朱文娟 魏友華 王 蕊 魏 莉 王志俊 山東省棗莊市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳與產(chǎn)前篩查科 277100

新生兒遺傳代謝病是指由于基因突變引起酶缺陷、細(xì)胞膜功能異?；蚴荏w缺陷，從而導(dǎo)致機(jī)體生化代謝紊亂，造成中間或旁路代謝產(chǎn)物蓄積或終末代謝產(chǎn)物缺乏而引起一系列臨床癥狀的一組疾病[1-2]。早期篩查、診斷、治療新生兒遺傳代謝疾病能夠有效降低新生兒出生缺陷，是我國(guó)出生缺陷三級(jí)防控體系的重要組成部分，是提高兒童健康水平和生活質(zhì)量的重要技術(shù)保證[3]。以串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)為代表新一代疾病篩查體系，應(yīng)用于氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸和糖代謝異常以及溶酶體貯積癥等新生兒遺傳代謝病篩查，實(shí)現(xiàn)了一種檢測(cè)方法檢測(cè)多種疾病的技術(shù)轉(zhuǎn)變[4]。然而干血斑中的這些生物標(biāo)記物極易受血斑制備及血斑儲(chǔ)存條件的影響，保證血斑制備和儲(chǔ)存條件穩(wěn)定性，對(duì)于分析干血斑中氨基酸和肉堿濃度尤其重要。但是關(guān)于不同制備溫度、紫外線(xiàn)污染及不同儲(chǔ)存溫度對(duì)新生兒遺傳代謝性疾病篩查干血斑中氨基酸和肉堿含量影響國(guó)內(nèi)鮮有系統(tǒng)研究與報(bào)道，故為進(jìn)一步規(guī)范各實(shí)驗(yàn)室室間質(zhì)量控制，降低篩查假陽(yáng)性及假陰性出現(xiàn)的可能，提高串聯(lián)質(zhì)譜篩查質(zhì)量，更好地促進(jìn)新生兒疾病篩查業(yè)務(wù)規(guī)范開(kāi)展，有必要對(duì)影響干血斑中氨基酸及肉堿穩(wěn)定性因素進(jìn)行全面、系統(tǒng)探究。因此，本研究主要探討在串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)支持下，研究不同制備溫度、紫外線(xiàn)污染及不同儲(chǔ)存溫度對(duì)新生兒遺傳代謝性疾病篩查干血斑中氨基酸和肉堿含量影響，以便選擇最佳儲(chǔ)存條件提高串聯(lián)質(zhì)譜篩查質(zhì)量，更好地促進(jìn)新生兒疾病篩查業(yè)務(wù)的規(guī)范開(kāi)展。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本 參照新生兒疾病篩查采血技術(shù)規(guī)范要求，為避免人群個(gè)體因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生的影響，標(biāo)本制作的血液來(lái)源為知情同意的健康志愿者。采血部位為肘前靜脈(空腹)，直接將注射器中的全血以定量的形式滴加在濾紙上，利用采血卡制備直徑8mm標(biāo)準(zhǔn)血斑。

1.2 儀器和試劑 采用美國(guó)Waters公司生產(chǎn)的TQ Detector串聯(lián)質(zhì)譜儀分析以及美國(guó)PerkinElmer公司生產(chǎn)的配套非衍生多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測(cè)定試劑盒。

1.3 方法 為研究不同制備溫度對(duì)血斑中氨基酸及肉堿含量影響將制備的部分標(biāo)準(zhǔn)新鮮血斑分為4℃、25℃及37℃三組進(jìn)行制備。血斑制備后，每組從干血斑邊緣取3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以試劑盒自帶質(zhì)控品為對(duì)照組，通過(guò)Waters-TQD串聯(lián)質(zhì)譜儀利用非衍生化法進(jìn)行干血斑內(nèi)氨基酸及肉堿含量分析。為研究紫外射線(xiàn)污染對(duì)血斑中氨基酸及肉堿含量影響將制備的部分標(biāo)準(zhǔn)新鮮血斑分為25℃制備組與25℃制備過(guò)程中紫外燈照射組兩組。血斑制備后，每組從干血斑邊緣取3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以試劑盒自帶質(zhì)控品為對(duì)照組，通過(guò)Waters-TQD串聯(lián)質(zhì)譜儀利用非衍生化法進(jìn)行干血斑內(nèi)氨基酸及肉堿含量分析。為研究?jī)?chǔ)存溫度對(duì)干血斑中氨基酸和肉堿含量變化將25℃制備的部分標(biāo)準(zhǔn)血斑根據(jù)儲(chǔ)存溫度以及儲(chǔ)存時(shí)間分為三組，分別為4℃制備組，-20℃制備組，-80℃制備組。每組檢測(cè)時(shí)間分別為保存0d、7d、3個(gè)月。檢測(cè)時(shí)，每組從干血斑邊緣取3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以試劑盒自帶質(zhì)控品為對(duì)照組，通過(guò)Waters-TQD串聯(lián)質(zhì)譜儀利用非衍生化法進(jìn)行干血斑內(nèi)氨基酸及肉堿含量分析。

