張俊民，盧成志，薛志孝，蘇司穎，劉尚忠

高血壓為常見心血管疾病，全球高血壓患者已超過10億人。即便嚴(yán)格使用降壓藥物治療，仍有15%～18%的患者會發(fā)展為難治性高血壓［1］。血壓控制不良會對高血壓患者的器官（如心臟、大腦和腎臟）造成繼發(fā)性損傷，患者預(yù)后較差。適當(dāng)?shù)难獕嚎刂瓶梢燥@著降低心血管疾病的發(fā)生率?，F(xiàn)階段控制血壓的方法除藥物治療以外，還有腎動脈去交感神經(jīng)術(shù)（RDN）［2］。RDN是一種通過離斷腎交感傳出及傳入神經(jīng)的方式來降低交感神經(jīng)活性，抑制腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)激活，進而治療難治性高血壓的新興微創(chuàng)介入技術(shù)。脈沖電場消融運用不可逆電穿孔技術(shù)（irreversible electroporation，IRE），具有消融迅速、消融區(qū)域可控、靶向性強、不損傷其他組織的特點，在腫瘤消融中療效顯著［3］，但結(jié)合RDN消融腎動脈交感神經(jīng)的研究尚少見。本研究以高頻脈沖電場消融腎動脈交感神經(jīng)為切入點，通過細胞消融實驗及巴馬香豬腎動脈神經(jīng)消融實驗，探究腎動脈交感神經(jīng)最佳消融參數(shù)范圍，以及IRE結(jié)合RDN消融巴馬香豬腎動脈交感神經(jīng)的有效性及安全性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞 人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心，大鼠胸大動脈平滑肌細胞A7r5購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院分子干細胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，均由本實驗室凍存使用。

1.1.2實驗動物 巴馬香豬4只購自天津裕達實驗動物養(yǎng)殖有限公司，分別標(biāo)注為1號：月齡3個月，30 kg，雌性；2號：月齡5個月，90 kg，雄性；3號：月齡4個月，70 kg，雌性；4號：月齡4個月，67 kg，雄性；均在屏障環(huán)境下飼養(yǎng)7～15 d后進行實驗。

1.1.3實驗試劑及儀器 MTT檢測試劑盒、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、Masson染色試劑盒及Warthin-starry銀染色液購自北京索萊寶科技有限公司；鹽酸賽拉嗪注射液（陸眠寧，2 mL：0.2 g；批號：20191001）購自吉林省華牧動物保健品有限公司；咪達唑侖注射液（力月西，1 mL：5 mg；批號：MZ200209）購自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司；丙泊酚注射液（1 mL：10 mg；批號：12002373）、二甲基亞砜（DMSO）購自默克醫(yī)藥生物科技公司。磷酸鹽緩沖液（PBS）、RPMI 1640液體培養(yǎng)基、酶聯(lián)免疫吸附測定儀購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自思拓凡生物科技（杭州）有限公司。第二代脈沖場消融治療儀YLT-PFA01購自天津鷹泰利安康醫(yī)療科技有限責(zé)任公司；倒置顯微鏡、正置顯微鏡購自日本Olympus公司；Leica SCN400玻片掃描系統(tǒng)購自德國Leica公司。電極杯購自美國BTX公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 平滑肌細胞A7r5使用含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液、89%DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；神經(jīng)細胞SH-SY5Y使用含15%FBS、1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液、84%RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.2.2IRE脈寬分組 本研究脈寬設(shè)置有單脈沖、長脈沖、雙向脈沖（包括對稱及不對稱2種方式）。對稱脈沖的正負脈沖脈寬相同；不對稱脈沖的脈寬用P-Dp-N-Dn表示，P為正脈沖脈寬，Dp為正脈沖延時，N為負脈沖脈寬，Dn為負脈沖延時。2種細胞均設(shè)置對照組（不進行電擊）以及實驗組，實驗組根據(jù)不同脈沖模式分組：脈寬為5μs的單脈沖組、雙向脈沖5-5-5-5組、雙向脈沖5-3-3-5組、雙向脈沖7-3-3-7組和長脈沖組。

