張 龍，林裕勝，江錦秀，張靖鵬，黃瀟航，胡奇林*

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州350013；2.福建農(nóng)林大學動物科學學院，福建 福州350002）

0 引言

【研究意義】雞傳染性支氣管炎是由雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的一種具有重大經(jīng)濟影響的病毒病[1]。雞傳染性支氣管炎的病變部位主要取決于毒株對不同組織的親嗜性，通常都會表現(xiàn)出咳嗽、喘氣、啰音、精神沉郁等臨床癥狀，6周齡以內(nèi)的死亡率在25%～40%。病雞死亡原因可能是由于IBV的直接感染，也可能是死于之后的細菌繼發(fā)感染[2]。雞細小病毒（Chicken parvovirus，ChPV）是導致雞群發(fā)生腸道疾病的重要病原之一，影響雞的腸道健康，引起腹瀉、生長發(fā)育不良等癥狀[3]。雞傳染性貧血病病毒（Chicken infectiousanem ia virus，CIAV）是造成2～3周齡雞群發(fā)生貧血和免疫抑制的主要病因之一，通常成年雞感染CIAV時不會產(chǎn)生明顯的臨床癥狀。由于該病原造成的免疫抑制等原因，往往會增加繼發(fā)感染的可能性，導致嚴重的經(jīng)濟損失[4]。目前對IBV和CIAV感染的研究比較多，ChPV的病例雖然較少卻也偶見報道。但至今未見三者共感染病例。本研究從表現(xiàn)出呼吸癥狀以及腹瀉癥狀的病死雞體內(nèi)檢測到IBV、CIAV和ChPV，表明現(xiàn)階段福建省內(nèi)部分雞群存在ChPV、CIAV、IBV的共感染，可為后續(xù)福建省內(nèi)開展相關(guān)病原研究及流行病學提供參考?！厩叭搜芯窟M展】不同病毒的共感染可能會對機體造成更嚴重的影響。當前，IBV與其他病原的共感染已然成為常態(tài)[5]。Erfan等[6]的研究表明，在感染CIAV的前提下，再發(fā)生IBV感染時會加劇病情及延長發(fā)病持續(xù)時間，二者的共同感染可能會促進IBV的傳播和進化。與此同時，CIAV在國內(nèi)有較高的發(fā)生率，Yao Shuai等[7]的研究表明在2014—2015年間，國內(nèi)的CIAV的陽性率為13.30%，和其他病毒的混合感染是主要的感染類型，占總感染的55.56%。李岳等[8]的研究也得到類似的結(jié)果，國內(nèi)部分地區(qū)（13個省市）CIAV的陽性檢出率為14.43%，和其他病毒的混感占感染總量的52.94%。當前國內(nèi)缺乏ChPV的流行病學數(shù)據(jù)，Zhang等[9]對中國廣西壯族自治區(qū)的ChPV發(fā)病情況進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，ChPV在廣西的商品雞場中普遍存在（51.73%），在所有陽性樣本中，從肉雞中檢測到的頻率最高（64.18%），其次是種雞和蛋雞，相較于封閉式雞舍，飼養(yǎng)在開放式雞舍中的雞群更容易感染ChPV?！颈狙芯壳腥朦c】2021年1月，福建省南平市某肉雞養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)的60～90日齡辰山牧雞（南平地區(qū)本土品種）開始出現(xiàn)以呼吸道癥狀為主、并伴有腹瀉情況的病情。根據(jù)臨床表現(xiàn)及剖檢觀察，初步診斷為IBV感染。該養(yǎng)殖戶同一場地多批次飼養(yǎng)，每批雞都進行過常規(guī)的IBV免疫，每批次雞飼養(yǎng)至60～90日齡時均會出現(xiàn)類似的病癥，該場通過使用抗病毒藥物有效減少了雞只死亡。根據(jù)流行病學特點、臨床表現(xiàn)及剖檢觀察，初步診斷為IBV感染，具體病因有待進一步探明?！緮M解決的關(guān)鍵關(guān)題】為了進一步明確具體病因，對南平市該養(yǎng)殖戶送檢的病料進行分子生物學檢測，明確病原，為該病的防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源與采集

發(fā)病雞由福建省南平市某肉雞養(yǎng)殖戶提供，病雞臨床表現(xiàn)為消瘦、咳嗽、喘氣，排綠色稀糞。采集病雞肝、心、脾、肺、腎、小腸等器官，?20℃保存，備用。

