吳袁袁 馮俊麗,2,*

(1 浙江工商大學海洋食品研究院，浙江 杭州 310012；2 浙江省水產(chǎn)品加工技術研究聯(lián)合重點實驗室，浙江 杭州 310012)

微囊藻毒素(microcystins，MCs)是由銅綠微囊藻、念珠藻、魚腥藻等產(chǎn)生的一類單環(huán)七肽結(jié)構(gòu)的天然毒素，常存在于藍藻水華污染嚴重、富營養(yǎng)化的水體中[1-3]。目前發(fā)現(xiàn)MCs存在90多種異構(gòu)體，其中微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)是水體環(huán)境中最常見、毒性最強、危害最大的一類肝毒素，其化學性質(zhì)穩(wěn)定、耐強酸強堿，在高溫300℃條件下仍能長時間保持不被分解[1-3]。MC-LR毒性主要作用于肝臟細胞，可專一抑制蛋白磷酸酶的活性，使得肝細胞發(fā)生形變壞死，從而造成肝臟出血，肝功能喪失[2]。腎臟是MC-LR另一個重要的靶器官[4]。有研究表明連續(xù)8周向大鼠腹腔注射MC-LR，大鼠腎小球出現(xiàn)病理性變化，如塌陷、基底膜增厚等，腎損傷現(xiàn)象明顯[4-6]。同時MC-LR還具有強促癌活性，飲水中的MC-LR被認為是導致原發(fā)性肝癌的一個重要因素[7]。MC-LR除了可通過飲水途徑攝入體內(nèi)，還可在水生生物體內(nèi)富集，從而通過食物鏈富集到人體內(nèi)[8-10]。因此，世界衛(wèi)生組織及我國飲用水標準[11]均規(guī)定MC-LR的含量不得超過1 μg·L-1。

MCs影響環(huán)境生態(tài)的同時也嚴重威脅著人類健康，越來越受到國內(nèi)外學者的廣泛關注，如何快速檢測和高效環(huán)保降解MC-LR成為當下的研究熱點[12-14]。國內(nèi)外檢測MC-LR的方法主要有生物化學測定法、儀器分析法和免疫分析法以及新興的傳感器分析法[15-17]。早期使用的生物化學測定法主要有蛋白磷酸酶抑制法和細胞毒性法，前者酶活性易受到干擾物質(zhì)的影響，因此常用作定性檢測；后者只能檢測出毒理作用相似的毒素總量[15]。儀器分析法是目前運用最廣泛的方法，較常用的有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)、氣相色譜和質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)聯(lián)用等[18]。王剛等[19]采用超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水體中的MC-LR，其檢出限最低為0.05 μg·L-1，精確度高、靈敏性強、重現(xiàn)性好，但存在儀器昂貴、操作復雜、技術要求高等問題[2,20]。免疫分析法具有靈敏度高、檢測速度快、高通量等優(yōu)點，但是所用試劑價格昂貴，容易出現(xiàn)假陽性[21]。因此，亟需建立一個快速、靈敏、可視化的現(xiàn)場檢測方法[22-24]。

相較于傳統(tǒng)的檢測方法，適配體傳感器檢測更加高效、方便和靈敏。適配體是體外篩選得到的一段寡核苷酸片段，可作為一種新型的識別元件與靶標以高親和力特異性結(jié)合，具有穩(wěn)定、易修飾、易于合成等優(yōu)點[25-27]。適配體傳感器可結(jié)合電化學、熒光和比色等傳感技術構(gòu)建出不同類型的傳感器[28]。其中，電化學適配體傳感器的應用最為廣泛，檢測效率高，檢出限低，但大多數(shù)采用金電極，成本高[29-30]。熒光傳感器檢測MC-LR具有一定的優(yōu)勢，但是操作相對繁瑣、熒光染料穩(wěn)定性不高[31]。