1.2.3細胞消融與殺傷效果檢測 收集對數(shù)生長期細胞，調(diào)整密度為2×105個/mL，吸取600μL至電極杯，電極杯連接脈沖電場消融儀正負電極并固定，電壓設(shè)置100～700 V，間隔200 V，脈沖個數(shù)為500，進行IRE消融細胞，見圖1。消融完成后立即分5次，每次將電擊杯中100μL懸濁液移入96孔板，剩余棄去，每組設(shè)置2個復(fù)孔，設(shè)置空白組（僅加入培養(yǎng)液）。培養(yǎng)箱孵育24 h，倒置顯微鏡觀察細胞貼壁。細胞貼滿后每孔加入10μL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，吸去70μL孔內(nèi)培養(yǎng)液，再加入50μL DMSO溶液，溶解10～15 min后采用酶聯(lián)免疫吸附測定儀490 nm處檢測各孔的光密度（OD）值。通過細胞存活率評價殺傷效果。存活率=（a-c）/（b-c）×100%。其中a為實驗組OD值；b為對照組OD值；c為空白組OD值。本研究以存活率達到0為完全消融，存活率未達到0為未完全消融，倒置顯微鏡下觀察消融后A7r5平滑肌細胞和SH-SY5Y神經(jīng)細胞，比較細胞形態(tài)變化。

Fig.1 Shock process of SH-SY5Y cells and A7r5 cells by pulsed electric field ablation instrument圖1 脈沖電場消融儀電擊SH-SY5Y細胞和A7r5細胞過程

1.2.4IRE消融巴馬香豬腎動脈交感神經(jīng) 每只巴馬香豬分別設(shè)置消融參數(shù)及部位，見表1。1、2號豬右腎動脈為對照（不電擊），僅做切片染色觀察。根據(jù)巴馬香豬體質(zhì)量，對其實行術(shù)前靜脈注射麻醉，術(shù)中靜脈滴注保持麻醉以減少抽搐，麻醉藥品及劑量見表2。豬取仰臥位行股動脈穿刺，以股動脈內(nèi)側(cè)0.5 cm與腹股溝皮折線交點為穿刺點，30°～45°角進針，成功后保持穿剌針原位不動，送入導(dǎo)絲，固定導(dǎo)絲退出穿刺針，沿著導(dǎo)絲送入鞘管，引導(dǎo)消融電極進入腎動脈內(nèi)目標(biāo)消融點。固定鞘管拔出導(dǎo)絲，肝素鹽水沖管。

Tab.1 Parameter of renal artery sympathetic nerve of Alabama Swine by IRE表1 IRE消融巴馬香豬腎動脈交感神經(jīng)參數(shù)

Tab.2 Narcotic drugs and dosage表2 麻醉藥品及劑量

1.2.5消融腎動脈組織切片染色 消融腎動脈組織經(jīng)固定、脫水、組織包埋與切片后，采用HE染色、Masson染色及Warthin-starry銀染色，掃描載玻片并進行數(shù)字成像掃描觀察。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS及origin pro 2019軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 消融后細胞觀察 顯微鏡下觀察可見A7r5和SH-SY5Y細胞形態(tài)隨電壓的改變發(fā)生變化，電壓在100～300 V時，2種細胞多數(shù)正常存活，少量凋亡呈圓形。電壓500 V時，A7r5細胞已接近全部凋亡，電壓700 V時，SH-SY5Y細胞接近全部凋亡，見圖2。

2.2 IRE消融A7r5和SH-SY5Y細胞效果 電壓500 V時，A7r5細胞在各脈沖模式下均未完全消融，單脈沖與長脈沖細胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但低于雙向脈沖5-5-5-5（P＜0.05）；雙向脈沖5-5-5-5、5-3-3-5、7-3-3-7細胞存活率依次升高（P＜0.05）；SH-SY5Y細胞在各脈沖模式下均未完全消融，且細胞存活率均顯著高于同類型脈沖下A7r5細胞（P＜0.01），見表3。電壓700 V時，2種細胞在各脈沖模式下均未完全消融，A7r5細胞平均存活率接近5%，雙向脈沖5-3-3-5消融后細胞存活率高于雙向脈沖5-5-5-5（P＜0.05），其余脈沖模式下細胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。A7r5細胞在雙向脈沖模式下，細胞存活率低于SH-SY5Y細胞（P＜0.01），在單脈沖和長脈沖模式下差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

