朱畇昊 張夢佳 彭淑萍 董誠明,2,*

(1 河南中醫(yī)藥大學藥學院，河南 鄭州 450046；2 呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046)

地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)為玄參科(Scrophulariaceae)多年生草本植物，主要以其新鮮或干燥塊根入藥[1]，全國各地均有栽培，以懷地黃為佳。近年有研究發(fā)現(xiàn)，地黃的化學成分以萜類化合物中的環(huán)烯醚萜苷類為主，此外還含有糖類、氨基酸、微量元素以及脂肪酸等其他成分，具有強心利尿、抗炎解熱、促進血液凝固和降低血糖等作用[2]。但由于連作障礙等原因，地黃的栽培品種退化嚴重，次生代謝產(chǎn)物含量也不穩(wěn)定，藥材的產(chǎn)量與質(zhì)量得不到保證。因此，利用新技術(shù)手段提高活性產(chǎn)物含量，以及從分子水平探究地黃次生代謝產(chǎn)物合成通路，已成為地黃資源及活性產(chǎn)物的重要研究內(nèi)容和新的發(fā)展方向。

毛狀根(又稱發(fā)狀根)是整體植株或某一器官、組織(包括愈傷組織)、單個細胞，甚至原生質(zhì)體受到發(fā)根農(nóng)桿菌感染時產(chǎn)生的一種病理現(xiàn)象，主要是在感染部位或其附近產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物——毛狀根[3]。與藥用植物植株相比，毛狀根具有擴增迅速、容易培養(yǎng)、遺傳穩(wěn)定性強等優(yōu)點；且正常培養(yǎng)條件下生長的毛狀根新陳代謝活躍，能合成與原植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物[4]，是一種優(yōu)質(zhì)的研究材料，近年來受到眾多學者的關(guān)注。目前關(guān)于毛狀根的研究主要集中于其在品種改良、藥用植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)及基因功能研究等方面的應用[5-7]。

內(nèi)生真菌存在于健康植株組織內(nèi)部，不會對宿主植物造成明顯傷害。最新研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌可以通過定殖于宿主植物根部，并產(chǎn)生分泌物來改善長期單一栽培土壤中的碳代謝和根際細菌群落，從而起到一定減輕土壤病的作用[8]，這為內(nèi)生真菌的應用研究提供了新的思路。地黃內(nèi)生真菌GG22為河南省道地藥材生態(tài)種植課題組前期從地黃塊根中分離篩選出的內(nèi)生真菌，屬于鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，將內(nèi)生真菌GG22與地黃組培苗共培養(yǎng)后，會促進地黃組培苗的生長、顯著增加次生代謝產(chǎn)物含量[10]。生物誘導子是指來源于微生物或動植物細胞的化合物，主要包括病原菌(真菌、細菌、病毒與酵母提取物)和細胞壁的分離物[11]，目前應用最廣、研究最多的是真菌類誘導子。有研究表明，真菌誘導子可通過誘導毛狀根中某些基因表達量的變化[12]從而調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑中相關(guān)酶的活性, 最終誘導特定次生代謝產(chǎn)物的生成和積累[13-14]，且內(nèi)生真菌誘導子也能夠?qū)γ珷罡纳L起到一定的促進作用[15-16]。但關(guān)于地黃內(nèi)生真菌誘導子對地黃毛狀根作用的研究尚鮮見報道。

本試驗以地黃毛狀根為材料，通過添加不同濃度的內(nèi)生真菌GG22誘導子溶液，研究其對地黃毛狀根生長及次生代謝產(chǎn)物含量的影響，旨在為后期將內(nèi)生真菌GG22誘導子用于工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)和支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

地黃促生內(nèi)生真菌GG22菌株由河南中醫(yī)藥大學藥學院生藥學科組培實驗室提供，經(jīng)篩選后保存于4℃冰箱。地黃毛狀根，由組織培養(yǎng)室前期誘導所得，培養(yǎng)于1/2 MS固體培養(yǎng)基中。

1.2 試驗方法

1.2.1 誘導子溶液的制備及多糖濃度的測定 將地黃內(nèi)生真菌GG22接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養(yǎng)基上活化3 d后，轉(zhuǎn)移至PDA液體培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)3～4 d。取1 mL菌液接種至新的PDA液體培養(yǎng)基中，120 r·min-1、28℃搖床振搖培養(yǎng)2 d得到種子液[17]。抽濾收集GG22菌絲，用蒸餾水沖洗干凈后研磨成泥狀。稱取研磨好的菌絲10 g置于150 mL錐形瓶中，加入蒸餾水，超聲處理1 h，121℃高溫滅菌30 min，離心所得上清液即為誘導子溶液[18]。

