盧軍城 何基明 王翔鋒 佘志廉 陳陽(yáng)天 倪晨輝

福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建省福州市 350000

星形細(xì)胞上調(diào)基因-1(Astrocyte elevated gene-1，AEG-1)，也稱(chēng)轉(zhuǎn)移黏附因子，是近年較為熱門(mén)的原癌基因[1]。AEG-1基因最初是在人類(lèi)免疫缺陷病毒感染的人胚胎初級(jí)星形細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的[2]。2002年，su等首先克隆AEG-1，現(xiàn)今，越發(fā)成為癌癥發(fā)生發(fā)展中的研究熱點(diǎn)[3]。AEG-1基因在正常組織中表達(dá)量較低，甚至不表達(dá)，而在惡性腫瘤細(xì)胞中多見(jiàn)高表達(dá)，且在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。AEG-1目前在食管鱗癌中的表達(dá)及臨床意義研究尚少，且在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)中的具體作用機(jī)制尚不明確。

本研究主要通過(guò)半定量RT-PCR、Western blotting及免疫組化檢測(cè)AEG-1和E-鈣黏蛋白(E-cadherin)在食管鱗癌組織中不同水平的表達(dá)情況，并與腫瘤臨床病理特征、相關(guān)性及預(yù)后進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步研究其在食管癌中的功能及機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年12月—2019年12月于我院行手術(shù)治療的食管鱗癌患者臨床資料，共收集病例532份。其中男385例，女147例，年齡35～79歲。臨床分期Ⅰ期21例，Ⅱ期336例，Ⅲ期133例，Ⅳ期42例。剔除術(shù)前放化療，且多為原發(fā)腫瘤。收集蠟塊包括癌組織及癌旁組織，其中即刻收集5例手術(shù)切除的食管鱗癌組織及癌旁正常組織液氮保存。所有患者隨訪至2020年7月，中位隨訪時(shí)間5年，術(shù)后按照指南行規(guī)范的輔助治療及復(fù)查。

1.2 試劑 AEG-1兔抗人多克隆抗體(北京博奧森公司)、E-cadherin檢測(cè)試劑盒(福州邁新公司)、GAPDH兔抗人多克隆抗體(EPTOMIC公司)，鼠抗兔二抗(北京中杉金橋公司)，免疫組織化學(xué)試劑盒(福州邁新公司)。AEG-1引物:5’-AAATAGCCAGCCTATCAAGACTC-3’(forward);5’-TTCAGACTTGGTCTGTGAAGGAG-3’(reverse);GAPDH引物:5’-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3’(forward);5’-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3’(reverse)。

1.3 方法 常規(guī)液氮研磨腫瘤組織，使用Trizol試劑提取總RNA。-80℃保存采用逆轉(zhuǎn)錄酶獲取的cDNA溶液。加入AEG-1引物行PCR，內(nèi)參采用GAPDH。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性30s，94℃10s、60℃30s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)后檢測(cè)溶解曲線，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)。以2-ΔΔCt來(lái)計(jì)算AEG-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

按照說(shuō)明書(shū)提取總蛋白，以BCA法測(cè)定蛋白濃度，中加入5×LoadingBuffer，95℃變性4min，冷卻后等量上樣，常規(guī)電泳分離蛋白樣品，80V，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后改120V電泳，AEG-1蛋白在分離膠中下1/3時(shí)停止。轉(zhuǎn)膜，3%BSA液室溫封閉1h，4℃一抗孵育過(guò)夜，二抗孵育1h，再次洗膜。滴ECL發(fā)光液孵育2min，暗室內(nèi)凝膠成像顯影。以GelPro分析軟件測(cè)定條帶灰度值，采用半定量分析。

采用免疫組化SP法，常規(guī)切片經(jīng)脫蠟、脫水、水洗后，3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，常規(guī)抗原修復(fù)，封閉非特異性抗原，抗AEG-1一抗工作濃度均為1∶300，抗E-cadherin工作濃度1∶250，癌旁組織做陰性對(duì)照。DAB顯色，蘇木素復(fù)染。采用文獻(xiàn)所示陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，對(duì)AEG-1和E-cadherin在不同臨床病理特征中的表達(dá)差異行χ2檢驗(yàn)。AEG-1表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系采用Kaplan-Meier生存曲線，并用Log rank檢驗(yàn)。AEG-1與E-cadherin相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AEG-1表達(dá)結(jié)果與食管癌臨床病理的相關(guān)性 運(yùn)用半定量RT-PCR法檢測(cè)所收集5例新鮮食管鱗癌及癌旁正常組織中AEG-1 mRNA的表達(dá)情況，食管鱗癌組織中AEG-1 mRNA表達(dá)量為癌旁正常組織的5.9～8.9倍(圖1)。

圖1 AEG-1 mRNA在5例新鮮食管鱗癌與癌旁正常組織中表達(dá)比值

Western blotting法檢測(cè)所收集5例新鮮食管鱗癌及癌旁組織中AEG-1蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示癌組織中AEG-1蛋白表達(dá)量為癌旁正常組織的4.5～11.2倍(圖2)。

圖2 Western blotting 法檢測(cè)AEG-1蛋白在5例新鮮食管鱗癌與癌旁正常組織中表達(dá)比值

免疫組化檢測(cè)所有517例食管癌標(biāo)本，結(jié)果245例出現(xiàn)高表達(dá)，陽(yáng)性率47.4%，AEG-1陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕色(圖3)。AEG-1的表達(dá)與年齡、性別無(wú)關(guān)(均P>0.05)，而與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期及分化程度有關(guān)(P<0.05)。腫瘤分期越晚、分化程度越差，則陽(yáng)性率越高，見(jiàn)表1。

