劉 釗 熊 濤 趙英偉 楊 珺,* 康向陽

(1 北京林業(yè)大學(xué)林木育種國家工程實驗室，北京 100083；2 北京林業(yè)大學(xué)林木、花卉遺傳育種教育部重點實驗室，北京 100083；3 北京林業(yè)大學(xué)城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室，北京 100083；4 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；5 廣西壯族自治區(qū)國有東門林場，廣西 扶綏 532199)

桉樹(Eucalyptusspp.)隸屬桃金娘科桉屬高大喬木，具有生長迅速、適應(yīng)性強(qiáng)等特點[1]，是世界上最重要的人工商品林樹種之一，為工業(yè)生產(chǎn)提供了大量木材[2-3]，為制漿造紙?zhí)峁┝顺渥阍蟍4]。桉樹葉片含有的桉油還具有多種生物活性，是殺蟲劑、除草劑及各種藥品和化妝品中的重要有效成分[5-6]。作為世界上最重要的森林產(chǎn)品供應(yīng)源，桉樹在超過200個國家和地區(qū)廣泛引種種植[7-8]。目前，全球范圍內(nèi)桉樹人工商品林主要栽培使用的是雜交種[9]，但是近年來桉樹的遺傳改良遇到瓶頸，以雜交育種為主的良種選育已難以滿足日益增長的工業(yè)生產(chǎn)需求[10]。

多倍體育種是一種高效的林木遺傳改良途徑，已成功應(yīng)用于許多重要闊葉樹種的良種選育工作[11-14]。有研究表明，三倍體林木在生長速度、木材材性[15-16]、次生代謝產(chǎn)物含量[17]、病蟲害抗性[18]等特性上相較二倍體具有顯著優(yōu)勢。可以預(yù)見，開展桉樹多倍體新品種選育，對于提升桉樹木材產(chǎn)量和品質(zhì)具有重大意義。目前，自然界中仍未發(fā)現(xiàn)天然多倍體桉樹的存在[19]，雖人工誘導(dǎo)體細(xì)胞染色體加倍獲得了四倍體桉樹[20-21]，但其在株高地徑生長上較二倍體并無優(yōu)勢[22]。因此人工誘導(dǎo)桉樹配子染色體加倍，經(jīng)授粉雜交獲得三倍體新種質(zhì)是桉樹多倍體種質(zhì)創(chuàng)新工作的重要途徑。

秋水仙堿是一種可以有效阻斷染色體分離的誘變劑，已成功應(yīng)用于許多物種的染色體加倍研究工作[23-26]。但桉樹經(jīng)秋水仙堿誘導(dǎo)花粉染色體加倍的相關(guān)研究極少，僅在尾葉桉上成功誘導(dǎo)獲得了少量未減數(shù)2n花粉，且誘導(dǎo)的有效率較低[27]?？迪蜿柕萚28]在楊樹花粉染色體加倍研究中證明，提高人工誘導(dǎo)花粉染色體加倍效率的關(guān)鍵在于準(zhǔn)確預(yù)判和選擇對秋水仙堿敏感的小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的特定時期，以及恰當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)處理強(qiáng)度。此結(jié)果為進(jìn)一步開展人工誘導(dǎo)桉樹花粉染色體加倍研究提供了重要理論依據(jù)。

本研究以粗皮桉(EucalyptuspellitaF.V.Muell.)為對象，通過對花蕾發(fā)育以及小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂細(xì)胞學(xué)的特征與進(jìn)程等進(jìn)行觀察和分析，總結(jié)花蕾發(fā)育與小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的時序性規(guī)律；通過對不同發(fā)育階段花蕾施加秋水仙堿處理誘導(dǎo)粗皮桉花粉染色體加倍，研究建立高效誘導(dǎo)桉樹未減數(shù)2n花粉技術(shù)體系，以期為進(jìn)一步開展桉樹三倍體種質(zhì)創(chuàng)新工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以廣西壯族自治區(qū)國有東門林場雜交育種園內(nèi)2015年定植的粗皮桉無性系為研究材料。該無性系共有20棵分株，經(jīng)連續(xù)3年觀察，分株間長勢一致、花期穩(wěn)定且花量較大，適宜開展花粉染色體加倍技術(shù)研究。

