李莉，常春玲，魏海波

miRNA廣泛存在于真核生物體內(nèi)，其在進化上高度保守，miRNA的序列、數(shù)量以及功能多樣，在生物體內(nèi)的諸多方面均有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用［1］。miRNA不僅影響正常細胞生長過程，還與病理狀態(tài)下細胞生物學特性改變有關(guān)［2］。miRNA在腫瘤中異常表達并參與調(diào)控腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和生長［3］。miR-466基因定位在3p23染色體上，其是從黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)的miRNA，miR-466與乳頭瘤病毒的長控制區(qū)有高度同源性，而長控制區(qū)是致癌蛋白表達的調(diào)控區(qū)域［4］。研究顯示，miR-466在前列腺癌中表達下調(diào)，上調(diào)miR-466可以抑制前列腺癌細胞轉(zhuǎn)移和生長［5］。后續(xù)在結(jié)直腸癌、骨肉瘤細胞中均證實miR-466具有抗腫瘤效果［6-7］。既往研究檢測到宮頸癌組織中較低水平的miR-466［8］。本研究主要確定miR-466在宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲中的作用與機制，為宮頸癌分子靶向治療提供新的線索。本研究起止時間為2019年1—10月。

1 材料與方法

1.1 材料野生型（wild type，WT）和突變型（mutant，MUT）熒光素酶報告載體均由南京科佰生物科技有限公司構(gòu)建；宮頸癌Caski、SiHa、C33A細胞購自上海滬震生物科技有限公司；Lipotectamine 2000和Twist1抗體購自美國Invitrogen；正常宮頸上皮End1∕E6E7細胞購自上海雅吉生物科技有限公司；波形蛋白（Vimentin）、上皮鈣黏素（epithelical cadherin，E-cadherin）抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；miR-466 mimics和mimics control購自紐赫生物科技（上海）有限公司；pCDNA3.1-Twist1由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 定量即時聚合酶鏈鎖反應（qRT-PCR）方法測定宮頸癌細胞中miR-466表達收集宮頸癌Caski、SiHa、C33A細胞和正常宮頸上皮End1∕E6E7細胞，用Trizol試劑提取總RNA。取2 μg的RNA常規(guī)方法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。收集2 μL的cDNA配制qRTPCR反應體系，包括9 μL的SYBR Green Mix、2 μL的上下游引物，添加無RNA酶水（RNase-free H2O）至20 μL。PCR反應條件為：95℃、20 s，95℃、10 s，60℃、20 s，70℃、10 s，共40個循環(huán)。根據(jù)反應的Ct值，以U6作為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt法計算miR-466表達變 化。miR-466：正 向 引 物5，-CACTAGTGGTTCCGTTTAGTAG-3’，反 向 引 物5，-TTGTAGTCACTAGGGCACC-3’。U6引 物：正 向 引 物5，-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物5，-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染和分組宮頸癌SiHa細胞的轉(zhuǎn)染通過Lipotectamine 2000進行。將轉(zhuǎn)染miR-466模擬物（miR-466 mimics）和模擬物陰性對照（mimics control）后的宮頸癌SiHa細胞命名為miR-466和miRNC組。將未處理的宮頸癌SiHa細胞標記為對照（Control）組。根據(jù)1.2中qRT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染24 h后細胞中miR-466表達。

1.4 噻唑藍（MTT）檢測細胞增殖在96孔板中接種宮頸癌SiHa細胞，按照1.3中Control組、miR-NC組和miR-466組進行處理，培養(yǎng)24 h，加入10 μL的MTT孵育4 h。將孔內(nèi)的液體吸棄，添加150 μL的二甲基亞砜溶液。酶標儀測定每個孔570 nm的吸光度。吸光度代表細胞增殖能力。

