袁爍，劉湘云，張家旗，鄧高丕△

氧濃度的改變是妊娠滋養(yǎng)細胞增殖與侵襲的重要條件。在妊娠早期，低氧狀態(tài)介導的滋養(yǎng)層分化與生物學效應對維系妊娠至關重要［1］。低氧狀態(tài)會刺激滋養(yǎng)細胞入侵母體子宮內膜，并影響子宮壁動脈血管的重塑［2］。若妊娠早期滋養(yǎng)細胞因活性氧生成與抗氧化防御系統(tǒng)之間的不平衡導致氧化應激，造成滋養(yǎng)細胞入侵不足，可能會導致各種妊娠相關疾病，如子癇前期、宮內生長受限或流產等的發(fā)生［3-5］。有研究報道，物理低氧條件（8%O2）可誘導缺氧誘導因子（HIF）-1α上調，促進絨毛外滋養(yǎng)細胞分化與侵襲、遷移能力增強［6］；化學低氧條件［250μmol/L二氯化鈷（CoCl2）］可激活滋養(yǎng)細胞自噬途徑并介導基質金屬蛋白酶（MMP）-9上調和細胞內腺苷三磷酸（ATP）增多［7］。目前，有關不同濃度CoCl2對滋養(yǎng)細胞增殖的干預效應，以及CoCl2的濃度梯度對滋養(yǎng)細胞中HIF-1α、血管內皮生長因子（VEGF）、MMP-9、基質金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）蛋白表達的影響鮮有報道。本研究旨在探討CoCl2的濃度變化對滋養(yǎng)細胞系HTR-8/SVneo細胞增殖及蛋白表達的影響，為妊娠相關疾病的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 滋養(yǎng)細胞株HTR-8/SVneo細胞購自美國ATCC細胞庫（批號：CRL-3271）；南美胎牛血清購自武漢普諾賽（Procell）生命科技有限公司（批號：201909）；胰酶（批號：25200072）、DMEM/F12培養(yǎng)基（批號：C11995500BT）購自美國Gibco公司；CCK8試劑盒購自日本同仁公司（批號：CK04）；兔源HIF-1α一抗購自英國Abcam公司（批號：ab51608）；GAPDH抗體（批號：5174s）、兔源VEGF一抗（批號：3408s）、兔源MMP-9一抗（批號：13667s）購自美國CST公司；鼠源TIMP-1一抗購自美國R&D公司（批號：MAB970）。山羊抗鼠IgG（H+L）、山羊抗兔IgG（H+L）二抗均購自英國Jackson Immuno Research公司（批號分別為113035003、111035003）。CoCl2購自美國Sigma公司（批號：232696）。CO2培養(yǎng)箱（NBS公司）；超凈工作臺（東莞美維凈化設備有限公司）；細胞計數(shù)儀（美國Nexcelom公司）；常溫離心機、高速冷凍離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀、轉膜儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2細胞培養(yǎng) 選取生長狀態(tài)良好的HTR8/SVneo細胞，加入含EDTA的0.25%胰酶消化，1～2 min后加入DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，收集細胞懸液離心，離心機轉速為900 r/min，時間為5 min，離心后棄上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸為約1×106個/mL的細胞懸液繼續(xù)培養(yǎng)，每隔24～48 h換液。

1.3化學低氧狀態(tài)的藥物制備 參考相關文獻［8-9］，擬定適宜誘導低氧環(huán)境的CoCl2培養(yǎng)基母液的濃度梯度。將化學缺氧劑CoCl2加入胎牛血清中稀釋，配置成終濃度為50、100、200、400、800、1 000和1 200μmol/L的母液，用于模擬細胞低氧微環(huán)境。

1.4CCK8法檢測不同時間點細胞增殖情況 按1.3的濃度配置分組，另設立空白組，共8組，以1×104個/孔的細胞接種于96孔板，加入不同濃度梯度的CoCl2培養(yǎng)基母液，每組設3個復孔，培養(yǎng)24 h和48 h。每孔加入10μL CCK8，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，用FC型酶標儀于450 nm波長處檢測光密度（OD）值。實驗重復3次。根據(jù)實驗結果，結合顯微鏡下細胞形態(tài)改變，以細胞增殖程度適中作為原則，選擇最合適的時間點與梯度最適中的3個濃度作為CoCl2低、中、高濃度組，進行后續(xù)實驗。

