脂質(zhì)體用于包封抗氧化劑、食品添加劑、礦物質(zhì)、抑菌劑等活性成分，可有效提高被包裹物質(zhì)的穩(wěn)定性[7]。然而，研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體在胃腸道中的酶、膽鹽等作用下易乳化、水解，從而降低包封物質(zhì)的生物利用率。此外，在貯藏過程中，脂質(zhì)體易發(fā)生氧化、聚集，從而導(dǎo)致包封物質(zhì)泄漏[8]。通過物理化學(xué)方法將多糖、蛋白等物質(zhì)修飾于脂質(zhì)體表面是增強(qiáng)脂質(zhì)體穩(wěn)定性和提高包封物質(zhì)可控性的主要方法。焦巖等[9]制備了多聚賴氨酸修飾的葉黃素納米脂質(zhì)體并評(píng)價(jià)了其包封效果和胃腸消化釋放性能，認(rèn)為該脂質(zhì)體可有效增強(qiáng)對(duì)脂溶性葉黃素的包封效果和胃腸消化釋放性能。

殼聚糖是一種在自然界大量存在的陽離子聚合物，主要通過甲殼素脫乙?；频茫瑸榘咨虻S色固體粉末，具有良好的生物可降解性和生物相容性[10]。Tan等[11]制備了殼聚糖修飾的類胡蘿卜素脂質(zhì)體并研究了其體外釋放行為，發(fā)現(xiàn)殼聚糖修飾脂質(zhì)體在功能食品領(lǐng)域具有更高的應(yīng)用價(jià)值。本研究首先以蛋黃卵磷脂為原料，采用傳統(tǒng)的乙醇注入法制備梔子黃脂質(zhì)體，以梔子黃包封率(encapsulation efficiency,EE)為指標(biāo)，基于Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化梔子黃脂質(zhì)體的制備工藝；再利用殼聚糖修飾脂質(zhì)體表面，通過Zeta電位與粒徑、透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)、傅里葉紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)等方法對(duì)其外觀結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)進(jìn)行表征；同時(shí)以Zeta電位與粒徑和梔子黃色素釋放率為考察指標(biāo)，研究紫外照射、加熱及體外模擬消化對(duì)殼聚糖修飾前后脂質(zhì)體穩(wěn)定性的影響，旨在為水溶性類胡蘿卜素在新型功能食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梔子黃色素(色價(jià)500)，浙江諾一生物科技有限公司；蛋黃卵磷脂(純度 >90%)、膽固醇(純度 >95%)、殼聚糖(中粘度)、溴化鉀，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇、二氯甲烷、鹽酸、氫氧化鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶、膽鹽，美國(guó)Sigma公司。

1.2 設(shè)備與儀器

Spectra MAX 190 酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；Evolution 60S紫外可見分光光度計(jì)、Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Thermo公司；加熱磁力攪拌器，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司；AL204電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；JEM-2100F透射電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；馬爾文Zetaszier Nano-ZS粒徑分析儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；FE20 pH計(jì)，梅特勒儀器有限公司；Direct Q8超純水系統(tǒng)，法國(guó)Milli-Q公司；FRQ小型超聲波清洗機(jī)，杭州法蘭特超聲波科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 梔子黃脂質(zhì)體的制備 采用乙醇注入法制備梔子黃脂質(zhì)體[12]。將蛋黃卵磷脂和膽固醇按一定比例溶于二氯甲烷-乙醇混合液中，待完全溶解后，于一定溫度下邊攪拌邊緩慢將其滴加至適量的梔子黃磷酸鹽緩沖液(0.02 mol·L-1，pH值7.4)中，滴加完成后繼續(xù)恒溫?cái)嚢?0 min，獲得脂質(zhì)體溶液。在40℃真空條件下，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去脂質(zhì)體溶液中的乙醇及二氯甲烷，并加入pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)定容至原始體積后，超聲處理30 min(100 W)，得脂質(zhì)體懸浮液并于4℃條件下儲(chǔ)存。