1.2 主要試劑

EasyPure Viral DNA/RNA Kit、TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super M ix，北京全式金生物技術(shù)有限公司；universal DNA Purification Kit，天根生化科技（北京）有限公司；2×CataAmp High Fidelity PCR M ix，北京開拓賽思生物技術(shù)有限公司；pMC100-MB Top-cloning M ix，武漢齊美欣科生物技術(shù)有限公司；DH5α感受態(tài)細胞，本實驗室保存。

1.3 引物設(shè)計與合成

利用Oligo 7.0軟件，根據(jù)GenBank公布的雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）、雞傳染性喉氣管炎病毒（Laryngotracheitis virus，LTV）、雞 新 城 疫 病 毒（Newcastle disease virus，NDV）、傳染性法氏囊病毒（Infectiousbursal Disease virus，IBDV）、禽腎炎病毒（Avian nephritis virus，ANV）、禽腺病毒（Fow l adenovirus，F(xiàn)adV）、雞細小病毒（ChPV）基因序列，設(shè)計相應引物，參考相關(guān)文獻[10]設(shè)計雞傳染性貧血病病毒CIAV特異性引物（表1），引物委托尚亞生物技術(shù)（福州）有限公司合成。

表1 所用引物及其序列Tab le 1 Prim ersand sequences app lied

1.4 組織勻漿制備

用無菌的1×PBS溶液將臟器沖洗干凈后，稱取5 g組織，剪碎，加入20m L無菌1×PBS溶液；加入雙抗（每1m L組織勻漿加入2000 IU·m L?1青霉素和2000μg·m L?1鏈霉素）進行研磨，制成組織勻漿。將組織勻漿放置于4℃冰箱中，作用4 h；?70℃反復凍 融3次，6 000 r·m in?1，4℃離 心10 m in，取 上清，分裝備用。

1.5 細菌分離培養(yǎng)

無菌環(huán)境下，用接種環(huán)分別接觸肝、心、脾、肺、腎等臟器的深部組織并劃線接種于血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)箱過夜。

1.6 核酸提取

取處理好的組織勻漿，按照全式金DNA/RNA提取試劑盒操作說明提取核酸樣本，?20 ℃保存。并取部分核酸樣本，按照全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明，進行RT-PCR，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于?70℃保存。

1.7 PCR鑒定

以提取后的核酸樣本為模板，進行LTV、ChPV、FadV、CIAV的常規(guī)PCR；以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，進行IBV、IBDV、NDV、ANV的常規(guī)PCR。

PCR反應體系為20μL：10μL 2×ProTaqMaster M ix；4μL RNase FreeWater；4μL模板；上/下游引物各1μL。PCR反應條件：94℃預變性5m in；94℃45 s，53℃45 s，72℃45 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10m in，4℃保存。在反應結(jié)束后，PCR擴增產(chǎn)物使用1.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。并按照膠回收試劑盒操作說明，回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后送往福州尚亞生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.8 基因序列分析

應用PCR方法擴增ChPVNS1基因、IBVS1基因和CIAVVP1基因，將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的部分雞細小病毒參考株（33株）、3株火雞細小病毒（Turkey parvovirus，TuPV）參考株NS1基因，26株IBV參考株S1基因和36株CIAV參考株（表2）VP1基因序列進行比對；采用Mega7.0軟件的Neighbor Joining方法進行上述基因的遺傳進化樹繪制。

表2 雞細小病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性貧血病毒參考株Table 2 Reference strains of ChPV,IBV,and CIAV

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀和剖檢病變

臨床表現(xiàn)為呼吸急促，咳嗽，喘氣，排綠色稀糞。剖檢可見病雞消瘦，輸尿管堵塞嚴重，腎臟腫大，呈典型的“花斑腎”（圖1），腹氣囊渾濁，充斥大量氣泡；腸管蒼白且有腫脹（圖2）。