1.5Western blot法檢測CoCl2低、中、高濃度組HIF-1α、VEGF、MMP-9、TIMP-1的蛋白表達量 HTR-8/SVneo細胞與相應濃度的CoCl2培養(yǎng)基共培養(yǎng)48 h后，PBS洗滌，細胞裂解液、超聲破碎儀處理，取上清液，檢測細胞表達的蛋白濃度，電泳并轉膜，PBS清洗PVDF膜10 min，加入5%脫脂牛奶，置于室溫中封閉1 h后，加入HIF-1α、VEGF、MMP-9、TIMP-1一抗，稀釋比例為均1∶1 000，4℃孵育過夜，洗膜后添加二抗IgG（1∶5 000），37℃孵育1 h，洗膜，顯色，曝片，Quantity One圖像分析軟件計算各蛋白與內參GAPDH灰度值的比值。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Bonferroni校正t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 低氧狀態(tài)下不同時間點HTR-8/SVneo細胞增殖情況與形態(tài)變化 與空白組相比，CoCl2作用于HTR-8/SVneo細胞24 h后，濃度達200μmol/L時較100μmol/L時OD值略下降；達400μmol/L后隨濃度增加，OD值上升。CoCl2作用于HTR-8/SVneo細胞48 h后，OD值隨濃度增加而上升；同一CoCl2濃度作用下，作用48 h較作用24 h的OD值均上升，見圖1。CoCl2各濃度組作用24 h及48 h后，HTR-8/SVneo細胞形態(tài)的改變隨濃度變化顯現(xiàn)出差異，但不同作用時間下同一濃度，細胞形態(tài)差異不明顯。0μmol/L CoCl2組細胞形態(tài)以多邊形、梭形為主，伸展良好，呈上皮樣細胞表現(xiàn)；隨著CoCl2濃度的增加，細胞密度均逐漸增加；400μmol/LCoCl2組細胞呈梭形、類圓形，細胞飽滿，胞漿豐富，部分聯(lián)合成片；800、1 000、1 200μmol/LCoCl2組細胞逐漸密集，同時見核固縮及縮小的死亡細胞。鏡下細胞形態(tài)變化見圖2、3。選擇作用時間為48 h，擬定CoCl2100μmol/L為CoCl2低濃度組，200μmol/L為CoCl2中濃度組，400μmol/L為CoCl2高濃度組，進行后續(xù)實驗。

2.2 CoCl2低、中、高濃度組細胞HIF-1α、VEGF、MMP-9、TIMP-1蛋白表達情況 與空白組相比，CoCl2低、中、高濃度組的HIF-1α、MMP-9的蛋白表達水平和MMP-9/TIMP-1比值逐步上調（P＜0.05）；與空白組相比，CoCl2低、中、高濃度組的TIMP-1蛋白表達水平下降（P＜0.05），但隨著CoCl2濃度增加而呈上升趨勢；與空白組相比，CoCl2低濃度組的VEGF的蛋白表達水平下調，CoCl2中、高濃度組的VEGF的蛋白表達水平上調（P＜0.05），見表1、圖4。

Fig.1 The proliferation of HTR-8/SVneo cells after treatment with different concentrations of CoCl2 for 24 h and 48 h圖1 CoCl2各濃度組作用24 h和48 h后HTR-8/SVneo的細胞增殖情況

Fig.2 Proliferation of HTR-8/SVneo cells after treatment with different concentrations of CoCl2 for 24 h(×200)圖2 CoCl2各濃度組作用24 h后HTR-8/SVneo細胞增殖情況（×200）

Fig.3 Proliferation of HTR-8/SVneo cells after treatment with different concentrations of CoCl2 for 48 h(×200)圖3 CoCl2各濃度組作用48 h后HTR-8/SVneo細胞增殖情況（×200）

Tab.1 The effects of different concentrations of CoCl2 on expression levels of HIF-1α,VEGF,MMP-9,TIMP-1 and MMP-9/TIMP-1表1 CoCl2各濃度組對HIF-1α、VEGF、MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1表達的影響 （n=3，±s）

Tab.1 The effects of different concentrations of CoCl2 on expression levels of HIF-1α,VEGF,MMP-9,TIMP-1 and MMP-9/TIMP-1表1 CoCl2各濃度組對HIF-1α、VEGF、MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1表達的影響 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a與空白組比較，b與CoCl2低濃度組比較，c與CoCl2中濃度組比較，P＜0.05

組別空白組CoCl2低濃度組CoCl2中濃度組CoCl2高濃度組F HIF-1α 0.378±0.003 0.402±0.007a 0.486±0.002ab 0.570±0.006abc 920.214＊VEGF 0.509±0.001 0.463±0.004a 0.618±0.004ab 0.620±0.005ab 1 312.614＊MMP-9 0.344±0.002 0.387±0.001a 0.626±0.003ab 0.690±0.007abc 5 355.389＊TIMP-1 0.886±0.003 0.737±0.003a 0.801±0.003ab 0.835±0.003abc 1 401.658＊MMP-9/TIMP-1 0.388±0.002 0.525±0.002a 0.782±0.003ab 0.827±0.009abc 5 471.943＊

Fig.4 The expression levels of HIF-1α,VEGF,MMP-9 and TIMP-1 protein detected by Western blot assay in different concentration of CoCl2 groups圖4 Western blot檢測CoCl2各濃度組HIF-1α、VEGF、MMP-9、TIMP-1蛋白表達水平