采用硫酸-苯酚法以無水葡萄糖為標準品繪制標準曲線，測定誘導子溶液中多糖的濃度，標準品溶液配置濃度如表1所示。

表1 標準品溶液的配制Table 1 Preparation of standard solution

精密稱取無水葡萄糖標準品10 mg，溶解后定容于100 mL錐形瓶中，搖勻，配置成標準品溶液。根據(jù)表1加入顯色劑，搖勻后放置室溫顯色20 min。以不加多糖溶液的空白組為參比，在485 nm波長下測定吸光度。以葡萄糖含量X為橫坐標，吸光度Y為縱坐標繪制標準曲線，求得標準曲線方程為：Y=10.214 0X-0.000 7,R2=0.999 4。

誘導子多糖濃度的測定：取0.1 mL稀釋10倍的誘導子溶液于具塞試管中，加入新配置的9%苯酚溶液1 mL及濃硫酸5 mL。搖勻后放置在室溫下顯色20 min，在485 nm波長下測定其吸光度平均值為0.51。根據(jù)標準曲線方程算得誘導子溶液的多糖濃度為500 mg·L-1。

1.2.2 地黃毛狀根的培養(yǎng)及誘導處理 精密稱取在1/2 MS固體培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)[19]的地黃毛狀根0.1 g，放入60 mL 1/2MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)23 d后，將誘導子溶液加入液體培養(yǎng)基中，使液體培養(yǎng)基中多糖濃度分別為10、30、50和100 mg·L-1；以加入蒸餾水的處理組為對照組，每組設置3個重復。分別培養(yǎng)0、3、5、8、11 d后取樣，洗凈殘留液體培養(yǎng)基，吸干多余水分，稱取鮮重。50℃烘至恒重后稱取干重。

1.2.3 總環(huán)烯醚萜苷含量測定 供試品溶液的制備參照曾令峰等[20]的方法。顯色條件：取供試液1 mL于10 mL具塞試管中，加入70%乙醇1 mL。加入1 mol·L-1的鹽酸溶液2 mL，搖勻，90℃水浴反應15 min，放冷。加二硝基苯肼乙醇試液0.5 mL搖勻，90℃水浴反應25 min，放冷。加入70%乙醇配置的3 mL 1 mol·L-1氫氧化鈉，搖勻，室溫下放置1 h。以等量的70%乙醇溶液為空白組，在463 nm處測定吸光度值。

1.2.4 毛蕊花糖苷含量測定 根據(jù)《中華人民共和國藥典》(2015版一部)[1]地黃項下含量測定方法。采用1260型高效液相色譜儀(Agilent Technologies Inc., 美國)分析地黃毛狀根中毛蕊花糖苷的含量在內(nèi)生真菌GG22誘導子作用下的變化。色譜條件為：色譜柱：Aichrombond-AQ C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相：乙腈∶0.1%醋酸溶液(16∶84，v/v)；檢測波長：334 nm；流速：1 mL·min-1；進樣量：20 μL。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對原始數(shù)據(jù)進行處理分析，采用Duncan新復極差法對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.2.6 變異系數(shù)權(quán)重法分析誘導子溶液對地黃毛狀根的促生效果 具體計算步驟如下：

根據(jù)以上公式求得鮮重、干重、毛蕊花糖苷含量、總環(huán)烯醚萜苷含量的權(quán)重系數(shù)分別為0.182、0.169、0.214、0.435。將計算得到的權(quán)重系數(shù)帶入，可得到以下公式，用以計算不同濃度誘導子溶液對地黃毛狀根促生作用的綜合得分：

F=0.182X鮮重+0.169X干重+0.214X毛蕊花糖苷+0.435X總環(huán)烯醚萜苷

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株GG22誘導子對地黃毛狀根生物量的影響

如圖1所示，對照組地黃毛狀根的生物量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加呈現(xiàn)增長趨勢，在第11天達到最高值。GG22誘導子溶液的多糖濃度為10 mg·L-1時，地黃毛狀根生物量相比相同培養(yǎng)時間下的對照組均有提高，且隨著共培養(yǎng)天數(shù)的增加，地黃毛狀根生物量也不斷增加并在第11天達到最高，此時地黃毛狀根鮮重是相同培養(yǎng)時間下對照組的1.47倍，干重是相同培養(yǎng)時間下對照組的1.32倍。誘導子溶液多糖濃度為30 mg·L-1時，地黃毛狀根生物量呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢，在第5天最高。誘導子溶液多糖濃度為50 mg·L-1時，地黃毛狀根在第3、第8和第11天的生物量高于對照組；但在第5天時毛狀根干重相較對照組無明顯變化，鮮重較對照組略微降低。誘導子溶液多糖濃度為100 mg·L-1時，自第3天起試驗組毛狀根的生物量始終高于對照組，其干重隨培養(yǎng)時間的增加呈遞增趨勢，11 d達最大值；鮮重的變化趨勢與多糖濃度為50 mg·L-1的試驗組一致。