1.3.2 梔子黃包封率(EE)的測(cè)定

1.3.2.1 梔子黃標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 準(zhǔn)確稱取100 mg梔子黃色素于100 mL容量瓶中，用超純水定容后搖勻靜置，配制成1 mg·mL-1的梔子黃溶液。取10 mL上述標(biāo)準(zhǔn)液定容至100 mL，配制成0.1 mg·mL-1的梔子黃母液，分別取1、2、3、4、5、6 mL母液，定容至10 mL，配制成濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg·mL-1的溶液，搖勻靜置。以超純水做空白對(duì)照，于441 nm處測(cè)定吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=1.173 5x+ 0.007，R2=0.999 6。

1.3.2.2 梔子黃EE的計(jì)算 采用超速離心法測(cè)定梔子黃EE[13]。取1 mL梔子黃脂質(zhì)體置于超速離心管中，放入高速離心機(jī)中18 000 r·min-1離心30 min，移取上清液加超純水定容至10 mL，于441 nm處測(cè)定吸光度A0，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算游離梔子黃色素的含量W游離。根據(jù)公式計(jì)算EE：

(1)

式中，W總量為梔子黃色素的總添加量。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken法設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)，選取攪拌溫度、卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比和PBS體積3個(gè)因素，以EE為響應(yīng)值，做三因素三水平的中心組合試驗(yàn)，以確定制備梔子黃脂質(zhì)體的最佳工藝參數(shù)。響應(yīng)面因素水平及編碼值見表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平表Table 1 The levels and factors of response surface methodology (RSM)

1.3.4 殼聚糖修飾脂質(zhì)體的制備 殼聚糖溶液的配制：稱取0.2 g殼聚糖粉末溶解于100 mL體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液中，在室溫條件下攪拌至完全溶解。

殼聚糖修飾脂質(zhì)體的制備：在室溫條件下，將梔子黃脂質(zhì)體溶液緩慢滴加至殼聚糖溶液中，50℃恒溫?cái)嚢? h，體積比為1∶1。

1.3.5 梔子黃脂質(zhì)體形態(tài)表征

1.3.5.1 粒徑分布及Zeta電位 參照鄭景霞等[14]的方法，采用粒徑分析儀測(cè)定樣品的粒徑分布、聚合物分散性指數(shù)(polymer dispersity index,PDI)與Zeta電位。1.3.5.2 FT-IR 稱取適量干燥的溴化鉀粉末和樣品，于紅外燈下研磨混勻，并用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行掃描測(cè)定。參照Rondeau-Mouro等[15]的方法，設(shè)置光譜范圍：400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)：64次。1.3.5.3 TEM 參照Charcosset等[16]的方法，采用磷鎢酸負(fù)染法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，并用透射電子顯微鏡分析樣品的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.3.6.1 光穩(wěn)定性的測(cè)定 參照Wang等[17]的方法。分別配制一定濃度的空白脂質(zhì)體溶液、未修飾梔子黃脂質(zhì)體溶液和殼聚糖修飾梔子黃脂質(zhì)體溶液，置于超凈工作臺(tái)上采用紫外光照射12 h，測(cè)定光照前后樣品的Zeta電位值與平均粒徑。

1.3.6.2 熱穩(wěn)定性的測(cè)定 參照Klinkesorn等[18]的方法。將新配制的空白脂質(zhì)體溶液、未修飾梔子黃脂質(zhì)體溶液和殼聚糖修飾梔子黃脂質(zhì)體溶液于70℃恒溫水浴避光加熱2 h，并測(cè)定避光條件下加熱前后樣品的Zeta電位值與平均粒徑。

1.3.7 體外模擬消化試驗(yàn) 參照Patel等[19]的方法進(jìn)行梔子黃脂質(zhì)體體外模擬釋放動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。首先將樣品置于37℃水浴下加熱10 min，再加入適量的模擬胃液，即胃蛋白酶鹽酸溶液(15 mg·mL-1胃蛋白酶溶于0.1 mg·mL-1鹽酸)，恒溫反應(yīng)1 h。之后，加入適量的模擬腸液，即胰酶和膽鹽緩沖液，其質(zhì)量濃度分別為3.2 mg·mL-1和5 mg·mL-1，并用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4。在反應(yīng)5、15、25、30、60、90、120、150、180、240、300、360 min時(shí)分別取樣250 μL，于90℃水浴加熱10 min進(jìn)行滅酶處理，并加入等量新鮮消化液。所取樣品于10 000 r·min-1條件下離心5 min以除去沉淀，根據(jù)公式計(jì)算梔子黃的釋放率(R)[20]：