金納米粒子由于其良好的光學性質(zhì)和生物相容性,常作為比色法傳感器中信號傳導的理想材料。與其他檢測方法相比，基于適配體和納米金所構(gòu)建的比色傳感器檢測技術較為簡單，具有成本低、靈敏度高、檢測結(jié)果可視化等優(yōu)點[32]，已被廣泛應用于致病菌、農(nóng)獸藥殘留、腫瘤標志物等小分子的檢測[33-34]。但目前對適配體和靶標分子的結(jié)合作用機制還不明確，在一定程度上限制了適配體生物傳感器的進一步發(fā)展。本研究首先基于已報道的MC-LR原始適配體Apt-1序列，建立MC-LR適配體-納米金檢測體系。其次，通過對Apt-1進行定點突變得到二級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變的Apt-3，分析比較Apt-1和Apt-3對MC-LR的親和力差異，以期為進一步探究適配體的二級結(jié)構(gòu)和靶分子結(jié)合的關系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MC-LR適配體-1(MC-LR Apt-1)共60個堿基，引用自文獻[35]，序列為：5′-GGCGCCAAACAGGACCACCATGACAATTACCCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC-3′(上海生工生物合成)，MC-LR適配體-3(MC-LRApt-3)共60個堿基，為本研究設計突變適配體，序列為：5′-GGGGCCAAACAGGACCACCATGACAATTACCCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC-3′(上海生工生物合成)，雙蒸餾水溶解，4℃冰箱保存；微囊藻毒素-LR由浙江工商大學海洋食品研究院提供，-20℃冰箱冷凍保存；氯化鈉、四氯金酸、檸檬酸三鈉均為分析純，購自上海凌峰化學試劑有限公司；四螨嗪標準品、阿特拉津標準品、草甘膦標準品，購自阿拉丁試劑(上海)有限公司。

1.2 主要儀器與設備

MRIEX-5型漩渦振蕩器，江蘇海門其林貝兒儀器制造有限公司；EVOLUTION 60S 型紫外可見分光光度計，美國Thermo Fisher Scientific公司；

1.3 序列優(yōu)化

對MC-LR適配體-1(Apt-1)進行定點突變，將5′端開始的第3位胞嘧啶替換成鳥嘌呤，命名為適配體-3(Apt-3)。利用Mfold軟件，在鹽濃度為1 mol·L-1條件下，擬合分析Apt-1和Apt-3的結(jié)構(gòu)，得到2個結(jié)構(gòu)完全不同的適配體。圖1-A為Apt-1的二級結(jié)構(gòu)，圖1-B為Apt-3的二級結(jié)構(gòu)，并比較二者吉布斯自由能(ΔG)。

圖1 MC-LR適配體-1(A)和MC-LR適配體-3(B)的二級結(jié)構(gòu)Fig.1 Secondary structure of MC-LR Apt-1(A)and MC-LR Apt-3(B)

1.4 納米金的制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備納米金[36]。制備中所需燒杯等器皿置于王酸[HNO3∶HCl=1∶3(v∶v)]中浸泡24 h，用超純水洗凈，烘箱烘干待用。量取100 mL 0.01%(w∶v)的氯金酸于燒杯中，在磁力攪拌條件下加熱煮沸，沸騰后立即加入3.5 mL 1%檸檬酸三鈉水溶液。待溶液變酒紅色后繼續(xù)加熱煮沸15 min，直至溶液呈紅色、澄清透明狀。加熱停止，以500 r·min-1的轉(zhuǎn)速繼續(xù)攪拌15 min，待冷卻至室溫后，過0.2 μm 聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)濾膜，于4℃保存。制得的納米金溶液利用紫外可見分光光度計在400～750 nm波長范圍內(nèi)全掃描。