圖1 GG22誘導子對地黃毛狀根生物量的影響Fig.1 Effect of GG22 elicitor on biomass of hairy roots of Rehmannia glutinosa

2.2 菌株GG22誘導子對地黃毛狀根總環(huán)烯醚萜苷含量的影響

如圖2所示，不同濃度的GG22誘導子溶液對地黃毛狀根中總環(huán)烯醚萜苷含量的積累均表現(xiàn)出一定的促進作用。對照組中總環(huán)烯醚萜苷的含量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加逐漸增加。誘導子溶液的多糖濃度為100 mg·L-1時，與對照組相比，試驗組在第3、第5和第8天時總環(huán)烯醚萜苷含量更高且隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加呈上升趨勢，但在第11天時總環(huán)烯醚萜苷含量較對照組略微降低。誘導子溶液濃度為10 mg·L-1及50 mg·L-1時，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加試驗組總環(huán)烯醚萜苷含量逐步積累，在第11天時含量達到最高；誘導子溶液的多糖濃度為10 mg·L-1在第11天時總環(huán)烯醚萜苷含量為相同培養(yǎng)天數(shù)下對照組含量的1.5倍。誘導子溶液的多糖濃度為30 mg·L-1時，在第3和第5天總環(huán)烯醚萜苷含量變化不明顯，但在第0～第3天有快速積累，且在第5天后也有快速積累，并在第11天時含量達到最高，在誘導子多糖濃度為30 mg·mL-1時，第11天總環(huán)烯醚萜苷的含量與對照組差異顯著，較對照組增加約89%。

注：*表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: * means significant difference at 0.05 level. The same as following.圖2 GG22誘導子對毛狀根中總環(huán)烯醚萜苷含量的影響Fig.2 Effect of GG22 elicitor on the contents of total iridoid glycosides in hairy roots

2.3 菌株GG22誘導子對地黃毛狀根毛蕊花糖苷含量的影響

對照組毛蕊花糖苷的含量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加呈現(xiàn)明顯降低的趨勢，而試驗組的毛蕊花糖苷含量的變化趨勢與空白對照組不同，且不同濃度誘導子對地黃毛狀根中毛蕊花糖苷含量的積累有不同的影響。在共培養(yǎng)第3天時，誘導子溶液的多糖濃度為10、50和100 mg·L-1的試驗組的毛狀根中毛蕊花糖苷含量比對照組高，且誘導子溶液的多糖濃度為50 mg·L-1的試驗組在培養(yǎng)第3天時毛蕊花糖苷含量最高，與對照組具有顯著性差異，是對照組含量的1.5倍，而誘導子溶液的多糖濃度為30 mg·L-1時試驗組的毛蕊花糖苷含量略低于對照組。誘導子溶液的多糖濃度為100 mg·L-1的試驗組隨著共培養(yǎng)天數(shù)的增加，毛蕊花糖苷的含量沒有顯著變化，與第0天相比，在共培養(yǎng)第3天其含量略有提高，隨后略微下降并保持穩(wěn)定。

圖3 GG22誘導子對毛狀根中毛蕊花糖苷含量的影響Fig.3 Effect of GG22 elicitor on the contents of verbascoside in hairy roots

2.4 不同濃度誘導子對地黃毛狀根促生效果比較分析

本試驗通過綜合評分評價不同濃度誘導子對地黃毛狀根的促生效果[21]。權(quán)重系數(shù)是綜合評價的關(guān)鍵[22]，以評價指標變異系數(shù)計算其權(quán)重系數(shù)，評價指標的變異系數(shù)越大，所賦的權(quán)重越大[23]。通過計算得到總環(huán)烯醚萜苷含量的權(quán)重系數(shù)最高為0.435，可知總環(huán)烯醚萜苷的含量在不同濃度誘導子對地黃毛狀根促生作用的評價中具有重要意義。