(2)

式中，Wt為在t時(shí)刻消化液中梔子黃色素質(zhì)量；W0為消化液中梔子黃的起始質(zhì)量；W總為脂質(zhì)體中包封的梔子黃質(zhì)量。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，采用SPSS 21.0軟件計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和顯著性，顯著性分析的置信區(qū)間為95%(P<0.05)，并用Microsoft Word、Design-Expert 8.0.6、Origin 8.0及Excel軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 攪拌溫度對(duì)脂質(zhì)體制備的影響 在卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比5∶1，PBS緩沖液體積30 mL條件下，研究攪拌溫度對(duì)梔子黃脂質(zhì)體平均粒徑、PDI及EE的影響。

由圖1可知，脂質(zhì)體的平均粒徑和PDI的整體趨勢(shì)隨著攪拌溫度的升高而增大，而EE則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)攪拌溫度較低時(shí)，無法有效地引發(fā)磷脂的相變，導(dǎo)致脂質(zhì)體膜的通透性較差，從而使脂質(zhì)體的EE、PDI和平均粒徑較小[14]；而當(dāng)溫度過高時(shí)，易增大脂質(zhì)體膜的通透性與流動(dòng)性，導(dǎo)致其粒徑變大以及包封的梔子黃色素泄漏。鄭景霞等[14]研究發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素脂質(zhì)體在攪拌溫度為45～50℃時(shí)可獲得最高EE，本研究結(jié)果與其一致。因此，選擇50℃為制備梔子黃脂質(zhì)體的最佳攪拌溫度。

圖1 攪拌溫度對(duì)梔子黃脂質(zhì)體制備的影響Fig.1 Effect of stirring temperature on the preparation of gardenia yellow liposome

2.1.2 質(zhì)量比對(duì)脂質(zhì)體制備的影響 在攪拌溫度50℃，PBS緩沖液體積30 mL條件下，研究卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比對(duì)梔子黃脂質(zhì)體平均粒徑、PDI及EE的影響。由圖2可知，隨著卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比的增加，EE和PDI呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的趨勢(shì)，而平均粒徑則先減小后趨于平穩(wěn)。卵磷脂是制備脂質(zhì)體的主要原料，而膽固醇為脂膜的重要組成部分，其可影響脂溶性物質(zhì)與脂質(zhì)體的融合[21]。當(dāng)質(zhì)量比小于5∶1時(shí)，無法形成大量的脂質(zhì)體且磷脂雙分子層排列不緊密，增大了脂質(zhì)體的流動(dòng)性，導(dǎo)致粒徑變大及EE下降；當(dāng)質(zhì)量比大于5∶1時(shí)，脂質(zhì)體膜不易形成，從而使脂質(zhì)體的數(shù)量下降。因此，選擇卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比為5∶1進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

圖2 質(zhì)量比對(duì)梔子黃脂質(zhì)體制備的影響Fig.2 Effect of mass ratio on the preparation of gardenia yellow liposome

2.1.3 緩沖液體積對(duì)脂質(zhì)體制備的影響 在攪拌溫度50℃，卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比5∶1條件下，研究PBS緩沖液體積對(duì)梔子黃脂質(zhì)體平均粒徑、PDI及EE的影響。由圖3可知，EE隨著緩沖液體積的增加先升高后趨于平穩(wěn)，而平均粒徑和PDI則呈現(xiàn)先下降后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)?？赡苁且?yàn)榫彌_液體積的增加會(huì)降低脂質(zhì)體濃度并減少分子聚集，使得脂質(zhì)體的平均粒徑與PDI趨于平穩(wěn)。此外，適量的緩沖液可促進(jìn)磷脂雙分子層的有效排列，增加脂質(zhì)體與梔子黃色素的接觸，從而提高EE。因此，制備梔子黃脂質(zhì)體的最佳PBS緩沖液體積為30 mL。

