李梓銘 泮儀晨 范小平 江建銘 王志安 王忠華,*

(1 浙江萬里學院生物技術(shù)研究所，浙江 寧波 315100；2 浙江省中藥研究所有限公司，浙江 杭州 310023)

浙貝母為百合科貝母屬多年生草本植物，其鱗莖中所含甾體類生物堿貝母甲素和貝母乙素具有非常廣泛的生物學活性[1]，可清熱潤肺、解毒散結(jié)。每年3—5月份為浙貝母鱗莖發(fā)育時期，此期間鱗莖隨時間推移迅速膨大，鱗莖大小是衡量浙貝母是否成熟的主要標志。鱗莖的品質(zhì)直接決定浙貝母的藥用功效及市場價值，所以獲取高品質(zhì)的浙貝母鱗莖是當今浙貝母產(chǎn)業(yè)的關(guān)注焦點。民間常施加鉀肥促進鱗莖發(fā)育，宋健琴[2]發(fā)現(xiàn)釋放鉀肥可有效提升浙貝母鱗莖中碳物質(zhì)的積累，從而推斷浙貝母鱗莖的發(fā)育與其他鱗莖類植物類似，伴隨著碳水化合物的積累，鱗莖逐漸膨大[3]。碳水化合物含量對鱗莖發(fā)育影響的研究屢見不鮮，尤其是可溶性糖及淀粉等。例如在百合[4]、唐菖蒲[5]、郁金香[6]、石蒜[7]、水仙[8]中發(fā)現(xiàn)，糖含量的變化影響著鱗莖的休眠及發(fā)育。植物中常見可溶性糖為果糖、葡糖糖、蔗糖，其中蔗糖是植物中糖的主要可運輸形式，其主要在光合組織的細胞質(zhì)中被合成后運輸?shù)椒枪夂献饔媒M織中[9]。高等植物中蔗糖的合成與眾多酶密切相關(guān)，其中蔗糖合成酶(sucrose synthase，SS)和蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphatesynthase，SPS)是蔗糖調(diào)節(jié)合成中的關(guān)鍵酶[10-11]。SS是一種胞質(zhì)酶，可促使蔗糖進入各種代謝途徑，催化如下可逆反應[12]：蔗糖+二磷酸尿苷(uridine diphosphate，UDP)-果糖+尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose，UDPG)。SS酶可調(diào)動蔗糖參與調(diào)節(jié)植物生長過程，為淀粉合成提供底物及能量[13]。SPS活性直接反映了植物體內(nèi)蔗糖合成的能力[14-15]，可通過降低SPS活性減少其同化物向蔗糖的分配，從而降低蔗糖合成的效率[16]。

淀粉是植物體中碳水化合物的主要儲存形式，主要儲存于塊根、塊莖、鱗莖、種子中，在鱗莖類植物發(fā)育過程中提供大量能源，夏宜平等[17]通過放射性同位素14C法和掃描電鏡探測到淀粉顆粒的數(shù)量隨郁金香鱗莖的發(fā)育快速增加，百合[18]中也有通過類似結(jié)果，在馬鈴薯種植中也有通過釋放膨大劑增加塊莖中淀粉含量進而增加產(chǎn)量的方法。由于植物生長發(fā)育周期較長，近年研究中常使用分子手段干預淀粉合成[19]。淀粉合成通路中腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase，AGP)作為限速酶，參與淀粉合成的第一步反應，顆粒結(jié)合淀粉合酶[20](granule-bound starch synthase，GBSS)參與直鏈淀粉合成，可溶性淀粉合酶[21](soluble starch synthase，SSS)和淀粉分支酶[22](starch branching enzyme，SBE)協(xié)作合成支鏈淀粉。

目前關(guān)于浙貝母蔗糖、淀粉代謝調(diào)控基因的研究較少。本研究通過克隆8條淀粉、蔗糖代謝相關(guān)基因，并對其開展不同組織及發(fā)育期基因表達量分析，推測各基因在浙貝母鱗莖淀粉、蔗糖代謝中的作用，以期為浙貝母分子調(diào)控技術(shù)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇浙貝3號的根、莖、葉、鱗莖為試驗材料，于2019年3—5月采自浙東寧波章水浙貝母基地，每隔20 d 取樣一次，共5次。樣品獲得后用無菌水進行清洗，吸水紙擦凈后放入液氮中速凍，貯存于-80℃超低溫冰箱。