圖3 免疫組化檢測(cè)AEG-1在食管癌中的表達(dá)(SP×200)

表1 AEG-1及E-cad的表達(dá)情況及與臨床病理之間的關(guān)系

2.2 E-cadherin表達(dá)結(jié)果與食管癌臨床病理的相關(guān)性 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示190例出現(xiàn)低表達(dá)(36.7%)，327例出現(xiàn)高表達(dá)(63.3%)，其陽(yáng)性主要定位于細(xì)胞膜和胞質(zhì)(圖4)。E-cadherin的表達(dá)與年齡、性別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)，而與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期及分化程度有關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 AEG-1和E-cadherin表達(dá)與食管鱗癌患者術(shù)后生存的關(guān)系 Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示：AEG-1高表達(dá)組和低表達(dá)組總生存率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明AEG-1表達(dá)越高患者生存率越差(圖5a)。同時(shí)E-cadherin表達(dá)越高顯示預(yù)后越好(圖5b)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 AEG-1與E-cadherin相關(guān)性 245例高表達(dá)AEG-1中，有87例高表達(dá)E-cadherin，158例低表達(dá)。采用Spearman相關(guān)分析，AEG-1與E-cadherin二者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.546,P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 AEG-1與E-caherind表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

中國(guó)是世界上食管癌的發(fā)病率、病死率最高的國(guó)家，尤以河南、福建東南沿海為甚[4]。食管癌是原發(fā)于食管的惡性腫瘤，以鱗癌多見(jiàn)。具有發(fā)病隱匿、進(jìn)展快、預(yù)后差等特點(diǎn)，盡管目前治療方式多為手術(shù)、化療、放療，其治療手段仍較少，由于缺乏有效的能用于早期檢測(cè)食管癌的生物指標(biāo)物，總體5年生存率低于30%[5-6]。AEG-1又稱(chēng)為異黏附蛋白，由Hu等在HIV感染細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[2]。近年來(lái)，許多實(shí)驗(yàn)表明，AEG-1其在常見(jiàn)的惡性腫瘤(如乳腺癌、腸癌等)呈過(guò)表達(dá)，且與腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移起關(guān)鍵作用，并與患者的生存呈負(fù)相關(guān)[7-10]。

本研究結(jié)果顯示，AEG-1 mRNA在5例食管鱗癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織。蛋白水平方面，應(yīng)用Western blotting進(jìn)一步驗(yàn)證AEG-1在食管鱗癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織。免疫組化顯示，517例食管癌標(biāo)本出現(xiàn)AEG-1陽(yáng)性，而在癌旁組織無(wú)表達(dá)或弱表達(dá)。分析AEG-1與患者臨床病理特征相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，AEG-1的表達(dá)與食管鱗癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、病理分期顯著相關(guān)(P<0.05)。生存分析探討AEG-1與患者術(shù)后預(yù)后的關(guān)系，Kaplan-Meier分析表明低表達(dá)AEG-1的患者其總體生存率顯著優(yōu)于高表達(dá)AEG-1組的患者，提示AEG-1高表達(dá)與食管鱗癌不良預(yù)后密切相關(guān)，這與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[11-12]。綜上所述，本研究數(shù)據(jù)表明，AEG-1可能是食管鱗癌預(yù)后不良的一個(gè)標(biāo)志性指標(biāo)。

在食管癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制中， EMT是其中一個(gè)關(guān)鍵的生物行為進(jìn)程。 EMT的過(guò)程中，其標(biāo)志之一為E-cadherin減少。E-cadherin主要分布于胚胎和成熟組織的上皮細(xì)胞中，除具有調(diào)節(jié)組織的發(fā)育、形成外，在細(xì)胞間的黏附反應(yīng)起關(guān)鍵機(jī)制[13]。EMT作用機(jī)制之一可能是減弱依賴E-cadherin的細(xì)胞黏附。從而增加細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性，致使癌細(xì)胞侵入周?chē)M織并擴(kuò)散。癌細(xì)胞擺脫細(xì)胞間黏附進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)完成浸潤(rùn)，進(jìn)一步突破基底膜屏障，EMT為這個(gè)破環(huán)過(guò)程的潛在機(jī)制提供了一種可能。

本研究提示了食管鱗癌中存在高表達(dá)AEG-1，且與患者生存情況呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與張雪梅等的報(bào)道一致[11-12]。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌組織中E-cadherin顯著低表達(dá)(P<0.05)，且與AEG-1的表達(dá)呈顯性負(fù)相關(guān)(r=-0.546,P<0.05)。表明AEG-1高表達(dá)可能通過(guò)下調(diào)E-cadherin及上調(diào)Vimentin和N-cadherin的表達(dá)使食管鱗癌上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，進(jìn)而推進(jìn)EMT的發(fā)生。提示AEG-1陽(yáng)性率較高的食管癌患者更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較差的組織學(xué)分化，黏附性下降，從形態(tài)學(xué)上表明AEG-1可能通過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑參與食管癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究通過(guò)RT-PCR、Western blotting及免疫組化證實(shí)AEG-1在食管鱗癌組織中呈高表達(dá)，其高表達(dá)與腫瘤的TNM分期、陽(yáng)性淋巴結(jié)數(shù)及分化程度高度相關(guān)。AEG-1的高表達(dá)可能提示食管鱗癌患者預(yù)后不良的生物標(biāo)志物。其機(jī)制可能是通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)E-cadherin使組織發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究探索和驗(yàn)證。