圖3 緩沖液體積對(duì)梔子黃脂質(zhì)體制備的影響Fig.3 Effect of buffer volume on the preparation of gardenia yellow liposome

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 模型擬合 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The Box-Behnken design and results

對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二項(xiàng)式回歸擬合，得到攪拌溫度A、質(zhì)量比B、緩沖液體積C與EE之間的二次多項(xiàng)回歸方程為：

EE=78.82+0.37A+0.74B+0.36C+0.01AB+0.01BC-6.36A2-8.28B2-2.15C2。

由表3可知，二項(xiàng)式回歸方程的F值為811.51，且P值<0.000 1，差異極顯著；通過對(duì)方程進(jìn)行失擬項(xiàng)檢驗(yàn)，得到F值為0.02，其P值為0.995 4>0.05，差異不顯著；根據(jù)擬合方程的相關(guān)系數(shù)可知，多元二次方程擬合相關(guān)系數(shù)高于0.90，故該擬合的回歸模型，可用來預(yù)測(cè)響應(yīng)值與反應(yīng)參數(shù)之間的關(guān)系。此外，A、B、C、A2、B2和C2的P值均小于0.01，說明其對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著，且質(zhì)量比B是影響梔子黃EE的最主要因素。

表3 二項(xiàng)式回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance in binomial regression model

2.2.2 響應(yīng)面分析及反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化 根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)值與3個(gè)因素的等高線及響應(yīng)面圖(圖4～6)。

圖4 攪拌溫度與質(zhì)量比交互作用響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.4 Response surface and its contour plots for the interactive of stirring temperature and mass ratio on the preparation of gardenia yellow liposome

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，確定回歸模型預(yù)測(cè)的最佳反應(yīng)參數(shù)為：攪拌溫度51.5℃，質(zhì)量比5.2∶1，緩沖液體積32.4 mL，預(yù)測(cè)EE結(jié)果為78.85%。

圖5 攪拌溫度與緩沖液體積交互作用響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.5 Response surface and its contour plots for the interactive of stirring temperature and buffer volume on the preparation of gardenia yellow liposome

圖6 質(zhì)量比與緩沖液體積交互作用響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.6 Response surface and its contour plots for the interactive of mass ratio and buffer volume on the preparation of gardenia yellow liposome

2.2.3 驗(yàn)證檢驗(yàn) 為了驗(yàn)證該模型的準(zhǔn)確性，基于上述最優(yōu)條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果見表4。試驗(yàn)組平均值與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差小于1%，說明通過響應(yīng)面優(yōu)化得到的參數(shù)條件準(zhǔn)確可靠。

表4 響應(yīng)面模型驗(yàn)證Table 4 Test of optimum condition of acidolysis reaction

2.3 脂質(zhì)體形態(tài)表征

2.3.1 粒徑及Zeta電位分析 由表5可知，殼聚糖修飾梔子黃脂質(zhì)體、未修飾梔子黃脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體的Zeta電位值、平均粒徑和PDI差異顯著(P<0.05)，表明脂質(zhì)體的Zeta電位值和粒徑大小與梔子黃色素包封和殼聚糖修飾有直接關(guān)系?？瞻字|(zhì)體和未修飾梔子黃脂質(zhì)體的Zeta電位值均呈負(fù)電性，而經(jīng)殼聚糖修飾后Zeta電位值顯著升高且呈正電性。這是由于殼聚糖表面帶正電荷，其成功修飾于脂質(zhì)體表面后改變了脂質(zhì)體的Zeta電位值[21]。空白脂質(zhì)體的平均粒徑最小，僅為180.53 nm，包封梔子黃色素后脂質(zhì)體的平均粒徑有所增加，而殼聚糖修飾梔子黃脂質(zhì)體的平均粒徑顯著增加至282.17 nm，說明殼聚糖已成功負(fù)載于脂質(zhì)體表面從而使平均粒徑增加。而PDI值整體偏小，表明乙醇注入法制備的脂質(zhì)體粒徑分布較均勻，殼聚糖修飾后會(huì)導(dǎo)致粒徑分布較不均勻。