1.2 發(fā)育期鱗莖性狀測量

使用游標卡尺、天平測量鱗莖的直徑、質(zhì)量。

1.3 可溶性總糖，蔗糖、淀粉含量測定

使用優(yōu)化的蒽酮[23]法測量可溶性總糖含量。使用淀粉測試盒(A148-1-1, 南京建成生物工程研究所)測量淀粉含量；使用高效液相法(high performance liquid chromatography, HPLC)測定蔗糖含量；參照劉欣等[24]的方法，色譜柱為ACQUITY UPLC BEHAmide，2.1 mm×100 mm,l.7 μm(美國沃特世公司)，流動相為75%乙腈(內(nèi)含0.2%三乙胺)，流速0.2 mL·min-1，柱溫35℃，進樣量5 μL，所用標樣為色譜純級蔗糖。

1.4 總RNA提取質(zhì)量與產(chǎn)率檢測

使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)，參考試劑盒說明方法提取總RNA。使用NanoDropTM2000微型分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)測定所提取RNA濃度以及吸光度比值(A260/280和A260/230)，取1 μL RNA溶液與 5 μL 6×RNA Loading Buffer混勻，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 引物設計及5′/3′序列克隆

選取GenBank中已注冊物種序列進行多序列比對，通過Primer軟件設計上下游克隆所需基因保守端序列,使用 Oligo軟件設計5′/3′引物并通過Clontech SMARTer RACE 5′/3′試劑盒[Code No.634858, 寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]獲取5′/3′序列，引物見表1，其中各基因5′/3′引物為該基因5′/3′端RACE引物，F(xiàn)-，R-引物為該基因保守區(qū)上下游引物。

表1 浙貝母淀粉、蔗糖代謝相關(guān)基因克隆引物Table 1 Cloning primers of ORF region of starch and sucrose metabolism-related genes of F. thunbergii

1.6 熒光引物設計

根據(jù)已克隆出的浙貝母淀粉、蔗糖代謝相關(guān)基因序列，使用Primer軟件設計熒光引物見表2，試驗所用引物均由北京擎科公司合成。

表2 浙貝母淀粉、蔗糖代謝相關(guān)基因熒光引物Table 2 Fluorescent primers for genes related to starch and sucrose metabolism in F. thunbergii

1.7 淀粉、蔗糖合成基因的克隆及序列分析

首先通過NCBI進行同源序列比對并設計保守端引物，按照RNAprep Pure Plant Kit[DP432, 天根生化科技(北京)有限公司]說明書操作提取浙貝母鱗莖中的總RNA，使用SuperRT cDNA Synthesis Kit [CW0741, 北京康為生物科技有限公司]反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以該cDNA為模板，各基因保守端上下游引物進行PCR擴增，50 μL反應體系為：2×EasyTaq PCR SuperMix[AS111, 北京全式金生物技術(shù)有限公司]25 μL、ddH2O 19 μL、cDNA模板2 μL、上下游引物各2 μL。PCR反應條件為:94℃預變性2 min，94℃變性30 s，55.2℃退火30 s，72℃延伸1 min，35 個循環(huán); 72℃延伸4 min。按照Clontech SMARTer RACE 5′/3′試劑盒，說明書分別反轉(zhuǎn)錄合成5′-RACE cDNA和3′-RACE cDNA，以各基因5′/3′引物進行PCR擴增，50 μL反應體系：Buffer 25 μL、ddH2O 15.5 μL、UPM引物5 μL、5′/3′引物1 μL、5′-RACE/3′-RACE cDNA模板2.5 μL、DNA聚合酶1 μL。PCR反應條件為：94℃變性30 s， 72℃ 延伸2 min，5 個循環(huán)；94℃變性30 s，70℃退火30 s，72℃延伸2 min，5個循環(huán)；94℃變性30 s，68℃退火30 s，72℃延伸2 min，25個循環(huán)，其中UPM通用引物序列為5′-C T A A T A C G A C T C A C T A T A G G G C A A G C A G T G G T A T C A A C G C A G-3′。使用(EasyPure? Quick Gel Extraction Kit(EG101, 北京全式金生物技術(shù)有限公司)，回收目的片段，PMD 18-T載體(Code No.6011， 寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)進行連接，將重組載體轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α[CB101, 天根生化科技(北京)有限公司]中，操作步驟均按說明書進行。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有氨芐的LB(luria-bertani)培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16 h，然后篩選陽性克隆，接種于含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)5 h，菌液交由北京北京擎科生物科技有限公司進行重組載體測序，測得的重組載體序列減去空載體序列即可得插入的目的DNA片段序列。對測序結(jié)果進行拼接并進行全長分析及生物信息學分析，通過NCBI網(wǎng)站上的BLAST進行序列同源性比較。通過DNAMAN進行氨基酸序列同源性分析，使用NCBI網(wǎng)站上的Orf Finder進行基因序列的開放閱讀框預測、ProtParam預測蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、ProtComp進行亞細胞定位預測、TMHMM進行跨膜區(qū)進行預測、SignalP-5.0進行信號肽預測并使用CDD Search 進行保守結(jié)構(gòu)域預測。