2.3 巴馬香豬腎動脈消融效果 1、2號豬消融過程中發(fā)生輕微抽搐，未影響實驗，3號、4號豬消融過程穩(wěn)定。3號豬右腎動脈消融組織HE染色可見靜脈血管壁纖維化，動脈局灶外膜、中膜斷裂，管壁纖維化，局部內(nèi)皮受損，血栓形成，見圖3A；Masson染色可見動脈血管壁呈綠色，纖維化，見圖3B。3號豬左腎動脈消融組織HE染色可見靜脈淤血，管壁纖維化，血管內(nèi)皮細胞增生，灶性壞死，見圖3C；Masson染色血管平滑肌可見血管壁局部呈綠色，纖維化，局部內(nèi)膜纖維化，見圖3D。1號豬右腎動脈HE染色可見小動脈管壁纖維化，局部彈力纖維斷裂，形態(tài)較完整，圖3E；Masson染色可見血管壁纖維化，形態(tài)較完整，見圖3F。4號豬左腎動脈消融后Warthin-starry銀染色交感神經(jīng)組織呈淺褐色，神經(jīng)細胞不可見，神經(jīng)組織遭破壞，見圖3G、H。2號豬800 V消融左腎動脈Warthin-starry銀染色交感神經(jīng)組織淺褐色，神經(jīng)細胞不可見，見圖3I。2號豬右腎動脈Warthinstarry銀染色可見大量棕黑色神經(jīng)細胞，交感神經(jīng)組織未破壞，見圖3J、K、L。

Fig.2 The morphology of A7r5 cells and SH-SY5Y cells under different voltages observed by confocal microscope(×100)圖2 顯微鏡觀察不同電壓下A7r5細胞及SH-SY5Y細胞形態(tài)（×100）

Tab.3 Comparison of survival rates ablated by IRE at 500 V under various pulse modes between A7r5 cells and SH-SY5Y cells表3 電壓500 V IRE各脈沖模式下消融A7r5細胞及SH-SY5Y細胞存活率比較 （n=8，%，±s）

Tab.3 Comparison of survival rates ablated by IRE at 500 V under various pulse modes between A7r5 cells and SH-SY5Y cells表3 電壓500 V IRE各脈沖模式下消融A7r5細胞及SH-SY5Y細胞存活率比較 （n=8，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與單脈沖比較，c與長脈沖比較，d與雙向脈沖5-5-5-5比較，e與雙向脈沖5-3-3-5比較，P＜0.05

組別A7r5 SH-SY5Y t對照組100.00±1.64 100.00±1.99單脈沖3.67±0.41a 51.18±2.94a 50.612＊＊長脈沖4.51±1.27a 22.86±5.32ab 9.492＊＊雙向脈沖5-5-5-5 11.36±1.68abc 87.98±6.12abc 34.125＊＊雙向脈沖5-3-3-5 42.83±0.90abcd 80.99±3.54abcd 29.523＊＊雙向脈沖7-3-3-7 64.33±2.19abcde 76.06±1.98abcd 11.240＊＊F 5 626.540＊＊408.070＊＊

Tab.4 Comparison of survival rates ablated by IRE at 700 V under various pulse modes between A7r5 cells and SH-SY5Y cells表4 電壓700 V IRE各脈沖模式下消融A7r5細胞及SH-SY5Y細胞存活率比較 （n=8，%，±s）

Tab.4 Comparison of survival rates ablated by IRE at 700 V under various pulse modes between A7r5 cells and SH-SY5Y cells表4 電壓700 V IRE各脈沖模式下消融A7r5細胞及SH-SY5Y細胞存活率比較 （n=8，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與單脈沖比較，c與長脈沖比較，d與雙向脈沖5-5-5-5比較，e與雙向脈沖5-3-3-5比較，P＜0.05

組別A7r5 SH-SY5Y t對照組100.00±1.64 100.00±1.99單脈沖5.29±2.41a 4.74±0.88a 0.092長脈沖5.45±1.54a 4.23±0.30a 2.195雙向脈沖5-5-5-5 3.58±2.51a 24.62±5.89abc 9.290＊＊雙向脈沖5-3-3-5 7.54±2.21ad 11.42±0.77abcd 5.758＊＊雙向脈沖7-3-3-7 3.05±1.42a 14.77±3.21abcd 9.447＊＊F 1 973.530＊＊1 566.370＊＊