1.5 納米金比色法檢測MC-LR原理

檢測原理如圖2，納米金顆粒表面帶有大量磷酸根離子，呈負電。當沒有電介質(zhì)存在時，離子間的靜電斥力使得粒子處于穩(wěn)定狀態(tài)，分散均一，裸AuNPs溶液呈現(xiàn)酒紅色。當加入鹽溶液后，Na+離子能夠中和AuNPs表面的電子，靜電引力使得粒子聚集，溶液由紅色變?yōu)樗{色，吸收峰右移[26]。當適配體以一定的濃度加入到溶液中時，可憑借范德華靜電作用等分子間作用力吸附在AuNPs表面保護AuNPs免受鹽誘導，AuNPs溶液依然保持分散、穩(wěn)定的狀態(tài)。當在受適配體保護的納米金溶液中存在靶標分子MC-LR時，適配體會與MC-LR特異性結(jié)合形成具有規(guī)則三維結(jié)構(gòu)的復合物，此時納米金顆粒失去保護，在鹽誘導下呈聚集態(tài)，溶液顏色逐漸變?yōu)樽纤{色，在一定范圍內(nèi)顏色變化與MC-LR的濃度具有比例關系[37]。因此通過肉眼觀察顏色變化便可初步判斷MC-LR的濃度[32]。

圖2 納米金比色法檢測MC-LR的原理圖Fig.2 The principle of MC-LR detection by nanogold colorimetric method

1.6 條件優(yōu)化

最適鹽濃度的確定。反應體系為200 μL，移取190 μL恢復至室溫的納米金溶液于試管中，分別加入10 μL不同濃度的氯化鈉溶液，使得其混合液中鹽的終濃度分別為0.00、0.02、0.04、0.045、0.05、0.06、0.08 μmol·L-1，混合均勻，靜置反應2 min，觀察溶液顏色變化，在400～800 nm波長下進行全掃描，每個濃度設置3組平行。

最佳適配體濃度的確定。孵育體系為120 μL，在含有117.6 μL中的納米金中加2.4 μL不同濃度的Apt-1溶液，使得Apt-1體系終濃度分別為0.00、0.03、0.05、0.08、0.12、0.15 μmol·L-1，混合均勻，常溫下避光孵育24 h。孵育后分別加入2 mol·L-1的NaCl溶液，搖勻靜置反應2 min后，觀察顏色變化，在400～800 nm波長下進行全掃描，重復3次。

與上述Apt-1孵育體系相同，在117.6 μL的納米金溶液加入2.4 μL不同濃度的Apt-3溶液，使得Apt-3體系終濃度分別為0.00、0.03、0.06、0.09、0.12、0.15 μmol·L-1，混勻，常溫下避光孵育24 h，孵育后分別加入2 mol·L-1的NaCl溶液，搖勻靜置反應2 min，觀察溶液顏色變化，于400～800 nm波長下進行全掃描，設置3組平行。

1.7 MC-LR的檢測

Apt-1：按照1.6所確定的最優(yōu)反應條件和體系，加入MC-LR溶液，使MC-LR的體系終濃度分別為0、40、70、100、120、150 ng·mL-1，充分混勻，避光反應15 min后，加入NaCl溶液，靜置2 min，觀察顏色變化，在400～800 nm波長下進行全掃描，空白組以相同體積的超純水替代Apt-1，設定3組平行。

Apt-3：同理，按照1.6所確定的最優(yōu)反應條件和體系，加入MC-LR溶液，使MC-LR的體系終濃度分別為0、10、30、50、70、100、120 ng·mL-1，充分混勻，避光反應15 min后，加入NaCl溶液，靜置2 min，觀察顏色變化，在400～800 nm波長下進行全掃描，空白組以相同體積的超純水替代Apt-3，設定3組平行。

1.8 納米金(AuNPs)比色法的特異性

將Apt-1和Apt-3，以1.6所確定的最優(yōu)反應條件和體系，分別加入等量的MC-LR溶液、四螨嗪標準品、阿特拉津標準品以及草甘膦標準品，各毒素的反應終濃度為100 ng·mL-1，避光孵育15 min后，加入NaCl溶液，靜置2 min，觀察顏色變化，在400～800 nm波長下進行全掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 AuNPs的特性