表5 脂質(zhì)體的Zeta電位、平均粒徑與PDITable 5 Zeta potential,mean diameter and PDI of liposomes

2.3.2 FT-IR分析 通過FT-IR分析進(jìn)一步研究了殼聚糖修飾梔子黃脂質(zhì)體形成過程中的化學(xué)變化。

如圖7所示，殼聚糖在1 650、1 589和1 420 cm-1處的特征峰分別是由于酰胺的伸縮振動(dòng)、NH2基團(tuán)中N-H彎曲振動(dòng)以及-CH2、-CH3對(duì)稱變形引起的[22]。而殼聚糖修飾脂質(zhì)體在1 589和1 420 cm-1處的特征峰消失，可能是由于殼聚糖表面的-NH3+與脂質(zhì)體表面的負(fù)電荷發(fā)生靜電作用引起的[23]。梔子黃色素在1 201 cm-1處的特征峰由-OH和C=C振動(dòng)引起，經(jīng)脂質(zhì)體包封后其特征峰消失，這可能是由于脂質(zhì)體與梔子黃色素之間H鍵、C=C雙鍵、范德華力及疏水作用力等相互作用導(dǎo)致梔子黃色素中部分特征峰強(qiáng)度減弱或消失[2]。

從卵磷脂、空白脂質(zhì)體和未修飾桅子黃脂質(zhì)體的FT-IR譜圖可知(圖7)，2 925和2 855 cm-1處均有2個(gè)明顯的特征峰且未發(fā)生偏移，主要是由磷脂雙分子層內(nèi)部疏水性基團(tuán)-CH2的振動(dòng)引起。而經(jīng)殼聚糖修飾后，這2處的特征峰強(qiáng)度有所減弱，可能的原因是殼聚糖與脂質(zhì)體間的靜電作用導(dǎo)致脂質(zhì)體內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微改變，同時(shí)該結(jié)果表明已成功通過殼聚糖修飾脂質(zhì)體表面。

圖7 不同樣品的紅外光譜圖Fig.7 Fourier transform infrared spectroscopy of various samples

2.3.3 TEM分析 空白脂質(zhì)體、未修飾梔子黃脂質(zhì)體和殼聚糖修飾梔子黃脂質(zhì)體的TEM結(jié)果如圖8所示。3種脂質(zhì)體都呈現(xiàn)球形微粒分布，且粒徑依次增大，該結(jié)果與2.3.1中脂質(zhì)體的平均粒徑分析結(jié)果相一致。由圖8-A可知，空白脂質(zhì)體呈現(xiàn)明顯的中空結(jié)構(gòu)，具有黑色圓形外殼。包封梔子黃色素后(圖8-B)，其內(nèi)腔被填滿，梔子黃色素分布于脂質(zhì)體的內(nèi)側(cè)，并與壁材緊密結(jié)合形成較為穩(wěn)定的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。此外，由圖8-C可知，殼聚糖修飾脂質(zhì)體外層存在明顯的包裹結(jié)構(gòu)，說明殼聚糖成功修飾于脂質(zhì)體表面并形成保護(hù)層。在殼聚糖修飾過程中，脂質(zhì)體粒徑有較明顯增大，但其分布較均勻穩(wěn)定、分散性良好且無明顯聚集產(chǎn)生，能有效增強(qiáng)梔子黃色素的生物利用率和體內(nèi)消化吸收利用效果。

圖8 空白脂質(zhì)體(A)、未修飾桅子黃脂質(zhì)體(B)和殼聚糖修飾桅子黃脂質(zhì)體(C)的透射電鏡圖Fig.8 Transmission electron microscopy of empty liposomes (A),unmodified gardenid yellow liposomes (B),and chitosan modified gardenid yellow liposomes (C)