1.8 淀粉、蔗糖合成基因熒光表達量及相關(guān)性分析

以幼苗至成熟期鱗莖，盛花期根、莖、葉、鱗莖為模板，表2中上下游引物為熒光引物，使用Bio-RAD CFX96(美國伯樂公司)進行實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)，選擇β-Actin[25]為內(nèi)參基因。反應體系共20 μL：啟動酶TransStart? Tip Green qPCR SuperMix(AQ141，北京全式金生物技術(shù)有限公司)10 μL，上、下游引物以及DNA模板各0.4 μL，無菌水8.8 μL。擴增程序為：94℃預變性30 s，94℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)；qRT-PCR結(jié)果使用BIO軟件直接進行分析。

1.9 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 24.0軟件進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱗莖性狀測量

如圖1所示，浙貝母鱗莖隨時間推移逐漸增大，鱗莖從幼苗期至成熟期共需經(jīng)歷80 d，每20 d取樣一次，直徑依次為2.0、2.8、3.5、4.0、4.5 cm，質(zhì)量依次為3、10、14、21、45 g，兩項性狀指標均在80 d時達到最高。

圖1 發(fā)育期浙貝母鱗莖性狀變化Fig.1 Changes in bulb traits of F. thunbergii during development

2.2 可溶性糖、蔗糖、淀粉含量測定

可溶性總糖、蔗糖、淀粉含量如圖2所示。淀粉含量隨著鱗莖發(fā)育逐漸上升，80 d達到最高值(23.6%)，蔗糖與可溶性總糖變化趨勢相同，皆為下降-上升-下降，分別在0 d和60 d達到最大。

圖2 不同時期浙貝母鱗莖中可溶性總糖、蔗糖、淀粉含量Fig.2 The total soluble sugar, sucrose and starch content in bulbs of F. thunbergii in different periods

2.3 總RNA的提取

浙貝母總RNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3，可清晰地看到2條RNA條帶(28S和18S)其中28S條帶亮度大約是18S的2倍，說明總RNA具有較好的完整性，可用于下一步試驗。

圖3 浙貝母總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of total RNA of F. thunbergii

2.4 淀粉、蔗糖代謝相關(guān)基因序列克隆

以浙貝母鱗莖cDNA為模版，使用同源克隆和5′、3′-RACE末端克隆法對AGP1、AGP2、AGP3、GBSS、SSS、SBE、SS、SPS基因全長進行克隆，如圖4所示，AGP15′端約750 bp、保守端約1 000 bp、3′端約1 000 bp；AGP2 5′端約500 bp、保守端約900 bp、3′端約500 bp；AGP3 5′端約500 bp、保守端約1 000 bp、3′端約1 200 bp；SSS5′端約500 bp、保守端約3 000 bp、3′端約1 000 bp；GBSS5′端約750 bp、保守端約500 bp、3′端約600 bp；SBE5′端約300 bp、保守端約1 500 bp、3′端約2 000 bp；SS5′端約1 200 bp、保守端約2 000 bp、 3′端約750 bp；SPS5′端約1 500 bp、保守端約1 000 bp、 3′端約2 000 bp。