AuNPs在510～550 nm的可見光光譜范圍內(nèi)具有單一吸收峰，其溶液顏色也隨粒徑大小的不同而不同[38]。由圖3可知，檸檬酸鈉還原法制得的AuNPs溶液在520 nm處有1個特征吸收峰?；?20 nm處的吸光度值和消光系數(shù)2.70×108L·mol-1·cm-1，求得AuNPs的濃度為3.50 nmol·L-1。

圖3 納米金的紫外吸收光譜圖Fig.3 UV absorption spectrum of the AuNPs

2.2 最適鹽濃度

由圖4-A可知，隨著體系鹽濃度的增大，520 nm處的吸收峰逐漸下降，發(fā)生紅移。由圖4-B可知，當體系的鹽濃度低于0.04 mol·L-1時，溶液保持紅色不變；0.045 mol·L-1時顏色發(fā)生變化，由紅色開始轉(zhuǎn)紫色；且當鹽濃度為0.05 mol·L-1時，溶液為藍色，濃度繼續(xù)增大，藍色加深不明顯，吸收峰變化差異不大，表明體系中的AuNPs已經(jīng)完全聚集。由于鹽濃度過高會干擾體系的檢測，使其靈敏度下降，因此選擇最適鹽濃度為0.05 mol·L-1。該結(jié)果與陳思銳等[39]對體系中鹽濃度優(yōu)化的結(jié)果相同。

注：氯化鈉濃度：1：0.00 mol·L-1；2：0.02 mol·L-1；3：0.04 mol·L-1；4：0.045 mol·L-1；5：0.05 mol·L-1；6：0.06 mol·L-1；7：0.08 mol·L-1。Note：Sodium chloride concentration.1:0.00 mol·L-1.2:0.02 mol·L-1.3:0.04 mol·L-1.4:0.045 mol·L-1.5:0.05 mol·L-1.6:0.06 mol·L-1.7:0.08 mol·L-1.圖4 不同氯化鈉濃度下AuNPs溶液的紫外-可見吸收光譜(A)和顏色變化(B)Fig.4 UV-vis absorption spectra (A)and visual color changes (B)of the AuNPs solutions with different Sodium Chloride concentrations

2.3 適配體濃度的優(yōu)化

圖5-A為不同濃度Apt-1孵育下的AuNPs溶液加鹽后在400～800 nm范圍的吸收光譜圖。當加入一定濃度鹽溶液后，裸AuNPs溶液變藍色(圖5-B)，且520 nm處的吸收峰下降，在700 nm左右開始出現(xiàn)新的吸收峰，說明此時金納米顆粒已發(fā)生聚集。隨著適配體濃度的升高，吸附在納米金表面的分子越多，對納米金顆粒的保護作用越強，表現(xiàn)在520 nm處的峰值逐漸增高，700 nm左右的峰值逐漸降低。當濃度為0.03 μmol·L-1和0.05 μmol·L-1時，保護作用初顯，表現(xiàn)為淡紫色和紫紅色；當適配體濃度為0.08 μmol·L-1時，顏色變?yōu)榧t色，說明適配體對AuNPs的保護充分；適配體濃度繼續(xù)加大，顏色變化不明顯，520 nm處的吸收峰差別不大，考慮到檢測的靈敏度，選擇0.08 μmol·L-1作為Apt-1的最佳孵育濃度。

