吳迪 范欣欣 沈建山 林友飛 陳曉紅 黃明翔 陳力舟

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)以新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)作為病原體，在世界范圍內(nèi)造成了大規(guī)模流行。COVID-19有多種臨床表現(xiàn)形式，輕型患者可以僅僅表現(xiàn)為低熱、輕微乏力等癥狀，無明顯肺炎的表現(xiàn)；重癥患者多在發(fā)病7 d后出現(xiàn)呼吸困難和(或)低氧血癥，部分病情危重的患者可快速進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒、凝血功能障礙及多器官功能衰竭等[1]。當(dāng)COVID-19患者向重癥方向進(jìn)展時(shí)，其體內(nèi)機(jī)體凝血機(jī)制會(huì)失衡，可出現(xiàn)肺血管炎、血栓形成(混合血栓、透明血栓)，乃至危及生命。因此，對(duì)危重患者進(jìn)行早期識(shí)別和及時(shí)治療至關(guān)重要。

凝血篩查指標(biāo)包括活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)、凝血酶時(shí)間(thrombin time，TT)、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)ib)，可以反映人體凝血功能的狀態(tài)[2]。D-二聚體(D-dimer)是交聯(lián)纖維蛋白的一種降解產(chǎn)物，數(shù)值升高表明凝血酶生成增加，纖溶酶對(duì)纖維蛋白的溶解增多，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體容易形成血栓。凝血試驗(yàn)結(jié)果的監(jiān)測可以反映患者臨床狀態(tài)，幫助確定監(jiān)護(hù)水平。Huang等[3]及Chen等[4]研究發(fā)現(xiàn)，D-二聚體升高與患者病情嚴(yán)重程度具有相關(guān)性。本研究以臨床確診COVID-19患者為研究對(duì)象，探討凝血篩查指標(biāo)及D-二聚體水平與患者疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系，及其對(duì)患者臨床分型的診斷價(jià)值。

資料和方法

一、研究對(duì)象

回顧性收集2020年1月23日至2月26日在福建省福州肺科醫(yī)院確診為COVID-19的72例患者。于住院時(shí)、住院期間及疾病出現(xiàn)進(jìn)展時(shí)，檢查患者凝血篩查指標(biāo)及D-二聚體水平，排除凝血篩查指標(biāo)及D-二聚體標(biāo)本為非同時(shí)檢測的標(biāo)本，或檢測項(xiàng)目不全的標(biāo)本，最終共獲得147份檢驗(yàn)結(jié)果。再根據(jù)采血當(dāng)天患者所處的不同臨床分型進(jìn)一步分組：輕型和普通型作為輕癥組(72份)，重型和危重型作為重癥組(75份)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[批準(zhǔn)編號(hào)：2020-016(科研)-01]，所有患者資料均為匿名分析。

患者納入標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)《新型冠狀病毒肺炎防控方案(第四版)》[1]，納入符合COVID-19診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者。

患者排除標(biāo)準(zhǔn)：排除并發(fā)腫瘤、血液系統(tǒng)疾病等影響凝血功能的基礎(chǔ)疾病患者。

二、確診COVID-19患者的臨床分型

依據(jù)《新型冠狀病毒肺炎防控方案(第四版)》[1]，新型冠狀病毒肺炎患者臨床分型為：(1)輕型：臨床癥狀輕微，影像學(xué)未見肺炎表現(xiàn)；(2)普通型：具有發(fā)熱、呼吸道癥狀等，影像學(xué)可見肺炎表現(xiàn)；(3)重型：成人符合下列任何一條，①出現(xiàn)氣促，呼吸頻率≥30次/min；②靜息狀態(tài)下，吸空氣時(shí)指氧飽和度≤93%；③動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)/吸氧濃度(FiO2)≤300 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，臨床癥狀進(jìn)行性加重，肺部影像學(xué)顯示24～48 h內(nèi)病灶明顯進(jìn)展>50%者；(4)危重型：符合以下情況之一者，①出現(xiàn)呼吸衰竭，且需要機(jī)械通氣；②出現(xiàn)休克；③并發(fā)其他器官功能衰竭需通過ICU監(jiān)護(hù)治療。