1.2 材料采集

在無性系中選定長勢和花枝發(fā)育較為一致的10棵分株作為研究材料，于2019年分別選取朝向一致向南、距地面高度相近、花蕾數(shù)量相對一致的若干花枝作為候選采樣花枝。根據(jù)候選花枝自主枝基部起向頂端的著生位置，采用阿拉伯?dāng)?shù)字順序?qū)蜻x花枝進(jìn)行編號；對每個花枝上不同著生位置的花序，自花枝基部起向頂端使用英文大寫字母順序依次編號(圖1)。如編號2-D表示自主枝基部向頂端的第2花枝上，自花枝基部起的第4個花序。

圖1 花蕾采樣編號Fig.1 Sampling number of flower bud

自進(jìn)入花期起，持續(xù)監(jiān)測候選花枝上花蕾發(fā)育與小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂情況。當(dāng)首次觀察到目標(biāo)花枝上有小孢子母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂細(xì)線期時，進(jìn)行首次采樣并記為時間點0 h，此后每隔24 h進(jìn)行花蕾采樣，直至采樣結(jié)束。使用游標(biāo)卡尺測量待采花蕾直徑(測量3次取平均值)，然后立即將花蕾摘下放入預(yù)冷的卡諾固定液(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1)中進(jìn)行固定，并做好標(biāo)記和數(shù)據(jù)記錄。所有采樣花蕾在4℃下固定24 h后更換至裝滿70%乙醇的離心管中完全浸泡，置于4℃冷藏貯存待用。

1.3 小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的細(xì)胞學(xué)觀察

采用醋酸洋紅壓片法觀察粗皮桉小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程：固定好的花蕾沿蒴蓋脫落環(huán)位置進(jìn)行環(huán)割，取下蒴蓋后挑取花絲頂端的花藥轉(zhuǎn)移至載玻片，滴加2%醋酸洋紅染液，鑷子夾碎花藥游離出小孢子母細(xì)胞，染色5 min后蓋好蓋玻片。使用BX51光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)觀察記錄粗皮桉小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂各分裂相的特征及占比，并進(jìn)行顯微拍照。

1.4 人工誘導(dǎo)粗皮桉花粉染色體加倍

于2020年開展秋水仙堿溶液處理花蕾誘導(dǎo)粗皮桉花粉染色體加倍工作，采用將秋水仙堿溶液導(dǎo)入花枝切口的方法對候選花枝上的目標(biāo)花蕾進(jìn)行處理[29]，誘導(dǎo)粗皮桉未減數(shù)2n花粉：在近花序位置，用刀具斜向切入花枝，造成深至木質(zhì)部的切口。于切口處塞入棉線并用封口膜固定，棉線另一端置于離心管內(nèi)，將離心管內(nèi)0.5%濃度的秋水仙堿溶液導(dǎo)入切口花枝，經(jīng)植物維管系統(tǒng)輸送至花藥內(nèi)實現(xiàn)對小孢子母細(xì)胞的誘變處理，處理持續(xù)時長分別設(shè)置為3和6 h；誘變處理的同時設(shè)置不做處理的對照組，并做好標(biāo)記。為統(tǒng)計未減數(shù)2n花粉的有效誘導(dǎo)率，散粉時采集若干處理組和對照組單花，經(jīng)卡諾固定后對花粉進(jìn)行醋酸洋紅制片觀察，以單花內(nèi)未減數(shù)2n花粉占比超過1%為有效處理的標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計有效誘導(dǎo)率[30]。此外，為研究不同處理組別中小孢子母細(xì)胞處于減數(shù)分裂的具體時期，在進(jìn)行秋水仙堿誘導(dǎo)處理的同時采集固定臨近花枝處于相同發(fā)育狀態(tài)的花蕾，留待細(xì)胞學(xué)觀察和統(tǒng)計分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS軟件處理試驗數(shù)據(jù)：采用一般線性模型分析不同著生位置花蕾的平均直徑差異[31]；差異顯著時采用最小顯著差數(shù)法(least significant difference,LSD)進(jìn)行多重比較；有效誘導(dǎo)率與小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂各時期占比數(shù)據(jù)經(jīng)平方根反正弦轉(zhuǎn)換后，計算皮爾森相關(guān)系數(shù)；使用Excel軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗皮桉長、短花絲雄蕊小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察