注：適配體-1濃度：1:0.00 μmol·L-1；2:0.03 μmol·L-1；3:0.05 μmol·L-1；4:0.08 μmol·L-1；5:0.12 μmol·L-1；6:0.15 μmol·L-1。Note:Apt-1 concentration:1:0.00 μmol·L-1.2:0.03 μmol·L-1.3:0.05 μmol·L-1.4:0.08 μmol·L-1.5:0.12 μmol·L-1.6:0.15 μmol·L-1.圖5 不同Apt-1濃度下AuNPs溶液的紫外可見吸收光譜(A)和顏色變化(B)Fig.5 UV-vis absorption spectra (A)and visual color changes (B)of the AuNPs solutions with different Apt-1 concentrations

Apt-3的結(jié)構(gòu)與Apt-1完全不同，與納米金的結(jié)合能力也有所差異。由圖6-A可知，隨著Apt-3的濃度增大，520 nm處的吸收峰逐漸升高；顏色如圖6-B所示，當Apt-3濃度為0.00 μmol·L-1時，納米金受鹽誘導發(fā)生聚集，變?yōu)樗{色。當加入0.03 μmol·L-1的Apt-3溶液時，部分納米金發(fā)生聚集，顏色為紫色；孵育Apt-3體系濃度達到0.06 μmol·L-1時，溶液呈現(xiàn)為紅色，對AuNPs的保護作用顯著，Apt-3濃度升高，溶液顏色保持為紅色，其穩(wěn)定性也不會隨著濃度的增大而變化[36]。確定最終的Apt-3孵育濃度為0.06 μmol·L-1。

注：適配體-3濃度：1:0.00 μmol·L-1；2:0.03 μmol·L-1；3:0.06 μmol·L-1；4:0.09 μmol·L-1；5:0.12 μmol·L-1；6:0.15 μmol·L-1。Note:Apt-3 concentration:1:0.00 μmol·L-1.2:0.03 μmol·L-1.3:0.06 μmol·L-1.4:0.09 μmol·L-1.5:0.12 μmol·L-1.6:0.15 μmol·L-1.圖6 不同Apt-3濃度下AuNPs溶液的紫外-可見吸收光譜(A)和顏色變化(B)Fig.6 UV-vis absorption spectra (A)and visual color changes (B)of the AuNPs solutions with different Apt-3 concentrations

2.4 Apt-AuNPs比色法檢測MC-LR

由圖7可知，裸AuNPs在加入鹽溶液后發(fā)生聚集，變成灰藍色。隨著MC-LR的濃度升高，適配體優(yōu)先與MC-LR特異性結(jié)合形成特殊構(gòu)象，AuNPs逐漸失去外層的保護作用，在高鹽濃度下，越來越多的AuNPs發(fā)生聚集變色，藍色加深。當體系的MC-LR濃度為0 ng·mL-1時，反應液為紫紅色，當體系的MC-LR濃度達到70 ng·mL-1時，反應液呈現(xiàn)灰紫色，并且隨著MC-LR濃度的升高顏色逐漸加深(圖7-A)。當體系中MC-LR達到30 ng·mL-1時，反應液呈現(xiàn)灰紫色，隨著MC-LR濃度的增大，顏色加深為灰藍色(圖7-B)。

注：微囊藻毒素-LR濃度：A1：裸納米金；A2：0 ng·mL-1(未加鹽)；A3：0 ng·mL-1；A4：40 ng·mL-1；A5：70 ng·mL-1；A6：100 ng·mL-1；A7：120 ng·mL-1；A8：150 ng·mL-1。B1：裸納米金；B2：0 ng·mL-1(未加鹽)；B3：0 ng·mL-1；B4：10 ng·mL-1；B5：30 ng·mL-1；B6：50 ng·mL-1；B7：70 ng·mL-1；B8：100 ng·mL-1；B9:120 ng·mL-1。Note：MC-LR concentration.A1:Pure AuNPs.A2:0 ng·mL-1(no Sodium Chloride).A3:0 ng·mL-1.A4:40 ng·mL-1.A5:70 ng·mL-1.A6:100 ng·mL-1.A7:120 ng·mL-1.A8:150 ng·mL-1.B1:pure AuNPs.B2:0 ng·mL-1(no sodium chloride).B3:0 ng·mL-1.B4:10 ng·mL-1.B5:30 ng·mL-1.B6:50 ng·mL-1.B7:70 ng·mL-1.B8:100 ng·mL-1.B9:120 ng·mL-1.圖7 對不同濃度微囊藻毒素-LR檢測下(Apt-1)-AuNPs(A)和(Apt-3)-AuNPs(B)反應液顏色變化Fig.7 Visual color changes of the (Apt-1)-AuNPs(A)and (Apt-3)-AuNPs(B)solutions for detection of MC-LR with different concentrations