2.4 脂質(zhì)體穩(wěn)定性分析

2.4.1 光穩(wěn)定性分析 由圖9可知，空白脂質(zhì)體照射前后的Zeta電位值分別為-13.01和-11.40 mV，平均粒徑分別為195.24和144.17 nm；未修飾桅子黃脂質(zhì)體照射前后的Zeta電位值分別為-5.15和-6.93 mV，平均粒徑分別為210.35和179.54 nm；殼聚糖修飾桅子黃脂質(zhì)體照射前后的Zeta電位值分別為18.62和17.06 mV，平均粒徑分別為278.66和265.24 nm。經(jīng)紫外照射后，空白脂質(zhì)體和殼聚糖修飾桅子黃脂質(zhì)體的Zeta電位值和平均粒徑均呈上升趨勢(shì)，而未修飾桅子黃脂質(zhì)體的Zeta電位值和平均粒徑則呈下降趨勢(shì)。此外，由于脂質(zhì)體在中性環(huán)境中呈負(fù)電性，因此在照射前后其Zeta電位值均為負(fù)值。該結(jié)果表明紫外照射可破壞脂質(zhì)體的整體結(jié)構(gòu)，而殼聚糖修飾可有效提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。

圖9 紫外照射前后脂質(zhì)體Zeta電位(A)與平均粒徑(B)的變化Fig.9 Changes of Zeta potential (A)and mean particle size (B)of liposomes before and after UV irradiation

2.4.2 熱穩(wěn)定性分析 由圖10可知，空白脂質(zhì)體加熱前后的Zeta電位值分別為-10.25和-11.78 mV，平均粒徑分別為197.62和166.31 nm；未修飾桅子黃脂質(zhì)體加熱前后的Zeta電位值分別為-5.01和-5.93 mV，平均粒徑分別為200.18和175.45 nm；殼聚糖修飾桅子黃脂質(zhì)體加熱前后的Zeta電位值分別為15.45和17.48 mV，平均粒徑分別為270.02和264.76 nm。經(jīng)加熱處理后3種脂質(zhì)體的Zeta電位值和平均粒徑均有變化，說明熱處理對(duì)脂質(zhì)體穩(wěn)定性有較明顯的影響。與紫外照射前后Zeta電位值和平均粒徑的變化趨勢(shì)類似，空白脂質(zhì)體和未修飾桅子黃脂質(zhì)體的Zeta電位值帶負(fù)電，而殼聚糖修飾桅子黃脂質(zhì)體的Zeta電位值則帶正電，該結(jié)果與上述分析結(jié)果一致。此外，3種脂質(zhì)體的平均粒徑均有所減少，表明加熱可降低脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

圖10 加熱前后脂質(zhì)體Zeta電位(A)與平均粒徑(B)的變化Fig.10 Changes of Zeta potential (A)and mean particle size (B)of liposomes before and after heating

2.5 體外模擬消化分析

未修飾梔子黃脂質(zhì)體和殼聚糖修飾梔子黃脂質(zhì)體中梔子黃色素體外釋放結(jié)果如圖11所示。在模擬胃液中(前60 min)，未修飾桅子黃脂質(zhì)體和殼聚糖修飾桅子黃脂質(zhì)體中梔子黃釋放率分別為39.10%和28.15%，在后續(xù)的模擬腸液中，其釋放率明顯增加，且在整個(gè)模擬消化過程中，殼聚糖修飾脂質(zhì)體中梔子黃的釋放率明顯低于未修飾脂質(zhì)體。這是由于殼聚糖對(duì)脂質(zhì)體有保護(hù)作用，可有效減少脂質(zhì)體與模擬消化液中各種酶的接觸，從而降低梔子黃色素的釋放率[24]。而胃液中主要含有胃蛋白酶，其對(duì)脂質(zhì)的消化作用弱，故梔子黃脂質(zhì)體在模擬腸液中的釋放率明顯高于其在模擬胃液中。該結(jié)果表明殼聚糖修飾可有效提高梔子黃脂質(zhì)體在胃腸消化過程中的穩(wěn)定性。

圖11 梔子黃色素在模擬消化液中的釋放率Fig.11 Release rate of gardenia yellow pigment in simulated digestive juice