注：A為5′端；B為保守端；C為3′端；M1為Marker2000；M2為Marker2000Plus；M3為Marker5000；Ⅰ為樣品。Note: A is part 5′. B is conservative part. C is part 3′. M1 is Marker2000. M2 is Marker2000plus. M3 is Marker5000 and Ⅰ is sample.圖4 浙貝母鱗莖中淀粉、蔗糖代謝相關(guān)基因瓊脂凝膠電泳Fig.4 Agarose gel electrophoresis of genes related to starch and sucrose metabolism in bulbs of F. thunbergii

2.5 蔗糖、淀粉代謝基因全長及生物信息學分析

AGP1基因全長1 936 bp，氨基酸序列與蘭州百合(Liliumdavidii)(AJG44462.1)、龍舌蘭(Agavetequilana)(QED40916.1)、蘆筍(Asparagusofficinalis)(XP_020251522.1)、 博落回(Macleayacordata)(OVA08754.1)、白楊(Populusalba)(XP_034919752.1)、胡楊(Populuseuphratica)(XP_011028874.1)、毛果楊(Populustrichocarpa)(XP_002300758.1)以及無油樟(Amborellatrichopoda)(ERM94645.1)AGPase氨基酸全長或部分序列一致性分別達到95%、76%、80%、79%、78%、78%、78%和75%。AGP1基因包含一個完整的開放閱讀框，長度1 539 bp，編碼513個氨基酸。理論pI為7.55，屬堿性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)39.05，為穩(wěn)定蛋白；疏水性-0.135，為親水蛋白；亞細胞定位在葉綠體中，不存在跨膜區(qū)，屬于非跨膜蛋白；不存在信號肽，屬于分泌性蛋白；保守結(jié)構(gòu)域預測為cd02508，屬于cl11394(Glyco_tranf_GTA_type)超家族，該結(jié)構(gòu)域代表ADP-葡萄糖焦磷酸化酶。

AGP2基因全長1 898 bp，氨基酸與雜種百合(Liliumhybrid)(AQZ41944.1)、龍牙百合(Liliumbrownii)(QFV20493.1)、蘆筍(XP_020273691.1)、紫蘇(Perillafrutescens)(AAF66434.1)、胡楊(XP_011008185.1)、黃連木(Pistaciavera)(XP_031283997.1)、溫州柑橘(Citrusunshiu)(GAY55156.1)、葡萄(Vitisvinifera)(XP_002263255.1)AGPase氨基酸全長或部分序列一致性分別達到96%、95%、90%、88%、90%、91%、91%和90%。AGP2基因包含一個完整開放閱讀框，長度1 539 bp， 編碼513個氨基酸。理論pI為6.06，屬堿性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)38.71，為穩(wěn)定蛋白；疏水性-0.126，為親水蛋白；亞細胞定位在葉綠體中，不存在跨膜區(qū)，屬于非跨膜蛋白；不存在信號肽，屬于非分泌性蛋白；保守結(jié)構(gòu)域預測為cd02508，屬于cl11394(Glyco_tranf_GTA_type)超家族，該結(jié)構(gòu)域代表ADP-葡萄糖焦磷酸化酶。

AGP3基因全長2 152 bp，氨基酸與蘭州百合(AJG44463.1)、海棗(Phoenixdactylifera)(XP_008800701.1)、油棕(Elaeisguineensis)(XP_019701499.1)、芭蕉(Musaacuminata)(XP_009416548.1)、蘆筍(XP_020249339.1)、鳳梨(Ananascomosusce)(XP_020106094.1)、唐菖蒲(Gladiolushybrid)(AIO11223.1)、龍舌蘭(QED40916.1)AGPase氨基酸全長或部分序列一致性分別達93%、77%、77%、76%、76%、74%、76%和78%。AGP3基因包含一個完整開放閱讀框，長度1 554 bp，編碼518個氨基酸。理論pI為7.00，屬中性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)32.89，為穩(wěn)定蛋白；疏水性-0.175，為親水蛋白；亞細胞定位在葉綠體中，不存在跨膜區(qū)，屬于非跨膜蛋白；不存在信號肽，屬于非分泌性蛋白；保守結(jié)構(gòu)域預測為cd02508，屬于cl11394(Glyco_tranf_GTA_type)超家族，該結(jié)構(gòu)域代表ADP-葡萄糖焦磷酸化酶。