綜合得分結(jié)果顯示(表2)，加入誘導子的試驗組的綜合得分均比對照組高，表明內(nèi)生真菌GG22誘導子對地黃毛狀根的生物量及次生代謝產(chǎn)物含量有一定的促進作用，且以誘導子溶液的多糖濃度為50 mg·L-1，共培養(yǎng)11 d為最優(yōu)誘導條件；誘導子溶液的多糖濃度為100 mg·L-1，共培養(yǎng)11天的試驗組較優(yōu)。

表2 不同濃度誘導子溶液對地黃毛狀根促生作用綜合得分Table 2 Comprehensive score of different concentrations of elicitor solution on promoting growth of R. glutinosa hairy root

3 討論

3.1 地黃內(nèi)生真菌GG22誘導子對地黃毛狀根生長及次生代謝產(chǎn)物的影響

根據(jù)性質(zhì)不同可將誘導子分為生物誘導子和非生物誘導子兩類，而在生物誘導子中應用最廣、研究最多的是真菌誘導子[24]。王瑜等[25]研究表明酵母提取物對王不留行毛狀根的生長影響作用不明顯，但能明顯促進王不留行黃酮苷的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)GG22誘導子溶液對地黃毛狀根的生物量及次生代謝產(chǎn)物含量有一定影響，一般表現(xiàn)為促進作用。在毛蕊花糖苷的含量的測定中發(fā)現(xiàn)，對照組毛蕊花糖苷含量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，推測可能為毛狀根中的毛蕊花糖苷隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，從毛狀根浸出到液體培養(yǎng)基中。前人研究也發(fā)現(xiàn)在毛狀根培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液中存在次生代謝產(chǎn)物的積累[26]，后續(xù)需要進一步對液體培養(yǎng)基進行分析。在試驗過程中還發(fā)現(xiàn)高效液相色譜儀檢測的幾組供試品中未出現(xiàn)與梓醇標準品相同保留時間的色譜峰。Piatczak等[27]分析地黃毛狀根中有效成分的含量時，使用質(zhì)譜法檢測到了梓醇的存在。這可能是由于檢測器不靈敏或梓醇含量過少；也可能是地黃毛狀根在內(nèi)生真菌GG22誘導子的作用下促進了一些特定酶的表達，使毛狀根中總環(huán)烯醚萜苷更多轉(zhuǎn)化為其他環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)，較少轉(zhuǎn)化為梓醇。

3.2 地黃毛狀根與真菌誘導子共培養(yǎng)的培養(yǎng)條件的優(yōu)化選擇

齊香君等[28]研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉誘導子在培養(yǎng)液中質(zhì)量濃度為40 mg·L-1時，黃芩苷的含量最高，但隨著培養(yǎng)液質(zhì)量濃度的增加，對毛狀根的生長呈抑制狀態(tài)。但明乾良[18]研究發(fā)現(xiàn)丹參毛狀根對D16誘導子溶液有一個短暫的適應期，在適應期內(nèi)高濃度誘導子溶液表現(xiàn)出一定的抑制作用，在適應期后則表現(xiàn)出對丹參毛狀根生物量的促進作用。由此可見，隨著濃度和共培養(yǎng)天數(shù)的增加，部分真菌誘導子并不表現(xiàn)出特定的誘導規(guī)律，真菌誘導子能夠起到促進作用所需的濃度根據(jù)內(nèi)生真菌種類及毛狀根種類的不同而有所變化[29-30]，因此需要通過進一步的研究來確定某一種真菌誘導子最適的濃度及培養(yǎng)天數(shù)。本試驗通過變異系數(shù)權(quán)重法來分析不同多糖濃度的內(nèi)生真菌GG22誘導子溶液在誘導不同的時間后對地黃毛狀根的作用效果。發(fā)現(xiàn)使用多糖濃度為50 mg·L-1的地黃內(nèi)生真菌GG22誘導子，共培養(yǎng)11 d 時對于地黃毛狀根的生長及次生代謝產(chǎn)物積累的促進效果最好。

4 結(jié)論

本試驗以地黃毛狀根為試驗材料，通過制備GG22菌絲水溶性提取物作為誘導子的方法，研究不同GG22誘導子溶液多糖濃度在不同誘導天數(shù)下對地黃毛狀根生長及次生代謝產(chǎn)物的影響。結(jié)果表明，加入誘導子溶液對于地黃毛狀根的生物量及總環(huán)烯醚萜苷、毛蕊花糖苷含量的積累有一定的促進作用，且通過變異系數(shù)權(quán)重法分析綜合得分，得出最適宜誘導條件為誘導子多糖濃度為50 mg·L-1，共培養(yǎng)11 d。本研究為進一步研究內(nèi)生真菌GG22誘導子對地黃毛狀根中次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因表達的影響提供了一定的基礎(chǔ)。