根據(jù)采樣時間將花蕾樣本分為采樣組Ⅰ(48～96 h)、采樣組Ⅱ(144～196 h)和采樣組Ⅲ(240 h)共3組，對各組內(nèi)單花依次進(jìn)行醋酸洋紅壓片制片和顯微觀察，發(fā)現(xiàn)單一花蕾制片中存在多個不連續(xù)的小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂相。進(jìn)一步觀察統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)(表1)，粗皮桉單花內(nèi)生有兩種類型雄蕊：長花絲雄蕊(長花絲向內(nèi)卷曲、蒴蓋脫落前花藥緊貼花柱)和短花絲雄蕊(卷曲于長花絲內(nèi)側(cè))；各組別內(nèi)單花內(nèi)長雄蕊上小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程總是領(lǐng)先于短雄蕊。如當(dāng)單花內(nèi)長雄蕊上小孢子母細(xì)胞主要處于減數(shù)分裂細(xì)線期和粗線期時，短雄蕊上小孢子母細(xì)胞多數(shù)處于未進(jìn)入減數(shù)分裂期的狀態(tài)(采樣組Ⅰ)；當(dāng)長雄蕊上大部分小孢子母細(xì)胞發(fā)育至四分體和小孢子時期時，短雄蕊上小孢子母細(xì)胞仍以處于減數(shù)分裂中期Ⅰ-末期Ⅱ狀態(tài)為主(采樣組Ⅱ)。為便于統(tǒng)計各采樣時間點不同著生位置花蕾小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的具體發(fā)育進(jìn)程，后續(xù)研究統(tǒng)一以單花內(nèi)長雄蕊上小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂所處的主要時期，認(rèn)定為該花蕾的小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時期，進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計分析。

表1 粗皮桉花蕾內(nèi)不同類型雄蕊小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時期Table 1 Meiosis stage of microsporocytes among stamens of different types in the bud of Eucalyptus pellita

2.2 粗皮桉小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂細(xì)胞學(xué)特征與進(jìn)程

根據(jù)采樣時間點和花蕾著生位置，依次對粗皮桉小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程進(jìn)行連續(xù)觀察和統(tǒng)計。結(jié)果表明(附表S1)，粗皮桉小孢子母細(xì)胞自進(jìn)入減數(shù)分裂細(xì)線期至發(fā)育為小孢子共歷時240 h。在0 h采樣樣本中，可以首次觀察到有少量花蕾小孢子母細(xì)胞開始進(jìn)入減數(shù)分裂細(xì)線期(圖2-a)；隨后在24～72 h采樣樣本中，可以觀察到花蕾小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂終變期及以前各個分裂相，其中以前期Ⅰ為主，此階段染色體逐漸收縮變粗并最終聚縮成點狀或條狀(圖2-b，c,d)；在96 h采樣樣本中開始觀察到中期Ⅰ至末期Ⅰ等分裂相，此階段特點是胞內(nèi)染色體開始從赤道板移向兩極并逐漸解螺旋(圖2-e,f,g)；此后，在144 h采樣樣本中小孢子母細(xì)胞處于第二次減數(shù)分裂期的占比逐漸增多，此時可觀察到平行或T形排列在赤道板附近的兩組染色體逐漸移至四極，核膜、核仁重新出現(xiàn)(圖2-h)；采樣至168 h時，小孢子母細(xì)胞發(fā)育至四分體和小孢子的花蕾已占多數(shù)，此時可清楚觀察到含4個子細(xì)胞的四分體細(xì)胞，以及游離出的正四面體形小孢子，在顯微鏡下投影平面為三角形(圖2-k,l)；至240 h采樣點，花蕾內(nèi)僅能觀察到小孢子。

同一時間點采集的若干花蕾樣本所處的減數(shù)分裂時期存在差異，具體表現(xiàn)為同一花枝上不同著生位置花蕾的減數(shù)分裂進(jìn)程不同步，處于形態(tài)學(xué)上端位置的花蕾減數(shù)分裂進(jìn)程通常領(lǐng)先于形態(tài)學(xué)下端位置的花蕾(附表S1)。統(tǒng)計結(jié)果同時表明，D、E、F位置花蕾減數(shù)分裂進(jìn)程相對一致。如在96 h采樣點，靠近花枝頂端在D、E、F位著生的花蕾小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時期主要集中于雙線期至終變期；而此時著生于A、B、C位置的花蕾小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂則較不同步，分別處于小孢子母細(xì)胞、細(xì)線期至粗線期、雙線期至終變期等(附表S1)。這表明靠近花枝頂端D、E、F位置著生的花蕾，小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程通常領(lǐng)先并且同步性較好。