SSS基因全長3 843 bp，氨基酸與雜種百合(AVZ24768.2)、油棕(XP_010909122.1)、板栗(Castaneamollissimace)(KAF3967760.1)、蘆筍(XP_020268802.1)、云杉(Quercuslobata)(XP_030968629.1)、酸棗(Ziziphusjujuba)(XP_024927563.1)、歐洲栓皮櫟(Quercussuber)(XP_023887385.1)SSS氨基酸全長或部分序列一致性分別達到90%、66%、63%、61%、62%、62%和62%。SSS基因包含一個完整的開放閱讀框，長度3 531 bp，編碼1 177個氨基酸。理論pI為5.55，屬酸性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)42.30，為不穩(wěn)定蛋白；疏水性-0.507，為親水蛋白；亞細胞定位在細胞外，不存在跨膜區(qū)，屬于非跨膜蛋白；不存在信號肽，屬于非分泌性蛋白；保守結(jié)構(gòu)域預測為cd03791，屬于cl10013(Glycosyltransferase_GTB-type)超家族，該結(jié)構(gòu)域代表淀粉合成酶。

GBSS基因全長2 003 bp，氨基酸與雜種百合(AVZ24769.2)、川百合(Liliumdavidii)(AJG44453.1)、海棗(XP_008775302.1)耬斗菜(Aquilegiacoerulea)(PIA34528.1)、油棕(XP_010940833.1)、唐松草(Thalictrumthalictroides)(KAF5206692.1)、芭蕉(XP_009415991.1)、龍舌蘭(QED40917.1)GBSS氨基酸全長或部分序列一致性分別達到90%、90%、71%、68%、69%、68%、69%和69%。GBSS基因包含一個完整的開放閱讀框，長度1 833 bp， 編碼611個氨基酸。理論pI為5.51，屬酸性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)31.07，為穩(wěn)定蛋白；疏水性-0.107，為親水蛋白；亞細胞定位在細胞外，不存在跨膜區(qū)，屬于非跨膜蛋白；不存在信號肽，屬于非分泌性蛋白；保守結(jié)構(gòu)域預測為cd03791，屬于cl10013(Glycosyltransferase_GTB-type)超家族，該結(jié)構(gòu)域代表淀粉合成酶SBE基因全長2 878 bp，氨基酸與蘭州百合(AJG44456.1)、油棕(XP_010940323.1)、蘆筍(XP_020244979.1)、鳳梨(XP_020112024.1)、龍舌蘭(QED40919.1)、博落會(OVA05948.1)、藍果樹(Nyssasinensis)(KAA8516686.1)、水芙蓉(Nelumbonucifera)(XP_010243937.2)SBE氨基酸全長或部分序列一致性分別達到94%、77%、77%、77%、77%、76%、74%和76%。SBE基因包含一個完整的開放閱讀框，長度2 493 bp， 編碼831個氨基酸。理論pI為5.59，屬酸性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)35.39，為穩(wěn)定蛋白；疏水性-0.405， 為親水蛋白；亞細胞定位在葉綠體中，不存在跨膜區(qū)，屬于非跨膜蛋白；不存在信號肽，屬于非分泌性蛋白；保守結(jié)構(gòu)域預測為cd02854，屬于cl28984(Eset)超家族，該結(jié)構(gòu)域代表淀粉分支酶。