三、儀器與試劑

SARS-CoV-2核酸檢測儀采用美國賽默飛世爾全自動(dòng)核酸提取儀，試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供。凝血指標(biāo)及D-二聚體水平檢測采用沃芬醫(yī)療器械商貿(mào)有限公司的TOP-750全自動(dòng)血凝儀及配套試劑。

四、研究方法

1.檢測方法：所有患者均采集3 ml靜脈血于枸櫞酸鈉抗凝真空管中，以離心半徑17.2 cm，3500 r/min離心10 min，檢測血漿APTT、TT、PT、Fib及D-二聚體水平。

2.研究內(nèi)容：研究凝血篩查指標(biāo)及D-二聚體水平與患者疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系，以及多項(xiàng)檢測指標(biāo)單獨(dú)和聯(lián)合檢測對(duì)患者臨床分型的診斷價(jià)值。

3. 相關(guān)定義：(1)聯(lián)合檢測：采用多項(xiàng)診斷試驗(yàn)檢測同一受試對(duì)象，包括并聯(lián)試驗(yàn)和串聯(lián)試驗(yàn)；(2)并聯(lián)檢測：全部試驗(yàn)中，任何一項(xiàng)結(jié)果陽性定義為陽性，可以提高檢測的敏感度；(3)串聯(lián)檢測：全部試驗(yàn)中，所有結(jié)果均為陽性定義為陽性，可以提高檢測的特異度[5]。(4)檢測指標(biāo)：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；約登指數(shù)=敏感度+特異度-1。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、兩組患者血液中D-二聚體及凝血篩查指標(biāo)的比較

重癥組患者D-二聚體及凝血篩查指標(biāo)TT、PT、Fib水平均明顯高于輕癥組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；而APTT水平在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者血液中D-二聚體及凝血篩查指標(biāo)TT、PT、Fib、APTT水平的比較

二、D-二聚體及凝血篩查指標(biāo)對(duì)診斷COVID-19臨床分型的ROC曲線分析

通過繪制ROC曲線進(jìn)一步分析血漿D-二聚體、TT、PT及Fib對(duì)鑒別輕癥組和重癥組患者的診斷價(jià)值。D-二聚體的曲線下面積為0.917(95%CI：0.869～0.964)，明顯高于TT、PT、Fib的曲線下面積[分別為0.617(95%CI：0.526～0.709)、0.715(95%CI：0.623～0.799)和0.672(95%CI：0.585～0.759)]；當(dāng)約登指數(shù)取最大值(0.756)時(shí)，D-二聚體的臨界值為0.364 mg/L，診斷重癥組的敏感度為86.7%，特異度為88.9%。見圖1。

圖1 D-二聚體及凝血篩查指標(biāo)診斷新型冠狀病毒肺炎的ROC曲線

三、D-二聚體及凝血篩查指標(biāo)對(duì)診斷COVID-19患者臨床分型的效能

通過D-二聚體和TT、PT、Fib的單獨(dú)及聯(lián)合檢測，可以發(fā)現(xiàn)單用D-二聚體效果(約登指數(shù))最優(yōu)。當(dāng)并聯(lián)D-二聚體和Fib時(shí)，約登指數(shù)為0.627，低于單用D-二聚體的約登指數(shù)，但與單用D-二聚體相比，可以進(jìn)一步提升敏感度，也具有潛在的臨床價(jià)值。見表2。

表2 以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估D-二聚體和凝血篩查指標(biāo)單獨(dú)和聯(lián)合檢測對(duì)新型冠狀病毒肺炎臨床分型的診斷效能

討 論

COVID-19主要通過呼吸道-飛沫在人與人之間進(jìn)行傳播，肺臟是最為常見的受累部位[6]。COVID-19患者的臨床表現(xiàn)不一，輕癥者可以沒有癥狀，重癥者則可發(fā)展成危重癥，甚至危及生命。目前國際疫情形勢嚴(yán)峻，國內(nèi)也仍間斷出現(xiàn)局部地區(qū)的病例暴發(fā)，仍需始終如一做好常態(tài)化疫情防控工作。不同臨床分型患者的預(yù)后差異巨大。凝血功能篩查與D二聚體水平檢測簡單、易行，已在基層廣泛開展，本研究旨在探究凝血篩查指標(biāo)和D-二聚體檢測結(jié)果對(duì)COVID-19患者臨床分型的診斷價(jià)值，以期為COVID-19患者臨床分型的快速診斷提供參考。