注：a:細(xì)線期；b:粗線期；c:雙線期；d:終變期；e:中期Ⅰ；f:后期Ⅰ；g:末期Ⅰ；h:中期Ⅱ；i.后期Ⅱ；j.末期Ⅱ；k.四分體；l.小孢子。Note:a:Leptotene.b:Pachytene.c:Diplotene.d:Diakinesis.e:Metaphase Ⅰ.f:Anaphase Ⅰ.g:Telophase Ⅰ.h:Metaphase Ⅱ.i:Anaphase Ⅱ.j:Telophase Ⅱ.k:Tetrad.l:Microspore.圖2 粗皮桉小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程(標(biāo)尺=10 μm)Fig.2 Microsporogenesis in Eucalyptus pellita (Scale bar=10 μm)

2.3 粗皮桉不同位置花蕾直徑大小發(fā)育規(guī)律

各采樣時間點全部花蕾樣本的直徑測定結(jié)果表明(表2)，候選花枝上花蕾的直徑隨著花蕾發(fā)育時長增加而增大，并且花枝上不同著生位置花蕾的直徑大小改變有所不同。自0 h采樣開始至240 h采樣結(jié)束，A位置花蕾平均直徑增加最少，為0.28 mm，E、F位置花蕾平均直徑增加均超過0.40 mm。同一時間點，花枝上不同著生位置花蕾的直徑大小亦有所不同，方差分析結(jié)果顯示，除0 h采樣時間點外，其他采樣時間點不同著生位置花蕾直徑大小存在顯著差異，處于形態(tài)學(xué)上端的花蕾平均直徑大于形態(tài)學(xué)下端的花蕾，240 h采樣點時，F(xiàn)位置比A位置花蕾平均直徑大0.89 mm。多重比較結(jié)果顯示，靠近花枝頂端的C至F位置著生的花蕾間直徑無顯著差異，但多與A、B位置著生花蕾直徑大小存在顯著差異。該結(jié)果從花蕾直徑發(fā)育方面再次驗證了位于花枝頂端位置著生的花蕾發(fā)育更加領(lǐng)先且一致性相對較高。

表2 花枝不同位置各采樣時間花蕾直徑發(fā)育Table 2 Flower buds diameter development at different positions at each sampling time /mm

2.4 秋水仙堿溶液處理誘導(dǎo)粗皮桉未減數(shù)2n花粉

根據(jù)開展誘變處理時間點和處理時長的不同，各目標(biāo)花枝被分為若干處理組別，累計誘導(dǎo)處理花蕾2 758個。各處理組花蕾于散粉期進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察用于確定誘變處理效果，結(jié)果顯示，一些處理組別的花蕾內(nèi)小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂發(fā)生改變，可在顯微鏡下觀察到二分體以及大花粉出現(xiàn)(圖3)，證實了秋水仙堿誘導(dǎo)未減數(shù)2n花粉的有效性；對照組花蕾中未發(fā)現(xiàn)二分體或大花粉，僅可見含有4個子細(xì)胞的正常四分體細(xì)胞。處理組觀察到的二分體僅含2個子細(xì)胞，每個子細(xì)胞相較四分體子細(xì)胞更大，直徑差異顯著(t=17.77，P<0.01)。對照組小孢子為正四面體型，顯微鏡下投影平面呈三角形，可見明顯萌發(fā)孔，平均直徑為19.10 μm；而秋水仙堿處理后誘導(dǎo)獲得的未減數(shù)2n花粉為球形，顯微鏡下投影平面為圓形，萌發(fā)孔不再清晰可辨，平均直徑為24.71 μm，顯著高于對照組普通單倍性花粉(t=19.49，P<0.01)。