2.5 納米金定量檢測MC-LR

由圖8可知，隨著MC-LR的濃度加大，520 nm的吸收峰逐漸降低，最大吸收峰由520 nm右移至700 nm左右處。由圖9可知，當MC-LR濃度范圍為0～120 ng·mL-1時，(Apt-3)-AuNPs體系檢測MC-LR的A673/A520比值與MC-LR的濃度呈線性關系，其線性回歸方程為y=0.007x+0.564(R2=0.988 5)，線性關系良好，根據(jù)LOD=3×SD/K(SD為空白標準偏差，K為標準曲線斜率)，求得其理論最低檢測限為7.08 ng·mL-1。

圖8 不同濃度的微囊藻毒素-LR溶液下(Apt-3)-AuNPs溶液的紫外-可見吸收光譜Fig.8 UV-vis absorption spectra of the (Apt-3)-AuNPs solution with different MC-LR concentrations

圖9 微囊藻毒素-LR濃度與 (Apt-3)-AuNPs溶液A673/A520的關系Fig.9 Correlation between MC-LR concentration and A673/A520of (Apt-3)-AuNPs solution

2.6 AuNPs比色法檢測MC-LR的特異性

為了分析基于Apt-1和Apt-3所建立的AuNPs比色法的特異性，選取了3種可能與MC-LR共存于污染水體的干擾物質(zhì)：四螨嗪、阿特拉津以及草甘膦。由圖10-A、B可知，在最優(yōu)反應條件下，當MC-LR和其他干擾物均為100 ng·mL-1時，(Apt-1)-AuNPs和(Apt-3)-AuNPs兩個檢測體系僅在MC-LR存在時出現(xiàn)明顯的凝集反應，吸收峰發(fā)生明顯的紅移。而四螨嗪、阿特拉津以及草甘膦由于無法使適配體從AuNPs上脫離，加入鹽溶液后仍然表現(xiàn)為紅色，并且反應混合液在520 nm處出現(xiàn)了特征峰，說明基于Apt-1和Apt-3所建立的AuNPs檢測方法特異性良好。

注：A,C：Apt-3;B,D：Apt-1；1-6：Apt-AuNPs solution、裸AuNPs、MC-LR、四螨嗪、阿特拉津、草甘膦。Note:A，C:Apt-3.B,D:Apt-1.1-6:Apt-AuNPs solution,pure AuNPs,MC-LR,clofentezine,atrazine,glyphosate.圖10 AuNPs比色法的特異性評價Fig.10 Evaluation of the specificity of the AuNPs assay

3 討論

隨著篩選技術的成熟，越來越多的靶標分子的核酸適配體被篩選出來，并應用到快速檢測、傳感器開發(fā)、靶向藥物研究等方面[34]。在篩選得到原始適配體后，一般都要求對其進行截短、修飾或者堿基突變等序列優(yōu)化以滿足不同領域的需要[40-41]。核酸適配體對靶標的特異性識別是基于其自身多樣性的二級結(jié)構(gòu)諸如發(fā)夾、假結(jié)、莖、環(huán)、G-四聚體等，在遇到靶標時會發(fā)生自適應性的構(gòu)象變化，形成特殊的三維結(jié)構(gòu)，通過范德華力和氫鍵等作用達到力的平衡，形成穩(wěn)定的復合物[41-42]。陳思銳等[39]通過對Apt-1兩端分別依次剪裁2個堿基得到新適配體序列56MC-LR、52MC-LR、48MC-LR等，發(fā)現(xiàn)除了56MC-LR，其他截短的適配體活均性有所下降，推測這可能與Apt-1的5′始端唯一的環(huán)部結(jié)構(gòu)被破壞有關。