1.5 Transwell小室檢測細胞侵襲和遷移Transwell小室鋪膠處理：用不含血清的RPMI1640將Matrigel按照5∶1的比例稀釋，取80 μL添加到小室，在37℃孵育2 h。侵襲實驗需在Transwell小室中鋪膠，遷移實驗省去該步驟，其余步驟均相同：收集Control組、miR-NC組 和miR-466組 宮頸 癌SiHa細胞，將200 μL懸浮于無血清培養(yǎng)液的宮頸癌SiHa細胞補充至Transwell上室，將500 μL含血清培養(yǎng)液加在下室，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。多聚甲醛與結(jié)晶紫分別固定30 min、染色10 min。將顯微鏡下隨機選5個視野的均值作為細胞穿膜數(shù)量。

1.6 Western blotting檢測細胞中Vimentin、E-cadherin蛋白表達Control、miR-NC、miR-466組細胞培養(yǎng)24 h，提取細胞蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳蛋白上樣量為40 μg，在濃縮膠中用70 V電壓電泳，在分離膠中用120 V電壓電泳。在210 mA電流條件下轉(zhuǎn)膜40 min。NC膜依次放在封閉液（5%牛血清白蛋白）、一抗（Vimentin、E-cadherin抗體以1∶1 000稀釋）、二抗（辣根過氧化物酶標記的二抗以1∶2 000稀釋）溶液中，于室溫條件下反應1.5 h。ECL發(fā)光。Image J分析內(nèi)參GAPDH和目的蛋白Vimentin、E-cadherin的灰度值，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。

1.7 miR-466靶基因預測和鑒定預測軟件targetscan分析發(fā)現(xiàn)Twist1可能為miR-466的靶基因。將含Twist1 3，UTR端結(jié)合位點WT和MUT熒光素酶報告載體分別同miR-466 mimics和mimics control共轉(zhuǎn)染到宮頸癌SiHa細胞中，48 h后，用熒光素酶活性測定試劑盒檢測熒光素酶活性變化。收集培養(yǎng)24 h以后的Control、miR-NC、miR-466組細胞，以Western blotting方法測定Twist1蛋白表達，Twist1抗體以1∶800稀釋，步驟參照1.6；以qRT-PCR方法測定Twist1 mRNA表達，結(jié)果以GAPDH作為內(nèi)參，分析Twist1 mRNA水平。Twist1 mRNA：正向引物5，-CGCGAATTCGCCACCGTC-3’，反向引物5，-CCGGCGGCCGCTGGAGGACCTGGTAGAGGAA-3’。GAPDH：正向引物5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，反向引物5，-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。

1.8 pCDNA3.1-Twist1逆轉(zhuǎn)miR-466作用檢測在宮頸癌SiHa細胞中分別共轉(zhuǎn)染Twist1過表達載體（pCDNA3.1-Twist1）與miR-466 mimics、Twist1過表達載體陰性對照（pCDNA3.1）與miR-466 mimics，命名為miR-466+pCDNA3.1-Twist1和miR-466+pCDNA3.1組。以MTT、Transwell小 室 和Western blotting方法測定細胞增殖、侵襲、遷移以及Vimentin、E-cadherin、Twist1蛋白表達，以qRT-PCR方法測定Twist1 mRNA表達，步驟同上。

1.9 統(tǒng)計學方法本研究所得數(shù)據(jù)均用SPSS 21.0軟件分析，計量資料數(shù)據(jù)結(jié)果用±s表示，兩組數(shù)據(jù)間比較用t檢驗，多組差異比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌細胞中miR-466表達下調(diào)正常宮頸上皮End1∕E6E7細胞和宮頸癌Caski、SiHa、C33A細胞中miR-466表 達水 平依 次為：1.00±0.09、0.58±0.06、0.20±0.03、0.45±0.04。宮頸 癌Caski細胞 中miR-466表達水平低于正常宮頸上皮End1∕E6E7細胞，差異有統(tǒng)計學意義（t=11.65，P＜0.000 1）；宮頸癌SiHa細胞中miR-466表達水平低于正常宮頸上皮End1∕E6E7細胞，差異有統(tǒng)計學意義（t=25.30，P＜0.000 1）；宮頸癌C33A細胞中miR-466表達水平低于正常宮頸上皮End1∕E6E7細胞，差異有統(tǒng)計學意義（t=16.75，P＜0.000 1）；宮頸癌SiHa細胞中miR-466表達水平明顯低于Caski細胞（t=16.99，P＜0.000 1）宮頸癌SiHa細胞中miR-466表達水平明顯低于C33A細胞（t=15.00，P＜0.000 1）。miR-466在宮頸癌細胞中表達下調(diào)。