圖1 花斑腎Fig.1 Spotted K idney

圖2 腹氣囊及腸管病變Fig.2 Abdom inal air sac and bowel disease

2.2 細菌培養(yǎng)結(jié)果

血瓊脂平板上未發(fā)現(xiàn)細菌生長。

2.3 PCR擴增結(jié)果

使用1.0%凝膠，于125 V、299mA條件下電泳25m in。結(jié)果顯示（圖3），使用CIAV、IBV、ChPV的特異性引物進行擴增，分別在675、215、937 bp處出現(xiàn)各自對應的條帶，與目的條帶大小一致。按照膠回收試劑盒（天根）操作說明，進行DNA純化回收，連接、轉(zhuǎn)化后，將菌液送往福州尚亞生物技術(shù)有限公司測序，利用Blast將測序結(jié)果進行對比，本研究測定的毒株與IBV的同源性為76.9%～84.3%，將其命名為FJNP210113；與CIAV的同源性為91.19%～92.14%，將其命名為FJ2101；與ChPV的同源性為92.17%～100%，將其命名為ChPV-FJNP。

圖3 PCR擴增結(jié)果Fig.3 PCR am p lification results

2.4 遺傳進化分析

登錄NCBI，用Blast對ChPVNS1基因核苷酸序列進行同源性分析（圖略），結(jié)果顯示，ChPV-FJNP分離株與26株中國參考株的同源性為92.17%～100%；與美國參考株ChPV-736的同源性為95.58%，與2株匈牙利參考株ChPV-ABU-84、ChPV-ABU-P1的同源性分別為93.87%、97.73%；與3株韓國參考株的同源性為93.14%～93.25%；與巴西參考株的同源性為96.18%；與火雞細小病毒（TuPV）的同源性為77.04%～77.48%。應用MEGA7.0軟件的Neighbor Joining方法構(gòu)建遺傳ChPVNS1基因進化樹（圖4），從圖中可見，ChPV-FJNP與中國廣西參考株ChPVGX-CH-28處于同一分支，與中國廣西參考株ChPVGX-CH-12、ChPV-GX-CH-9、ChPV-GX-CH-17、ChPVGX-CH-19、ChPV-GX-CH-25和韓國參考株ADL120035、ADL120686處于同一大分支。

圖4 ChPV NS 1基因遺傳進化樹分析Fig.4 Phylogenetic analysis on ChPV NS1 gene

用Blast對IBV FJNP210113株S1基因核苷酸序列進行同源性分析發(fā)現(xiàn)，IBV FJNP210113株與參考株LDT3的同源性為84.1%；與參考株GI-19、參考株LX4、參考株QX的同源性分別為82.9%、82.6%、83.1%；與參考株TW I的同源性為81.1%，表明FJNP210113株S1基因發(fā)生了較大變化。應用同上方法構(gòu)建S1基因核苷酸序列遺傳進化樹（圖5），發(fā)現(xiàn)IBV分離株FJNP210113與參考株KT852992（LDT3）的遺傳距離最近。

圖5 IBV S1基因遺傳進化樹Fig.5 Genetic evolutionary tree of IBV S1 gene

CIAV分離株FJ2101進行的Blast分析結(jié)果（圖略）顯示，分離株FJ2101與參考株GX1904P的同源性為92.6%，與參考株SD1502的同源性為92.1%，與參考株HLJ15165的同源性為91.5%?；贑IAVVP1基因的遺傳進化分析結(jié)果（圖6）顯示，分離株FJ2101處于單獨的一個分支，表明該分離株與現(xiàn)有參考株的親緣關(guān)系較遠，可能發(fā)生了變異。

圖6 CIAV VP1基因遺傳進化樹Fig.6 Genetic evolutionary tree of CIAV VP1 gene

3 討論

CHACóN等[11]從表現(xiàn)出呼吸及腹瀉癥狀的肉雞腸道中分離到2株IBV毒株，通過回歸實驗證實，可以在腸道、腎臟等多個器官中檢測到分離的毒株，表明同一種基因型/血清型的病毒可能表現(xiàn)出不同的組織嗜性和多種病理表現(xiàn)型，從腸道中分離到的毒株沒有對腸道細胞造成明顯的損傷，除了表現(xiàn)明顯的呼吸道癥狀以外，并沒有表現(xiàn)出腹瀉癥狀。因此，分離株FJNP210113或許只是導致病雞發(fā)生呼吸道癥狀的原因。目前我國主要的流行IBV基因型是QX型[12]，最早是王玉東等[13]在表現(xiàn)為腺胃腫大的病雞身上分離。除了表現(xiàn)腺胃腫大以外，QX型IBV也能導致呼吸系統(tǒng)疾病、生殖道以及腎臟疾病。然而從遺傳進化樹可以得知，分離株FJNP210113不屬于QX型，也不屬于該養(yǎng)殖戶使用的疫苗株（H120），基于分支上來看，本研究中的分離株處于LDT3基因型和TWⅠ基因型之間，表明分離株的S1基因已經(jīng)發(fā)生了改變。