Fig.3 The renal arterial tissue ablated by IRE圖3 IRE消融腎動脈組織染色

3 討論

在難治性高血壓的病理生理過程中，腎臟交感神經(jīng)系統(tǒng)起關(guān)鍵作用，超過75%的交感神經(jīng)分布在距血管內(nèi)膜4.28 mm以內(nèi)［4-5］，易發(fā)生消融不完全的情況。目前去交感神經(jīng)術(shù)大多使用導(dǎo)管射頻消融，同時破壞雙側(cè)腎臟的部分傳入和傳出神經(jīng)，降低整個機體交感系統(tǒng)的活性［6］。射頻消融采取熱效應(yīng)原理，手術(shù)過程中有可能會出現(xiàn)細胞殘余，導(dǎo)致消融失效、高血壓復(fù)發(fā)，需二次消融的情況［7］。研究表明，IRE是一種通過極短的強力電場使細胞膜產(chǎn)生永久性穿孔的組織消融技術(shù)，可通過破壞細胞穩(wěn)態(tài)引導(dǎo)細胞凋亡［3］。IRE不產(chǎn)熱，并具有良好的組織專一性和清晰的消融范圍邊界，現(xiàn)已應(yīng)用于胰腺癌、前列腺癌等腫瘤消融［8-9］。研究表明，不同細胞在IRE中的消融閾值不同［10］。為探究最佳消融參數(shù)范圍，本研究分析了SH-SY5Y和A7r5細胞在不同消融參數(shù)下的存活率，通過調(diào)整脈沖類型和電壓參數(shù)，篩選出對腎動脈血管損傷小且對神經(jīng)組織殺傷效果較好的參數(shù)組。顯微鏡下觀察A7r5細胞及SH-SY5Y細胞發(fā)現(xiàn)，凋亡細胞數(shù)量隨電壓升高而增加，與對照組相比，不同脈沖類型IRE在不同電壓下均對A7r5細胞及SH-SY5Y細胞有殺傷效果，且電壓達到特定閾值后，細胞平均存活率可降至15%以下水平，表明高頻脈沖電場可以消融A7r5細胞及SH-SY5Y細胞。電壓500 V時，A7r5細胞存活率平均水平除雙向脈沖7-3-3-7模式以外，均降至50%以下，SH-SY5Y細胞存活率在2種不對稱脈沖中無明顯差異，而單脈沖、長脈沖的殺傷力明顯強于雙向不對稱脈沖。電壓700 V時，A7r5細胞存活率平均水平在5%左右，接近完全消融，除在雙向脈沖5-3-3-5細胞存活率較高以外，余各脈沖模式下無明顯差異；SH-SY5Y細胞除在雙向脈沖5-5-5-5細胞存活率較高以外，余模式下存活率平均水平均降至15%以下。A7r5細胞和SH-SY5Y細胞在單脈沖和長脈沖模式下存活率無明顯差異，細胞殺傷力最強。此外，除在700 V時單脈沖和長脈沖以外，余參數(shù)下SH-SY5Y細胞存活率均顯著高于A7r5細胞，可見SH-SY5Y細胞在消融過程中耐電性強于A7r5細胞，雙向脈沖5-3-3-5對A7r5細胞損傷較小，且對SH-SY5Y細胞的消融效果較好。

脈沖電場對肌肉神經(jīng)直接刺激，可造成強勁的肌肉收縮，能量越高，刺激越強，消融時需使用肌松劑配合，以減少消融過程中的肌肉收縮，防止造成抽搐［11］。在腹部腫瘤行IRE術(shù)時，單脈沖及長脈沖可造成不同程度肌肉收縮，導(dǎo)致電極針位移，不僅影響消融效果，電極針也會引起痛感、損傷器官［12］。減少肌肉收縮需大量使用肌肉松弛劑，而大量使用肌松劑有造成橫紋肌溶解的風(fēng)險［13］。為避免上述情況，有研究發(fā)現(xiàn)使用高頻雙向5-5-5-5脈沖配合肌松劑可以消融前列腺癌，且相比單脈沖和長脈沖能緩解肌肉收縮，提高安全性［14］。本研究所有脈沖類型均可以消融豬腎動脈交感神經(jīng)，消融效果得到保證，在使用肌松劑的情況下，雙向脈沖5-5-5-5模式仍造成豬輕微抽搐，但雙向不對稱5-3-3-5脈沖和雙向不對稱7-3-3-7消融過程更為平穩(wěn)。電壓700 V時，2種細胞分別在雙向脈沖5-3-3-5和雙向脈沖7-3-3-7的存活率無明顯差異，消融效果一致，但雙向5-3-3-5脈寬能量更低，造成肌肉收縮風(fēng)險更低，因此雙向不對稱脈沖5-3-3-5為消融最優(yōu)參數(shù)組。

綜上所述，高頻脈沖電場對腎動脈神經(jīng)組織有明顯殺傷力，可有效消融豬腎動脈交感神經(jīng)，且雙向不對稱脈沖5-3-3-5可提高手術(shù)的安全性。