2.2 miR-466 mimics對宮頸癌SiHa細胞增殖、侵襲、遷移和Vimentin、E-cadherin蛋白表達影響miR-466組宮頸癌SiHa細胞中miR-466水平升高，細胞吸光度降低，細胞侵襲和遷移數(shù)目下降，Vimentin蛋白表達水平降低，E-cadherin蛋白表達水平升高，與miR-NC組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1和表1。miR-466 mimics抑制宮頸癌SiHa細胞增殖、侵襲、遷移。

表1 miR-466 mimics轉(zhuǎn)染后宮頸癌SiHa細胞吸光度、遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目和Vimentin、E-cadherin蛋白以及miR-466表達水平∕±s

表1 miR-466 mimics轉(zhuǎn)染后宮頸癌SiHa細胞吸光度、遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目和Vimentin、E-cadherin蛋白以及miR-466表達水平∕±s

注：Control為空白對照，miR-NC為轉(zhuǎn)染模擬物陰性對照組，miR-466為轉(zhuǎn)染miR-466模擬物組，Vimentin為波形蛋白，E-cadherin為上皮鈣黏蛋白，miR-466為微小ENA-466。①與miR-NC比較，P＜0.05。

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圖1 Western blotting檢測miR-466 mimics對宮頸癌SiHa細胞中Vimentin、E-cadherin蛋白表達影響

2.3 miR-466和Twist1互為靶向關(guān)系在線靶基因軟件預測到miR-466可靶向Twist1的3，UTR，見圖2。

圖2 miR-466和Twist1的3，UTR端結(jié)合位點示意圖

宮頸癌SiHa細胞熒光素酶活性在WT和miR-466 mimics共轉(zhuǎn)染組比mimics control和WT共轉(zhuǎn)染組 降 低（1.00±0.11）比（0.51±0.06）。miR-466和Twist1互為靶向關(guān)系。

2.4 上調(diào)miR-466對宮頸癌SiHa細胞中Twist1表達影響Control、miR-NC、miR-466組細胞中Twist1蛋白水平依次為：0.60±0.05、0.61±0.04、0.23±0.03，Twist1 mRNA水 平 依次 為：1.00±0.09、0.99±0.10、0.32±0.04。miR-466組宮頸癌SiHa細胞中Twist1蛋白和mRNA表達水平降低，與miR-NC組比較，差異有統(tǒng)計學意義（蛋白：t=22.80，P＜0.000 1；mRNA：t=18.66，P＜0.000 1），見圖3。上調(diào)miR-466抑制宮頸癌SiHa細胞中Twist1表達。

圖3 Western blotting測定miR-466 mimics對宮頸癌SiHa細胞中Twist1蛋白表達影響

2.5 pCDNA3.1-Twist1逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-466對宮頸癌SiHa細胞增殖、侵襲、遷移和Vimentin、E-cadherin蛋白表達影響與miR-466+pCDNA3.1組比較，miR-466+pCDNA3.1-Twist1組宮頸癌SiHa細胞吸光度升高，細胞遷移和侵襲數(shù)目增加，Vimentin、Twist1蛋白表達增多，Twist1 mRNA水平升高，Ecadherin蛋白表達減少（P＜0.05），見圖4和表2。pCDNA3.1-Twist1逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-466對宮頸癌SiHa細胞增殖、侵襲、遷移和Vimentin、E-cadherin蛋白表達影響。

表2 miR-466 mimics和pCDNA3.1-Twist1共轉(zhuǎn)染后宮頸癌SiHa細胞吸光度、遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目和Twist1、Vimentin、E-cadherin蛋白水平以及Twist1 mRNA水平∕±s

表2 miR-466 mimics和pCDNA3.1-Twist1共轉(zhuǎn)染后宮頸癌SiHa細胞吸光度、遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目和Twist1、Vimentin、E-cadherin蛋白水平以及Twist1 mRNA水平∕±s