雞傳染性貧血病毒能夠引起雞群的免疫抑制的發(fā)生，是造成免疫失敗的原因之一，該病毒的傳播方式包括垂直傳播和水平傳播兩種途徑[14]。有研究表明，病毒誘導的免疫抑制在IBV的流行過程中發(fā)揮重要作用，在免疫力降低的前提下，發(fā)生IBV感染時，能夠產(chǎn)生更嚴重和持續(xù)的臨床癥狀和病變[15]。Kum iko等[16]的研究也證實這一點，CIAV和IBV共感時，雛雞死亡率會顯著升高。本研究中該養(yǎng)殖戶死淘率偏高或許與此有關(guān)，感染CIAV后導致雞群發(fā)生免疫抑制，加劇了其他病原感染程度，使得病程更持久，死亡數(shù)量增加。至于為何在按照正常免疫程序進行免疫后該場依然多次爆發(fā)雞傳染性支氣管炎的原因，可能是場地消毒不徹底，春季溫差較大，以及該場所使用的疫苗株（H120）與該場爆發(fā)的IBV毒株之間交叉保護力低的緣故。本研究中，CIAV分離株FJ2101處于一個獨立的分支，表明該分離株可能發(fā)生了變異，其原因有待進一步研究。

ChPV的傳播方式與CIAV一樣，在雞群中也是通過垂直傳播[17]和水平傳播兩種方式，病雞是否表現(xiàn)出相應的癥狀及病理表現(xiàn)主要和腸道內(nèi)的病毒載量的高低有關(guān)[18]。當雞群受到ChPV感染時，臨床上主要表現(xiàn)出腹瀉、泄殖腔附近有糞便粘連、嗜睡、精神沉郁、羽毛雜亂、矮小和發(fā)育遲緩等癥狀，但是不會引起腸道宏觀上明顯的病變，因此需要注意ChPV和其他病毒或者細菌的共感染[19]。由于ChPV在體外不易分離，在雞群中檢測ChPV通常是通過發(fā)現(xiàn)病毒DNA。通常認為，ChPV的靶細胞位于腸道，但是在病雞的法氏囊、脾臟、胸腺等免疫器官中也能檢測到病毒核酸[20]。該病例中ChPV的存在可能是產(chǎn)生腹瀉的原因之一。ChPV能夠?qū)δc道細胞造成損傷，繼而產(chǎn)生嚴重的腹瀉。由遺傳進化分析樹可知，不同地區(qū)之間的ChPV差異并不明顯，表明ChPV之間的差異可能和地域無關(guān)。目前缺乏合適的培養(yǎng)體系，NU?EZ等[21]通過雞胚卵黃囊途徑連續(xù)盲傳三代，胚體出現(xiàn)明顯病變，并從胚體和卵黃中分離到ChPV。高倩文等[22]采用同樣的卵黃囊途徑接種，未能從胚體和卵黃中檢測到病毒，推測在混感情況下，其他病毒的存在可能會對ChPV的復制造成干擾。本研究從病料中鑒定出ChPV后，曾將組織勻漿通過尿囊腔途接種10日齡SPF雞胚，試圖對ChPV進行分離，結(jié)果雞胚出現(xiàn)了死亡，胚體也表現(xiàn)出水腫、出血、發(fā)育不良等癥狀，然而卻未能從尿囊液和胚體上檢測到ChPV的核酸。目前還沒有針對這3種病原的特效藥物，該養(yǎng)殖戶通過使用某些抗病毒藥物降低了該場的死淘率，或許是因為抗病毒藥物能夠干擾腸道中ChPV的復制，使病雞腸道逐漸恢復了正常功能，減少了雞只死亡。

本研究從送檢的病雞中檢測到CIAV、ChPV以及IBV，初步判斷該場發(fā)病的原因是由于3種病原共感染導致。然而這3種病毒是否是本病的確切病原，ChPV和CIAV在本病例中具體發(fā)揮什么作用，以及抗病毒藥物是否能夠?qū)hPV的復制過程起到干擾，還需要進行動物回歸試驗進行驗證。

本研究首次報道了ChPV、IBV、CIAV等3種病原的共感染病例，為福建省ChPV、IBV、CIAV的流行病學研究和防控提供了參考。