SS基因全長2 849 bp，氨基酸與川百合(AGW23638.1)、郁金香(Tulipagesner)(Q41607.1)、深圳擬蘭(Apostasiashenzhenica)(PKA64018.1)、白及(Bletillastriata)(ANW09660.1)、油棕(XP_010939862.1)、蝴蝶蘭(Phalaenopsisequestris)(XP_020587352.1)海棗(XP_008800466.1)SS氨基酸全長或部分序列一致性分別達到98%、94%、88%、89%、88%、88%和88%。SS基因包含一個完整的開放閱讀框，長度1 959 bp，編碼653個氨基酸。理論pI為5.69，屬酸性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)32.48，為穩(wěn)定蛋白；疏水性-0.213，為親水蛋白；亞細胞定位在細胞核中，不存在跨膜區(qū)，屬于非跨膜蛋白；不存在信號肽，屬于非分泌性蛋白；保守結(jié)構(gòu)域預測為pfam00862，屬cl10013(Glycosyltransferase_GTB-type)超家族，該結(jié)構(gòu)域代表蔗糖合成酶。

SPS基因全長3 501 bp，氨基酸與蘭州百合(AJG44459.1)、油棕(XP_010927691.1)、海棗(XP_008794597.1)、鳳梨(OAY76704.1)、芭蕉(THU72924.1)、蘆筍(XP_020260962.1)、睡蓮(Nymphaeacolorata)(XP_031476251.1)SPS氨基酸全長或部分序列一致性分別達到96%、84%、83%、83%、80%、80%、79%和79%。SPS基因包含一個完整的開放閱讀框，長度3 243 bp，編碼1 081個氨基酸。理論pI為6.18，屬酸性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)43.30，為不穩(wěn)定蛋白；疏水性-0.438，為親水蛋白；亞細胞定位在細胞質(zhì)中，不存在跨膜區(qū)，屬于非跨膜蛋白；不存在信號肽，屬于非分泌性蛋白；保守結(jié)構(gòu)域預測為cd03800，屬于cl10013(Glycosyltransferase_GTB-type)超家族，該結(jié)構(gòu)域代表蔗糖磷酸合成酶。

2.6 淀粉、蔗糖合成相關(guān)基因不同部位表達量分析

采用qRT-PCR法檢測蔗糖合成相關(guān)基因在浙貝母不同部位的表達量，結(jié)果見圖5，其中AGP1基因在根中表達量最高，AGP2、AGP3、GBSS和SSS在鱗莖中的表達量最高。SBE基因在葉片中的表達量最高。SS在鱗莖中表達量最高，SPS在葉片中表達量最高。

圖5 不同部位浙貝母淀粉、蔗糖代謝基因表達量Fig.5 Starch and sucrose metabolism gene expression levels of F. thunbergii in different parts

2.7 淀粉、蔗糖合成相關(guān)基因不同發(fā)育時間表達量分析

由圖6可知，除AGP3在40 d時表達量稍有降低外，AGP1、AGP2、AGP3表達量都隨著鱗莖發(fā)育而逐漸增加并在80 d達到最大值，AGP2在鱗莖發(fā)育過程表達量增加最為明顯。GBSS和SSS在鱗莖中的變化趨勢基本一致，均在60 d達到最大值。SBE在鱗莖發(fā)育初期和末期表達量較高，中間時期則較低且平穩(wěn)。SS、SPS基因表達量均在60 d達到最高值。

圖6 不同發(fā)育階段浙貝母淀粉、蔗糖代謝基因表達量Fig.6 Starch and sucrose metabolism gene expression levels of F. thunbergii in different periods

2.8 浙貝母淀粉、蔗糖含量與相關(guān)代謝基因相關(guān)性分析

采用SPSS 24.0軟件對淀粉、蔗糖代謝基因表達量與淀粉、蔗糖含量進行相關(guān)性分析，結(jié)果如表3、表4所示。其中浙貝母鱗莖中3條AGP基因表達量均與淀粉含量呈極顯著正相關(guān)，GBSS、SSS基因表達量與淀粉含量呈顯著正相關(guān)，SBE表達量與淀粉含量不具有相關(guān)性，SS、SPS基因表達量與蔗糖含量呈顯著正相關(guān)。

表3 浙貝母淀粉含量與相關(guān)代謝基因表達量的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between starch content and the expression of related metabolic genes of F.thumbergii