Th1細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞是對(duì)抗病毒感染的主要免疫細(xì)胞?？乖尸F(xiàn)細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)產(chǎn)生抗原后，T細(xì)胞通過免疫反應(yīng)殺死病毒感染細(xì)胞。病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖觸發(fā)中性粒細(xì)胞和炎癥巨噬細(xì)胞的激活。免疫反應(yīng)會(huì)引發(fā)并產(chǎn)生細(xì)胞因子風(fēng)暴，這些細(xì)胞可促進(jìn)血小板聚集并啟動(dòng)凝血級(jí)聯(lián)，凝血系統(tǒng)功能障礙是病情加重的特征，同時(shí)也是不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素。中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular trap，NET)是中性粒細(xì)胞釋放的一種解聚的染色質(zhì)，其在COVID-19患者的血栓前狀態(tài)中起到一定作用[7]。凝血系統(tǒng)與宿主對(duì)出血、傷害和病毒等傳染性病因入侵的防御響應(yīng)密切相關(guān)。COVID-19患者凝血異常主要表現(xiàn)為高凝狀態(tài)，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確[8]。宋景春等[9]牽頭執(zhí)筆的《新型冠狀病毒肺炎重癥患者相關(guān)凝血功能障礙診療專家共識(shí)》也指出，SARS-CoV-2可導(dǎo)致炎性因子大量釋放，形成全身炎癥反應(yīng)綜合征，微血管系統(tǒng)受到損害，導(dǎo)致凝血系統(tǒng)異常活化，引起肺、肝、心、腎、腎上腺等實(shí)質(zhì)器官細(xì)胞壞死，最終導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征，而在病理學(xué)上表現(xiàn)為全身性小血管炎和廣泛的微血栓形成。目前認(rèn)為，SARS-CoV-2與凝血、纖溶系統(tǒng)的相互作用還存在更為復(fù)雜的分子機(jī)制，需要進(jìn)一步深入研究。

本研究提示，重癥患者D-二聚體及凝血篩查指標(biāo)中的TT、PT、Fib水平均高于輕癥患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而APTT水平在兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與付忠曉等[10]研究結(jié)果相似，但其研究發(fā)現(xiàn)輕重癥患者之間Fib的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。朱潔云等[8]發(fā)表的薈萃分析提示，輕癥與重癥COVID-19患者凝血指標(biāo)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同研究結(jié)果之間的差異可能與樣本量的大小、不同研究凝血檢查結(jié)果的判斷及臨床分型的差異存在一定的相關(guān)性。雖然在凝血功能篩查方面存在爭議，但均一致認(rèn)可D-二聚體對(duì)于輕、重癥患者分型有很好的鑒別診斷價(jià)值。這與筆者在臨床工作中的經(jīng)驗(yàn)相似，COVID-19患者可以出現(xiàn)多種復(fù)雜不一的凝血異常，但是多表現(xiàn)為高凝狀態(tài)。其中，D-二聚體水平升高的發(fā)生率最為常見，且與器官功能及炎性因子水平具有一定的相關(guān)性。鄧國防和雷建平[11]的研究表明，凝血異常激活，與患者疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，是死亡相關(guān)的關(guān)鍵因素，并且提示COVID-19患者的D-二聚體水平>1 mg/L與不良預(yù)后存在直接關(guān)聯(lián)[12-13]。還有研究提示，COVID-19患者的凝血障礙與疾病的嚴(yán)重程度和死亡率相關(guān)[14-15]。