3 討論

為了解決類胡蘿卜素生物利用率低且在加工貯藏過程中穩(wěn)定性差等問題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開展了大量研究。脂質(zhì)體、微膠囊包埋及納米乳液制備技術(shù)是目前最常用的3種色素穩(wěn)態(tài)化技術(shù)。其中，微膠囊制備所需設(shè)備復(fù)雜、生產(chǎn)成本高，而納米乳液制備較多使用非食品級(jí)的溶液。因此，脂質(zhì)體多用于食品級(jí)色素的包封[25-26]。脂質(zhì)體可有效提高色素的穩(wěn)定性與生物利用率。梔子黃屬于水溶性類胡蘿卜素。目前，對(duì)于水溶性類胡蘿卜素脂質(zhì)體制備的研究報(bào)道較少。陳瓊玲等[27]采用響應(yīng)面法優(yōu)化了制備白藜蘆醇納米脂質(zhì)體的最佳工藝參數(shù)，結(jié)果表明卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比和緩沖液體積均對(duì)脂質(zhì)體的制備有影響。朱帥等[28]報(bào)道蛋黃卵磷脂中的脂肪酸組成與種類差異對(duì)脂質(zhì)體性質(zhì)有較大的影響。Trucillo等[29]采用超臨界CO2法成功制備了卵磷脂/膽固醇脂質(zhì)體用于包封茶葉堿，結(jié)果表明，脂質(zhì)體中添加適量膽固醇可以有效減緩茶葉堿的釋放率。因此，適合的卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比是制備梔子黃脂質(zhì)體的關(guān)鍵。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法分析了攪拌溫度、卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比和PBS緩沖液體積與梔子黃脂質(zhì)體EE的相互關(guān)系。結(jié)果表明，3個(gè)因素對(duì)脂質(zhì)體EE均有極顯著影響，其中卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比是影響脂質(zhì)體EE的最主要因素。

近年來，采用脂質(zhì)體制備技術(shù)提高類胡蘿卜素的穩(wěn)定性和生物利用率已成為研究熱點(diǎn)。但是，脂質(zhì)體本身仍存在黏附力差、易水解，在加熱、強(qiáng)光及胃腸消化環(huán)境下穩(wěn)定性差等問題，在一定程度上限制了類胡蘿卜素脂質(zhì)體作為功能性成分及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在食品與藥品領(lǐng)域的應(yīng)用[9]。劉瑋琳等[6]研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體經(jīng)殼聚糖修飾后其穩(wěn)定性有明顯提高。劉欣等[30]制備了海藻酸鈉-殼聚糖修飾維生素C/β-胡蘿卜素復(fù)合脂質(zhì)體，并通過分析證明了修飾后脂質(zhì)體的穩(wěn)定性增強(qiáng)。本研究采用殼聚糖對(duì)梔子黃脂質(zhì)體進(jìn)行表面修飾，并分析其在紫外照射、加熱及體外模擬消化條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，殼聚糖修飾脂質(zhì)體的穩(wěn)定性明顯高于未修飾脂質(zhì)體。本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相一致，說明殼聚糖修飾可有效增強(qiáng)梔子黃脂質(zhì)體穩(wěn)定性。該技術(shù)首次應(yīng)用于水溶性類胡蘿卜素脂質(zhì)體的制備，可為后續(xù)其他水溶性類胡蘿卜素脂質(zhì)體的制備提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究采用響應(yīng)面法對(duì)梔子黃脂質(zhì)體制備的反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳反應(yīng)條件為：攪拌溫度51.5℃，卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比5.2∶1，緩沖液體積32.4 mL，所得梔子黃脂質(zhì)體EE為78.36%。通過平均粒徑與Zeta電位值、FT-IR及TEM等分析可知，已成功制備梔子黃脂質(zhì)體與殼聚糖修飾梔子黃脂質(zhì)體。經(jīng)紫外照射與加熱處理后，3種脂質(zhì)體的平均粒徑與Zeta值均有所減少，說明脂質(zhì)體穩(wěn)定性降低；經(jīng)體外模擬消化處理后，殼聚糖修飾脂質(zhì)體中梔子黃的釋放率明顯低于未修飾脂質(zhì)體，且在模擬腸液中梔子黃的釋放率更高。該結(jié)果表明殼聚糖修飾脂質(zhì)體在胃腸消化過程中的穩(wěn)定性強(qiáng)于未修飾脂質(zhì)體。后續(xù)試驗(yàn)將深入研究殼聚糖修飾梔子黃脂質(zhì)體的生物活性功能，以期為其廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。