自目標(biāo)花枝上首次觀察到有花蕾進(jìn)入小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂細(xì)線期為起始，至240 h后減數(shù)分裂基本完成，期間以24 h為間隔劃分為10個處理時間點，每個處理時間點分別設(shè)置3和6 h兩種處理時長。各處理時間點和不同時長誘變處理的結(jié)果統(tǒng)計表明(表3)，經(jīng)秋水仙堿處理后，各處理組花蕾數(shù)量均減少；未減數(shù)2n花粉的有效誘導(dǎo)率，受到處理時間點和處理時長的共同影響。在0和168 h及之后的時間點進(jìn)行秋水仙堿處理均未獲得2n花粉；而24～144 h進(jìn)行秋水仙堿溶液處理，未減數(shù)2n花粉的有效誘導(dǎo)率先上升后下降，其中48 h時間點進(jìn)行6 h處理時長的處理組未減數(shù)2n花粉有效誘導(dǎo)率最高，達(dá)到31.34%；成功誘導(dǎo)獲得未減數(shù)2n花粉的處理組中，同一處理時間點，處理6 h的有效誘導(dǎo)率顯著高于處理3 h(t=2.62，P<0.05)。

注：a:正常四分體；b:二分體；c:正?；ǚ郏籨:2n大花粉。Note:a:Normal tetrad.b:Dyad.c:Normal pollen.d:2n pollen.圖3 粗皮桉小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程(標(biāo)尺=10 μm)Fig.3 Microsporogenesis in Eucalyptus pellita (Scale bar=10 μm)

2.5 誘導(dǎo)粗皮桉2n花粉的最佳處理時機(jī)

實施秋水仙堿處理的同時，采集部分候選花枝靠近頂端著生的與處理組發(fā)育狀態(tài)相同的若干花蕾，用于明確該處理試驗點處理組花蕾所處的準(zhǔn)確減數(shù)分裂時期，以探究誘導(dǎo)粗皮桉未減數(shù)2n花粉的最佳處理時機(jī)。統(tǒng)計結(jié)果顯示(表4)，盡管采樣觀察對象為候選花枝頂端發(fā)育較為一致的花蕾，但各處理時間點除占比最高的主要減數(shù)分裂時期外，也存在多個相鄰的減數(shù)分裂時期；隨時間推移，不同處理時間點的花蕾小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂發(fā)生時期比例不斷變化。如在48 h處理時間點，以小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂處于細(xì)線期至粗線期的花蕾為主，占比達(dá)到61.00%，遠(yuǎn)高于其他時期的花蕾數(shù)量。

基于每個處理時間點采集的樣本花蕾所處減數(shù)分裂時期(表4)，以及各處理組未減數(shù)2n花粉有效誘導(dǎo)率(表3)，采用皮爾森相關(guān)分析確定秋水仙堿處理誘導(dǎo)未減數(shù)2n花粉產(chǎn)生的最佳處理時機(jī)。結(jié)果顯示(圖4)，目標(biāo)花枝上小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂處于細(xì)線期至粗線期的粗皮桉花蕾占比，與未減數(shù)2n花粉有效誘導(dǎo)率之間呈顯著正相關(guān)(r=0.937，P<0.01)；各處理組中，未減數(shù)2n花粉的有效誘導(dǎo)率隨著處理對象中處于小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂細(xì)線期至粗線期的花蕾占比的增加而提高，在48 h處理時間點時，細(xì)線期至粗線期花蕾占比達(dá)到61.00%，此時2n花粉的有效誘導(dǎo)率最高，達(dá)到31.34%。這表明花蕾內(nèi)小孢子母細(xì)胞發(fā)育至減數(shù)分裂細(xì)線期至粗線期時，是開展秋水仙堿處理誘導(dǎo)粗皮桉未減數(shù)2n花粉的最佳處理時機(jī)。

表3 秋水仙堿溶液處理誘導(dǎo)粗皮桉花粉染色體加倍的有效誘導(dǎo)率Table 3 Effective induction rate of pollen chromosome doubling treated with colchicine solution in Eucalyptus pellita

表4 粗皮桉花蕾發(fā)育時間與小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時期對應(yīng)關(guān)系Table 4 Relationship between development time and meiosis period of microsporocytes in Eucalyptus pellita