3 討論

在一個完整孕期中，滋養(yǎng)細胞的局部氧環(huán)境一直處于動態(tài)變化過程。在妊娠早期，局部的生理性低氧環(huán)境刺激滋養(yǎng)細胞，使其侵襲能力明顯增強［10］。當絨毛外滋養(yǎng)細胞通過侵襲效應在子宮內膜遷移，侵入子宮蛻膜，浸潤到子宮約1/3的肌層與血管后，螺旋動脈重塑，逐漸獲得血液供應，為胚胎建立適當?shù)臓I養(yǎng)和氧氣供應，滋養(yǎng)細胞局部氧濃度才隨之逐漸上升［11］。可見，胚胎著床與發(fā)育早期是在相對缺氧的環(huán)境下進行的。本研究以CoCl2作為化學缺氧誘導劑模擬體外低氧環(huán)境以研究滋養(yǎng)細胞的行為，從CoCl2濃度為0、50、100、200、400、800、1 000、1 200μmol/L的細胞增殖實驗中發(fā)現(xiàn)，作用時間為48 h，HTR-8/SVneo的細胞增殖隨濃度增加呈上升趨勢。在CoCl2濃度為100～400μmol/L時，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，細胞的增殖程度適中。

HIF-1α作為低氧狀態(tài)下的一種活性轉錄因子，參與機體對低氧環(huán)境和低氧反應的調節(jié)，影響滋養(yǎng)細胞在不同氧濃度狀態(tài)下的細胞活動［12］。低氧促進滋養(yǎng)層細胞的侵襲和血管生成，上調HIF-1α的表達，HIF-1α抑制劑抑制了滋養(yǎng)層細胞的侵襲和血管生成［2］。VEGF是HIF-1的靶標之一，以低氧環(huán)境為介質，刺激血管內皮細胞增生，促進新生血管形成，故而在受精卵著床、胎盤血管形成、胎兒的生長發(fā)育等妊娠過程的多個階段有重要作用。有研究報道，低氧狀態(tài)下（300μmol/L CoCl2），HTR-8/SVneo細胞中VEGF和MMP-9的mRNA和蛋白表達水平同向上調，影響HTR-8/SVneo細胞的遷移、侵襲和血管生成能力［13］。本研究結果表明，HIF-1α蛋白表達隨低氧濃度增加呈上升趨勢，表明本研究在HTR8/SVneo細胞中誘導了低氧反應，而VEGF在CoCl2中、高濃度組較空白組表達上調，與研究報道的低氧提高滋養(yǎng)細胞的VEGF表達水平結果一致［14］。新生血管形成和血管通透性增加是細胞對低氧狀態(tài)的一種代償性反應。CoCl2低濃度組VEGF不升反降，推測可能100μmol/L的CoCl2濃度尚未到達刺激滋養(yǎng)細胞中VEGF升高的閾值，而200μmol/L的CoCl2濃度達到了啟動VEGF對低氧應答調控的閾值。

MMPs是一個鋅依賴家族，通過參與降解細胞外基質而影響細胞侵襲能力，其表現(xiàn)出的蛋白水解活性與滋養(yǎng)細胞侵入子宮有關，MMP-9的減少是干擾妊娠早期螺旋動脈正常重構的原因之一［15］。有研究發(fā)現(xiàn)，HTR-8/SVneo細胞暴露于低氧（2%O2）條件下的遷移和侵襲性較常氧（20%O2）條件下增加，MMP-1、MMP-9表達顯著增加［16］。TIMPs是一組小分泌糖蛋白，以1∶1的比例抑制MMPs的激活。TIMP-1作為MMP-9的特異性抑制劑，可降低滋養(yǎng)細胞中MMP-9的表達水平［17］。對感染人巨細胞病毒的早孕絨毛細胞的研究發(fā)現(xiàn)，病毒可降低原代早孕滋養(yǎng)細胞MMP-9的表達，上調TIMP-1的表達，使MMP-9/TIMP-1比值下降，繼而削弱滋養(yǎng)細胞侵襲能力［18］。與妊娠相關的滋養(yǎng)細胞侵入屬于生理性的精準調控，故MMP-9表達增強時，TIMP-1亦會受到調節(jié)適當上調，以保持MMP-9/TIMP-1的動態(tài)平衡。有研究推論，這種動態(tài)平衡是胚胎著床后發(fā)揮類似腫瘤細胞的侵襲行為，但又有節(jié)制地僅浸潤至子宮肌層1/3以維持正常妊娠，而不發(fā)生滋養(yǎng)細胞疾病等侵襲性疾病的重要原因［19］。本研究結果表明，隨著CoCl2濃度的增加，MMP-9的表達上升，且呈濃度依賴性；TIMP-1的表達與空白組比較均下降，但隨CoCl2濃度增加而逐漸上升。這個結果看似矛盾，但TIMP-1的上升可能是對于MMP-9的上升做出的適應性反應，以維持兩者比值的動態(tài)平衡。低氧狀態(tài)下MMP-9/TIMP-1的比值隨著CoCl2濃度增加而上升，呈濃度依賴性，該比值的上升與促進滋養(yǎng)細胞侵襲力有關［20］。

綜上，本研究結果表明，化學模擬的低氧狀態(tài)可增強HTR-8/SVneo細胞的增殖，可通過HIF-1α的介導使VEGF的表達與MMP-9/TIMP-1比值上調。低氧狀態(tài)下滋養(yǎng)細胞的生物學行為與早期妊娠的生理狀態(tài)更加貼近，可為后續(xù)探索妊娠相關疾病的機制奠定實驗基礎。