3 討論

碳水化合物作為植物體中主要儲能及供能物質(zhì)，對植物發(fā)育至關(guān)重要。多項研究發(fā)現(xiàn)[3-8]，碳水化合物可促進鱗莖類植物鱗莖發(fā)育，也可影響鱗莖類植物解除休眠，因此，了解碳水化合物在鱗莖的動態(tài)變化，對鱗莖類植物的生長發(fā)育具有重要作用。本試驗發(fā)現(xiàn)，鱗莖發(fā)育過程中淀粉、蔗糖為浙貝母鱗莖發(fā)育的主要影響因素。淀粉、蔗糖代謝與途徑中的多種酶密切相關(guān)，研究相關(guān)基因可為使用基因工程調(diào)控淀粉、蔗糖含量從而促進浙貝母鱗莖膨大的后續(xù)研究提供理論基礎。

蔗糖作為光合作用的主要產(chǎn)物，支持著植物的生長和發(fā)育[26]。植物中蔗糖合成主要受SS、SPS、INV三類酶影響。SS酶作為一個雙向酶，既可合成蔗糖，也可將蔗糖分解為葡萄糖和果糖[27]，浙貝母中SS基因在鱗莖中表達量明顯高于其他部位，這與其在牛大力[27]、白及[28]、木薯[29]在塊莖中表達量最高的結(jié)果一致，甜菜[30]中SS基因在根部大量表達，柑橘[31]中SS基因高表達部位為果汁囊，以上結(jié)果說明SS基因主要在蔗糖積累部位高表達。浙貝母鱗莖中SS基因的表達量與蔗糖含量變化一致，為初期降低、中期升高、末期降低，推測原因可能為浙貝母鱗莖發(fā)育初期新老鱗莖營養(yǎng)轉(zhuǎn)化，鱗莖的主要積累成分為淀粉，蔗糖合成速率較低，糖類配合淀粉合成促使鱗莖迅速膨大；發(fā)育中期鱗莖發(fā)育趨勢平穩(wěn)，蔗糖淀粉共同增加，此時SS主要行使蔗糖合成功能；末期植株發(fā)育基本停滯，鱗莖為進入休眠期儲存能量，SS則行使蔗糖分解功能，分解蔗糖為葡萄糖并輸送至淀粉體用于淀粉合成。Liu 等[32]通過轉(zhuǎn)錄因子ERF72影響木薯塊莖中SS基因表達進而調(diào)控淀粉積累，以及Fan等[33]通過超表達SS基因提高水稻中淀粉積累，都證明了SS基因可分解蔗糖，從而為淀粉合成提供底物。

蔗糖合成過程中SPS酶的生化功能是催化果糖-6-磷酸和UDP葡萄糖轉(zhuǎn)化為蔗糖-6-磷酸, 再由蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphate phosphatase, SPP)水解脫去磷酸基團后形成蔗糖[34]。葉片為SPS酶的主要工作場所，本研究中SPS基因在浙貝母葉片中表達最高進一步證明了這一觀點。甜根子[35]、龍眼[36]、煙草[37]中也有相似結(jié)果，浙貝母鱗莖中SPS基因的表達量與蔗糖含量呈顯著正相關(guān)，且在蔗糖含量最高的時期達到最高值這一特點與Gnansounou等[38]在甜高粱、魏清江等[39]在金桔中的結(jié)果一致。SPS可調(diào)控光合產(chǎn)物在淀粉、蔗糖之間的分配比例[40]，且會影響蔗糖與淀粉間的轉(zhuǎn)化，在稻葉中可通過降低SPS表達提升淀粉含量[41]，玉米和馬鈴薯[42]的研究發(fā)現(xiàn)，可通過增加SPS表達來提高產(chǎn)量。使用RNA干擾技術(shù)降低SPS的表達,可抑制淀粉降解的過程，使煙草葉片中淀粉含量增加3～8倍[37]，可見SPS對植物淀粉、蔗糖代謝極其重要，且具有功能差異性。目前有研究發(fā)現(xiàn)低溫[43]、干旱[44]脅迫可提升SPS表達進而提高蔗糖含量，在浙貝母鱗莖中蔗糖淀粉轉(zhuǎn)化關(guān)鍵時期使用這一特性，可為浙貝母種植技術(shù)提供新思路。