注：縱坐標(biāo)為0.5%秋水仙堿溶液處理6 h后2n花粉有效誘導(dǎo)率，橫坐標(biāo)為對應(yīng)時間小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時期花蕾比例。Note:The ordinate is the effective induction rate of 2n pollens after 6 h treatment with 0.5% colchicine solution,and the abscissa is the proportion of flower buds in meiosis stages of microsporocytes at corresponding time.圖4 2n花粉有效誘導(dǎo)率與小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時期相關(guān)關(guān)系Fig.4 Correlation between effective pollen induction rate and meiosis stage of microsporocytes

3 討論

研究小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂特征與進(jìn)程是開展人工誘導(dǎo)未減數(shù)2n花粉的先決條件，原因在于物理或化學(xué)方法誘變產(chǎn)生2n花粉的原理，是在植物細(xì)胞減數(shù)分裂的特定敏感時期施加特定的誘變方法阻滯染色體的分離[28]。本研究中，粗皮桉花蕾內(nèi)存在長花絲和短花絲兩種雄蕊類型，兩者間小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程存在明顯差異，這種小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的不同步性問題在多個樹種中均有報道[32]。在桉樹上，Davis[33]最早報道了密味桉(EucalyptusmelliodoraA.Cunn.)花蕾內(nèi)部存在兩種不同長度的雄蕊，即長花絲雄蕊和短花絲雄蕊。Yang等[31,34]曾分別對兩種雜交桉花蕾發(fā)育進(jìn)行觀察研究，認(rèn)為其花蕾內(nèi)長花絲雄蕊小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程領(lǐng)先于短花絲雄蕊，與本研究的發(fā)現(xiàn)一致。這種小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂不同步的現(xiàn)象，被認(rèn)為是植物適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果[35]，但也給染色體誘變育種工作中配子細(xì)胞減數(shù)分裂時期判別造成了影響。針對這種情況，本研究統(tǒng)一選擇以花蕾內(nèi)發(fā)育進(jìn)度較為領(lǐng)先的長花絲雄蕊小孢子母細(xì)胞所處的減數(shù)分裂時期，判定為此刻該花蕾減數(shù)分裂的具體時期。

對花蕾發(fā)育研究發(fā)現(xiàn)，同一粗皮桉花枝不同著生位置的花蕾發(fā)育同樣存在不同步性。這種花發(fā)育的不同步性并不罕見，在楊樹[12]、杜仲[36]、橡膠[37]等樹種的花粉發(fā)育研究中均有報道。在桉樹上，有研究發(fā)現(xiàn)尾細(xì)桉雜種(Eucalyptusurophylla×E.tereticornis)位于花枝基部花蕾的直徑發(fā)育和減數(shù)分裂進(jìn)程均領(lǐng)先于枝條上部的花蕾，而尾巨桉雜種(Eucalyptusurophylla×E.grandis)則相反[31,34]。本研究中粗皮桉的花蕾發(fā)育模式與尾巨桉類似?；ɡ侔l(fā)育的不同步性可能與花芽分化早晚及花蕾發(fā)育的成熟度有關(guān)。這種現(xiàn)象可以延長散粉期，對于桉樹后代繁殖具有重要意義[35,38]，但同樣給本研究中根據(jù)花蕾發(fā)育進(jìn)程確定誘變對象造成了影響。本研究發(fā)現(xiàn)盡管總體上粗皮桉花枝不同位置著生花蕾的發(fā)育存在差異，但可以利用花枝上靠近頂端著生的D、E、F位置花蕾直徑發(fā)育與減數(shù)分裂進(jìn)程相對一致的特性，針對性地剔除難以辨別發(fā)育進(jìn)程的花蕾，從而保留一致性較高、可以準(zhǔn)確判定發(fā)育狀態(tài)的目標(biāo)花蕾，甄選誘變處理的對象。

基于以上結(jié)論，選擇不同處理時間點開展秋水仙堿誘變處理，并在一些組中成功獲得了粗皮桉未減數(shù)2n花粉。與單倍性花粉相比，誘導(dǎo)獲得的2n花粉呈球形，直徑較單倍性花粉顯著增大。原因在于花粉的大小通常與其倍性水平總體呈正相關(guān)關(guān)系[39-42]。此外，已有研究證實桉樹小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂僅發(fā)生一次胞質(zhì)分裂，完成后產(chǎn)生四分體[31,34]。本研究在成功誘導(dǎo)獲得2n花粉的處理組中，觀察到大量二分體，表明秋水仙堿成功阻滯了細(xì)胞染色體的遷移。粗皮桉減數(shù)分裂后二分體的出現(xiàn)，以及形態(tài)、大小顯著改變的2n大花粉的出現(xiàn)，是通過細(xì)胞學(xué)觀察驗證花粉染色體加倍結(jié)果的重要依據(jù)。