2 結(jié)果

2.1 不同制備溫度對(duì)干血斑中氨基酸及肉堿含量影響 在4℃、25℃及37℃三種溫度條件下對(duì)新鮮血斑標(biāo)本進(jìn)行制備時(shí)，血斑中肉堿含量穩(wěn)定，未產(chǎn)生顯著差異變化(數(shù)據(jù)未顯示)；而血斑中部分氨基酸含量則產(chǎn)生顯著性變化。如表1所示：37℃制備組中ARG含量顯著高于4℃制備組與25℃制備組(P<0.05)；但是4℃制備組與25℃制備組ARG含量比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而37℃制備組中ORN含量顯著低于4℃制備組(P<0.05),但25℃制備組與37℃制備組及4℃制備組分別比較時(shí)，各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 不同制備溫度對(duì)新鮮血斑中氨基酸含量影響

2.2 紫外線(xiàn)污染對(duì)干血斑中氨基酸及肉堿含量的影響 為研究血斑制備過(guò)程中受到紫外線(xiàn)污染時(shí)對(duì)血斑中氨基酸及肉堿含量的影響，筆者研究了血斑在25℃制備、25℃制備時(shí)受到紫外線(xiàn)照射污染兩種情況下干血斑中氨基酸及肉堿含量變化。如表2、3所示，25℃制備時(shí)受到紫外線(xiàn)污染組干血斑中ARG含量顯著高于25℃制備時(shí)未受紫外線(xiàn)污染組(P<0.05)，兩組中其他氨基酸含量及肉堿含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 紫外射線(xiàn)污染對(duì)血斑中肉堿含量影響

表3 紫外射線(xiàn)污染對(duì)血斑中氨基酸含量影響

2.3 儲(chǔ)存溫度對(duì)干血斑中氨基酸和肉堿含量影響 如表4所示，4℃、-20℃及-80℃對(duì)制備的干血斑密封保存7d，干血斑中氨基酸及肉堿指標(biāo)含量未有顯著性變化；隨著保存時(shí)間到90d時(shí)，與-20℃及-80℃保存條件相比，4℃密封儲(chǔ)存干血斑時(shí)，GLY、MET、ORN以及肉堿中C2、C3均有顯著性降低，但是C0表現(xiàn)出顯著性升高，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但是-20℃與-80℃對(duì)密封保存的干血斑中氨基酸(除ORN外)及肉堿含量(除C16外)變化無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表4 不同儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)干血斑中氨基酸和肉堿含量影響

3 討論

新生兒疾病篩查在我國(guó)出生缺陷三級(jí)防控體系中起著重要作用。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)作為新一代疾病篩查體系代表有效推動(dòng)了新生兒疾病篩查的自動(dòng)化和篩查效率，使得篩查的疾病種類(lèi)也越來(lái)越多，新生兒疾病篩查和診斷工作也面臨越來(lái)越多的問(wèn)題亟待解決。其中分析前質(zhì)量問(wèn)題(主要涉及標(biāo)本采集時(shí)間、采集方式、運(yùn)輸方式以及儲(chǔ)存方式等)涉及環(huán)節(jié)多，人為影響因素大，不易標(biāo)準(zhǔn)量化而越來(lái)越成為影響新生兒疾病篩查質(zhì)量的主要影響因素[5]。

電噴霧離子質(zhì)譜檢測(cè)經(jīng)同位素標(biāo)記的氨基酸是全世界范圍內(nèi)普遍采用的新生兒篩查法，衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)氨基酸和肉堿的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果表明串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)氨基酸和?；鈮A的質(zhì)量水平差異較大[6]。