注：Vimentin為波形蛋白，E-cadherin為上皮鈣黏蛋白，Twist1為堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子1，Twist1 mRNA為Twist1信使RNA，miR-466+pCDNA3.1為轉(zhuǎn)染miR-466模擬物和Twist1過表達載體陰性對照，miR-466+pCDNA3.1-Twist1為轉(zhuǎn)染miR-466模擬物和Twist1過表達載體。

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圖4 Western blotting測定miR-466 mimics和pCDNA3.1-Twist1共轉(zhuǎn)染對宮頸癌SiHa細胞中Twist1、Vimentin、E-cadherin蛋白表達影響

3 討論

本研究表明，miR-466在正常宮頸上皮細胞中的表達水平高于宮頸癌細胞，并且上調(diào)miR-466可以抑制宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲，提示miR-466充當宮頸癌的腫瘤抑制因子發(fā)揮作用。

miRNA是一類非編碼的小分子RNA，具有多種生物學功能，miRNA參與腫瘤進程，不同的miRNA在腫瘤中扮演類似癌基因或抑癌基因的作用［9-10］?，F(xiàn)階段已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種miRNA與宮頸癌惡性生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)，這些miRNA可以作為宮頸癌進程的分子標志物和宮頸癌治療的分子靶點［11-12］。已知miR-466靶向不同的靶基因，在結(jié)直腸癌、前列腺癌、肝癌、胃癌等腫瘤中扮演抑制作用，減弱癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移能力［5-7，13-14］。以前的研究報道證實，宮頸癌中miR-466表達下調(diào)，miR-466可能是一種抑腫瘤因子［8］。本研究證實miR-466在宮頸癌細胞生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮抑制作用，這與上述研究結(jié)果相符合，說明miR-466可能是宮頸癌的抑制因子。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，高水平的EMT意味著腫瘤細胞的高轉(zhuǎn)移能力［15］。細胞EMT發(fā)生時，Vimentin表達增多而Ecadherin表達減少。另外，Vimentin、E-cadherin不僅是EMT水平改變的標志蛋白，二者還是腫瘤發(fā)生過程中的癌基因和抑癌基因，Vimentin在腫瘤中過度表達而E-cadherin在腫瘤中表達下調(diào)［16］。本研究顯示，miR-466可以促進宮頸癌細胞中E-cadherin蛋白表達而抑制Vimentin蛋白表達，提示miR-466抑制宮頸癌細胞EMT，這進一步證實了miR-466具有抑制宮頸癌細胞轉(zhuǎn)移潛能的作用。

miRNA在不同的病理或生理進程中發(fā)揮功能是通過靶向下游靶標實現(xiàn)的［17］。miR-466參與腫瘤進程，在不同的腫瘤組織中的靶基因可能不同，miR-466通過靶向調(diào)控RUNX2參與前列腺癌進展，而在骨肉瘤中通過靶基因CCND1影響骨肉瘤轉(zhuǎn)移［5，7］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-466可以靶向負調(diào)控宮頸癌細胞中Twist1的表達。Twist1位于常染色體上，編碼堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，參與腫瘤轉(zhuǎn)移、生長、耐藥、血管生成過程，可能是腫瘤治療靶點和獨立預后指標［18］。目前已知，下調(diào)Twist1可以抑制宮頸癌細胞轉(zhuǎn)移和增殖，Twist1在宮頸癌中高表達是宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的重要原因［19］。本研究表明，上調(diào)Twist1可以降低miR-466對宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲和EMT的抑制作用，miR-466在宮頸癌細胞轉(zhuǎn)移中的作用機制與Twist1有關(guān)。

總之，miR-466在宮頸癌轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮抑制作用，其可以在體外抑制宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲和EMT，作用機制與靶向下調(diào)Twist1表達有關(guān)。目前對于miR-466靶向Twist1通過何種下游調(diào)控機制影響宮頸癌進程還不明確，在以后的實驗中會進行探討。本研究為闡明宮頸癌分子發(fā)生機制提供了資料，為靶向基因治療宮頸癌提供了理論參考。