秋水仙堿處理誘導(dǎo)未減數(shù)2n配子，關(guān)鍵在于誘變時機(jī)和誘變強(qiáng)度的選擇[26,28]。本研究發(fā)現(xiàn)對花蕾施加秋水仙堿處理的時機(jī)和時長不同，都會影響2n花粉的有效誘導(dǎo)率。在處理時機(jī)的選擇上，本研究發(fā)現(xiàn)，在觀察到小孢子母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂48 h后，即處于細(xì)線期至粗線期的花蕾占比最高時，施加誘變處理的有效誘導(dǎo)率最高，達(dá)到31.34%。這表明粗皮桉小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂細(xì)線期至粗線期是開展秋水仙堿溶液處理誘導(dǎo)未減數(shù)2n花粉的最佳處理時機(jī)。處理時機(jī)的選擇與楊樹[28，43]、杜仲[37]等樹種的相關(guān)研究結(jié)果一致。但粗皮桉的2n花粉有效誘導(dǎo)率明顯低于杜仲和楊樹(約為49.5%～80.0%)。其原因在于桉樹花蕾發(fā)育的一致性明顯低于杜仲和楊樹，使得一組有效的誘變處理無法確保目標(biāo)花蕾內(nèi)所有小孢子母細(xì)胞全部處于最佳處理時期。這種減數(shù)分裂高度不同步的特性是制約桉樹配子染色體加倍誘導(dǎo)效率的關(guān)鍵。

除合適的處理時機(jī)外，不同的處理時長也會影響誘變處理的效果。本研究中，3和6 h時長的處理組均可獲得未減數(shù)2n花粉，6 h處理組的有效誘導(dǎo)率更高。原因在于目標(biāo)花蕾內(nèi)小孢子母細(xì)胞的減數(shù)分裂進(jìn)程是不同步的，并在誘變處理的同時持續(xù)進(jìn)行，誘變處理時間的延長，可使一次誘變處理覆蓋更多目標(biāo)時期，從而提高有效誘導(dǎo)率。楊樹采用多次注射秋水仙堿的方法延長處理時長以提高有效誘導(dǎo)率[25]。但多次注射的方法可能對花蕾造成更多的機(jī)械損傷，從而影響花粉產(chǎn)量[28]。本研究采用花枝一次性切口引入秋水仙堿的處理方式，可在增加處理時長的同時有效避免對花蕾造成機(jī)械傷害，有助于獲得更多的誘變花粉。此外也要注意，秋水仙堿對植物細(xì)胞有一定毒害作用，處理時長應(yīng)控制在一定范圍內(nèi)以降低對花蕾的傷害[44]。

4 結(jié)論

人工誘導(dǎo)未減數(shù)2n花粉是創(chuàng)制植物多倍體新品種的重要途徑之一。本研究揭示了粗皮桉花蕾發(fā)育與小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的時序性關(guān)系，建立了基于花蕾著生位置和發(fā)育時數(shù)，即時判別粗皮桉小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時期的方法。即以花蕾內(nèi)長花絲雄蕊小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)入細(xì)線期開始，根據(jù)花蕾發(fā)育時長與小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時序關(guān)系判斷花蕾所處的具體減數(shù)分裂時期。同時，本研究明確了采用秋水仙堿溶液處理誘導(dǎo)粗皮桉花粉染色體加倍的最佳時機(jī)和最佳處理強(qiáng)度。待觀察到小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂開始后48 h，即多數(shù)花蕾處于細(xì)線期至粗線期時，在靠近花序位置的花枝上切口并導(dǎo)入0.5%濃度秋水仙堿溶液，處理花蕾6 h效果最佳。本研究結(jié)果為進(jìn)一步開展桉樹多倍體種質(zhì)創(chuàng)新工作提供了理論論據(jù)。

附表S1 各采樣時間點處于小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂不同時期的花蕾占比Table S1 The proportion of buds in different meiosis stages of microsporocytes at different sampling time point

續(xù)附表

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