由于富含G的序列更容易形成分子間或分子內(nèi)G-四聚體等穩(wěn)定構(gòu)象[42]，因此將5′端第3個堿基C突變?yōu)镚，突變后得到的Apt-3的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變。將Apt-1和Apt-3分別與納米金溶液孵育后，(Apt-1)-AuNPs體系在MC-LR濃度為70 ng·mL-1時可觀測到顏色變化，而經(jīng)突變后的(Apt-3)-AuNPs體系在MC-LR濃度為30 ng·mL-1即可表現(xiàn)出明顯的顏色差異。這說明Apt-1、Apt-3與MC-LR具有良好的親和力，而Apt-3表現(xiàn)出更強的親和力。

結(jié)果表明，將第3位堿基C突變?yōu)镚并沒有影響適配體與靶標分子的有效結(jié)合，推測該位點并不是適配體與MC-LR作用的結(jié)合位點[34]。由于適配體結(jié)構(gòu)變化可使其與靶標結(jié)合的空間距離發(fā)生改變，從而影響對靶標的親和力。有研究認為適配體環(huán)狀部位為其主要的結(jié)合區(qū)域，由莖部結(jié)構(gòu)作為“雙臂”支撐來保持其穩(wěn)定性[43]。據(jù)此推測Apt-3親和力增加可能是由于其形成了更復雜的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，吉布斯自由能更小，穩(wěn)定性增加以及其與靶標分子的空間距離改變。

(Apt-3)-AuNPs對MC-LR的理論最低檢測限為7.08 ng·mL-1，線性檢測范圍為0～120 ng·L-1，說明檢測效果良好。Hu等[44]研究了檢測MCs的SPR免疫傳感器，線性范圍達到1～100 μg·L-1，Chen等[45]構(gòu)建的SPR免疫傳感器檢測MC-LR，檢出限為0.55 ng·mL-1，但是SPR免疫傳感器的制作成本高，難以推廣使用。本試驗所用的適配體和納米金成本低，操作簡便，靈敏度較高，優(yōu)化序列后獲得比Apt-1親和力更高的Apt-3，能在一定程度上滿足可視化的現(xiàn)場檢測需求。

適配體非必需堿基的存在可影響其與靶標的結(jié)合[40]，接下來還需要對Apt-3進行裁剪優(yōu)化，以探究與靶標MC-LR的核心結(jié)合區(qū)域，獲得親和性更高的適配體，通過進一步優(yōu)化反應時間、體系pH值、修飾適配體等途徑提高檢測體系的靈敏度，實現(xiàn)實時、快速、簡便、可視化的現(xiàn)場檢測。

4 結(jié)論

本研究通過定點突變獲得Apt-3，在(Apt-3)-AuNPs孵育體系中加入靶標MC-LR，AuNPs在高鹽濃度下可發(fā)生不同程度的聚集，出現(xiàn)顏色變化。發(fā)現(xiàn)突變后的Apt-3依然保持高特異性，與Apt-1相比，Apt-3與MC-LR的親和力更高，推測該突變位點不是靶標的活性作用位點，突變后的Apt-3擁有更復雜的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，有利于與小分子MC-LR的結(jié)合。建立的(Apt-3)-AuNPs體系實現(xiàn)了對MC-LR的定量、快速、簡便靈敏的檢測。本研究結(jié)果為后續(xù)探究靶標分子識別與結(jié)合機制，開發(fā)更高靈敏度的傳感器提供了依據(jù)。