本研究通過繪制ROC曲線進(jìn)一步分析，當(dāng)約登指數(shù)取最大值(0.756)時(shí)，D-二聚體的臨界值為0.364 mg/L，診斷重癥組的敏感度為86.7%，特異度為88.9%。這種高凝狀態(tài)原因可能是SARS-CoV-2對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的直接攻擊、細(xì)胞因子風(fēng)暴介導(dǎo)的炎癥-凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，危重癥患者可能因?yàn)殚L期制動(dòng)而出現(xiàn)血流淤滯。D-二聚體是交聯(lián)纖維蛋白的一種降解產(chǎn)物，其升高提示凝血酶生成增加和纖溶酶對(duì)纖維蛋白的溶解增多，導(dǎo)致高凝狀態(tài)[16]。病毒和內(nèi)毒素等有害物質(zhì)在進(jìn)入血液后可以激活凝血因子Ⅻ，激活內(nèi)源凝血系統(tǒng)和纖維化系統(tǒng)，從而導(dǎo)致D-二聚體增加。D-二聚體水平升高與彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)形成的增加，以及COVID-19患者最終死亡率增加有關(guān)[17]。在COVID-19患者中，PT時(shí)間的延長與疾病結(jié)果相關(guān)[18]。纖維蛋白原是肝臟產(chǎn)生的一種糖蛋白，它參與血液凝固過程，是血栓形成的關(guān)鍵因素。Tang等[19]研究提示，在重癥COVID-19患者中，PT時(shí)間的延長和D-二聚體的增加與DIC有關(guān)，71.4%的死亡結(jié)局的患者甚至達(dá)到了DIC的標(biāo)準(zhǔn)。

通過D-二聚體和TT、PT、Fib的組合檢測，可以發(fā)現(xiàn)從診斷效能的角度來看，單用D-二聚體的診斷效能最優(yōu)。當(dāng)并聯(lián)D-二聚體和Fib時(shí)，約登指數(shù)為0.627，低于單用D-二聚體的約登指數(shù)，但與單用D-二聚體相比較，可以進(jìn)一步提升敏感度，有利于更早期篩選可能會(huì)發(fā)展成重癥的高?；颊?。Wang等[20]研究進(jìn)一步表明，F(xiàn)ib將是COVID-19患者的潛在臨床預(yù)測指標(biāo)，與本研究結(jié)論一致。

本研究的創(chuàng)新在于通過凝血指標(biāo)與D-二聚體的分別檢查及聯(lián)合檢測，探究其對(duì)于鑒別輕重癥COVID-19患者的臨床意義。初步提示，COVID-19患者存在一定程度的凝血功能狀態(tài)異常，并且在輕、重癥不同組的患者中存在差異。D-二聚體、凝血篩查指標(biāo)中的TT、PT、Fib均對(duì)COVID-19疾病分型具有較高的診斷價(jià)值及臨床意義，可輔助臨床分級(jí)診療，且由于其檢測手段簡便、易行、普及，值得進(jìn)一步推廣和應(yīng)用。D-二聚體對(duì)疾病分型的診斷效能最優(yōu)，以0.364 mg/L為臨界值，診斷重癥組的敏感度為86.7%，特異度為88.9%。當(dāng)通過D-二聚體和Fib進(jìn)行串聯(lián)檢測時(shí)，可以進(jìn)一步提升敏感度，早期發(fā)現(xiàn)高?；颊?，具有潛在的臨床價(jià)值。

有研究報(bào)道，轉(zhuǎn)鐵蛋白是監(jiān)測COVID-19患者病情進(jìn)展的候選診斷標(biāo)志，并可能指導(dǎo)COVID-19患者抗凝藥物的使用[21]。不同的指標(biāo)對(duì)COVID-19患者病情的預(yù)測及嚴(yán)重程度的鑒別還需要以后繼續(xù)進(jìn)行研究。COVID-19患者在入院時(shí)應(yīng)檢查與炎癥和凝血有關(guān)的生物標(biāo)志物，并在此后進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測，以盡早識(shí)別COVID-19相關(guān)的凝血疾病，改善預(yù)后。

本研究的局限在于納入研究的患者數(shù)量較少，且為回顧性研究，納入的患者可能存在選擇偏倚。另一方面，由于缺乏同一例患者不同分型轉(zhuǎn)歸的動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)，尚無法為臨床預(yù)后的判斷提供參考依據(jù)。未來可以開展更多大樣本、多中心的研究，并對(duì)凝血篩查指標(biāo)及D-二聚體對(duì)于臨床轉(zhuǎn)歸以及是否需要進(jìn)行預(yù)防性抗血栓治療等問題做進(jìn)一步探究。