早期國(guó)內(nèi)李啟亮等[7]研究表明：血斑制備后儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)多數(shù)氨基酸含量沒(méi)有明顯影響，但是GLY隨標(biāo)本儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)而含量下降，4℃儲(chǔ)存3個(gè)月時(shí)與新鮮干血斑標(biāo)本比較存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究結(jié)果也證實(shí)，與新鮮干血斑相比，4℃保存3個(gè)月后，血斑中除GLY出現(xiàn)顯著性下降外，ARG、MET、VAL也表現(xiàn)出同樣的變化趨勢(shì)，且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)國(guó)外研究表明：在長(zhǎng)期儲(chǔ)存的干血斑中，游離肉堿含量在前5年的時(shí)間里每年增加7.6%，而在隨后的時(shí)間里每年降低1.4%，氨基酸含量則每年均存在一定程度的損失，但不同氨基酸每年下降程度不同，表明氨基酸及?；鈮A在干血斑中的含量呈現(xiàn)出不穩(wěn)定性[8]。另外，Golbahar J等研究了干血滴濾紙片法采集樣品短期穩(wěn)定性，考察了新生兒先天代謝性疾病血樣在極端條件下(溫度和濕度)，7種氨基酸和10種?；鈮A的含量變化，發(fā)現(xiàn)溫度或濕度過(guò)高均大大降低檢測(cè)的靈敏度，血樣最好是低溫干燥保存，可以顯著降低篩查過(guò)程中假陽(yáng)性的出現(xiàn)[4]。

另一方面，本研究發(fā)現(xiàn)：在4℃、25℃及37℃三種溫度條件下對(duì)新鮮血斑標(biāo)本進(jìn)行制備時(shí)，血斑中肉堿含量穩(wěn)定；與4℃相比，37℃制備血斑時(shí)，血斑中ARG含量上升45%，而ORN含量則下降8.8%，兩個(gè)指標(biāo)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與郭元芳等人[9]對(duì)干血斑中ARG濃度與環(huán)境溫度和濕度變化呈現(xiàn)反比例關(guān)系的結(jié)論不一致，表明環(huán)境濕度可能對(duì)干血斑中氨基酸濃度的影響更大。與25℃制備干血斑中氨基酸及肉堿含量相比，在25℃制備過(guò)程中受到紫外線(xiàn)污染時(shí)，血斑中肉堿含量未有明顯變化，但血斑中ARG含量上升23%，ORN含量下降11%，兩個(gè)指標(biāo)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)，干血斑中各氨基酸指標(biāo)含量存在一定程度降低，尤其以ARG、VAL含量降低幅度明顯，這可能與干血斑中水解酶濃度增加有關(guān)；干血斑肉堿指標(biāo)含量保持穩(wěn)定；但是在4℃條件下儲(chǔ)存標(biāo)本時(shí)，血斑中C0含量在3個(gè)月后上升約40%，這與之前國(guó)外研究結(jié)果相符合，國(guó)外研究中同樣指出C0這種含量趨勢(shì)變化與?；鈮A酯化體系的水解有關(guān)[4，10]。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，4℃儲(chǔ)存干血斑時(shí)，隨著時(shí)間推移，MET含量與C2含量在3個(gè)月后急劇降低為原來(lái)的50%，這種MET與C2的含量下降在-20℃及-80℃儲(chǔ)存條件下并未出現(xiàn)，該種情形的出現(xiàn)有待于進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)。

本研究結(jié)果表明：新生兒遺傳代謝性疾病篩查干血斑制備過(guò)程中溫度變化對(duì)于干血斑中ARG與ORN含量影響顯著，同時(shí)干血斑制備過(guò)程中受到紫外線(xiàn)污染時(shí)導(dǎo)致血斑中ARG含量的增加，但是制備溫度及紫外線(xiàn)污染對(duì)血斑中肉堿含量影響未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此新生兒疾病篩查干血斑在制備時(shí)應(yīng)盡量保持室內(nèi)溫度恒定(室溫25℃)，避免我國(guó)北方因冬夏季節(jié)差異影響干血斑中檢測(cè)物質(zhì)含量的變化，同時(shí)避免受到紫外射線(xiàn)污染以降低對(duì)血斑中氨基酸含量的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，-20℃條件對(duì)制備的干血斑密封保存能很好保證干血斑中氨基酸及肉堿含量的穩(wěn)定性，目前實(shí)驗(yàn)室從血斑制備至實(shí)驗(yàn)室完成檢測(cè)時(shí)間跨度為1周是合適的時(shí)間范圍，也能滿(mǎn)足日常實(shí)驗(yàn)檢測(cè)質(zhì)控需求。