ADP-葡萄糖焦磷酸化酶將1- 磷酸葡萄糖(glucose 1-phosphate, G1P)催化形成淀粉的前體腺苷二磷酸葡萄糖 (adenosine diphosphate glucose, ADPG)，這是一種異四聚體酶[45]，由2個大的和2個小的亞基組成，具有典型的NTP轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域[46]。試驗發(fā)現(xiàn)，水稻中的OsAPL2和OsAPS2中的突變導致其淀粉合成速率顯著降低[47-48]，在玉米研究中，轉(zhuǎn)座子衍生的AGPase基因敲除突變agps-m1可使田間玉米種子產(chǎn)量降低30%[49]。浙貝母鱗中AGP1、AGP2、AGP3三條家族基因均與淀粉含量呈極顯著正相關(guān)，除AGP1基因根部表達量較高于鱗莖，AGP2、AGP3基因鱗莖中表達量遠超過其他部位，郭麗君[50]發(fā)現(xiàn)在葛根塊根膨大期，AGP基因在塊根中表達量遠高于其他部位，小麥、水稻、玉米中AGP基因在胚乳[51]中具有高表達量。這些結(jié)果都說明了AGP基因表達量影響著淀粉積累。

淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，GBSS基因可直接影響直鏈淀粉含量[52]。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入反義GBSS基因可中止相應器官合成直鏈淀粉進而降低淀粉含量。荸薺[53]中GBSS基因在塊莖中表達量較高，黃芪[54]中GBSS基因在毛狀根及根中表達量高于莖和葉，木薯[55]中GBSS基因只在塊莖成長時期表達，百合[56]中GBSS基因在鱗莖表達量較高，浙貝母中GBSS基因在鱗莖中表達量也遠高于其他部位，可見GBSS基因在鱗莖發(fā)育中具有重要作用。SSS、SBE基因共同參與支鏈淀粉合成，在水稻、小麥、玉米、馬鈴薯、大麥、擬南芥中將SSS基因表達敲低后作物中支鏈淀粉及總淀粉含量明顯降低[57-61]。水仙[62]中SSS基因在花器發(fā)育期高表達，蓮藕[63]根狀莖伸長過程中SSS基因表達量不斷變化，表明SSS基因與植物發(fā)育密切相關(guān)。浙貝母發(fā)育過程中GBSS和SSS基因均在鱗莖中高表達，且與淀粉含量呈顯著正相關(guān)，表達量隨鱗莖發(fā)育逐漸增大，僅在發(fā)育末期下降，原因可能為鱗莖在成熟時發(fā)育速率減慢且需降低生理活性為進入休眠期做準備。

浙貝母鱗莖中的淀粉合成與多種基因有關(guān)，這與侯夫云等[64]在甘薯中的研究結(jié)果相同；百合[65]中也發(fā)現(xiàn)AGP、SSS、GBSS基因均與淀粉含量及鱗莖發(fā)育成正相關(guān)，淀粉合成相關(guān)基因的克隆研究可為浙貝母分子育種及鱗莖膨大調(diào)控提供理論基礎。

4 結(jié)論

試驗首先使用同源克隆方法克隆出AGP1、AGP2、AGP3、SSS、GBSS、SBE、SPS、SS基因保守端，然后通過RACE技術(shù)獲取全長序列，通過BLAST對比后發(fā)現(xiàn)各基因與百合中同名基因同源度均在90%以上，且與其他物種同名基因同源度達62%～90%。試驗首次在浙貝母中克隆到AGP1、AGP2、AGP3、GBSS、SSS、SBE、SPS、SS基因，上傳NCBI后獲取登錄號MT990627、MT990628、MT990629、MT996229、MT996230、MT996231、MT996232和MT996233。試驗還發(fā)現(xiàn)AGP1、AGP2、AGP3、GBSS、SSS對浙貝母鱗莖中的淀粉積累至關(guān)重要，SS、SPS共同參與鱗莖中的蔗糖合成。本研究為浙貝母后續(xù)相關(guān)基因的功能研究奠定了基礎，也為浙貝母分子育種及鱗莖膨大調(diào)控技術(shù)提供了依據(jù)。