侯衛(wèi)東，禹遠(yuǎn)遠(yuǎn)，李會敏，劉艷曉，劉艷鋒

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，發(fā)病率高。病理檢查依據(jù)形態(tài)學(xué)進(jìn)行診斷，主要觀察分支復(fù)雜的乳頭狀結(jié)構(gòu)和特征性細(xì)胞核改變。然而，在某些情況下可以觀察到病理形態(tài)的重疊，比如一些甲狀腺良性病變（benign thyroid lesions，BTL）亦可呈乳頭狀或假乳頭狀增生、少數(shù)濾泡亞型PTC與甲狀腺濾泡癌頗為相似，當(dāng)細(xì)胞核的特征不典型時鑒別診斷常會存在一定困難。在這些病變中使用galectin-3、HBME-1（Hector Battifora mesothelial 1）和cytokeratin-19鑒別診斷價值有限［1］，也沒有達(dá)成免疫組化專家共識或指南，因此，有必要尋找其他免疫組化標(biāo)志物作為輔助檢查手段。

細(xì)胞緊密連接不僅參與了細(xì)胞物質(zhì)流動的調(diào)節(jié)，還具有細(xì)胞增殖、基因轉(zhuǎn)錄、腫瘤抑制和維持上皮細(xì)胞極性的功能［2-3］。甲狀腺單層濾泡上皮細(xì)胞的極性排列，以及濾泡腔與濾泡外之間的屏障作用都是由于緊密連接的存在［4］。截至目前，在人體組織中共發(fā)現(xiàn)27種緊密連接跨膜蛋白Claudin家族成員［5］，不同Claudin成員在不同腫瘤的表達(dá)各異。Claudin-1在細(xì)胞緊密連接中發(fā)揮著骨架蛋白的作用，被認(rèn)為是負(fù)責(zé)上皮細(xì)胞屏障功能完整性最重要的蛋白質(zhì)［2］，其異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的生存期短有顯著相關(guān)性［6-7］，但在PTC組織中研究較少，并且混雜其他組織學(xué)類型的甲狀腺癌，國內(nèi)鮮見報道。本研究擬通過免疫組化染色法探討PTC組織中Claudin-1的鑒別診斷價值，以及與PTC侵襲轉(zhuǎn)移能力的相關(guān)性，為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究收集2017年1月至2019年10月平頂山市第一人民醫(yī)院和中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八九醫(yī)院平頂山醫(yī)療區(qū)甲狀腺手術(shù)存檔標(biāo)本共計271例。其中PTC 116例，男女比例為1∶3.6；中位年齡47.5歲（年齡范圍18～69歲），＜55歲者占79.3%；腫瘤中位長徑5 mm（長徑范圍1～28 mm）。術(shù)后腫瘤分期參照AJCC第八版TNM分期進(jìn)行。145例BTL病人中，男42例，女103例，男女比例為1∶2.5；中位年齡50.0歲（年齡范圍22～81歲），＜55歲者占71.7%。甲狀腺濾泡癌10例，男4例，女5例，男女比例為1∶2.5；中位年齡53.0歲（年齡范圍40～76歲），＜55歲者占50.0%。PTC組與BTL組、濾泡癌組病人性別（χ2=2.86，P=0.240）和年齡（χ2=5.10，P=0.078）分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，所有病人或其近親屬均簽署知情同意書。

1.2 方法所有標(biāo)本經(jīng)3.7%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下復(fù)核診斷。免疫組化染色采用pH 9.0的EDTA高溫高壓抗原修復(fù)法和EliVision-2染色法。免疫組化使用的一抗為Claudin-1（多克?。?shí)驗操作步驟和結(jié)果判定參照試劑說明書進(jìn)行。使用已知陽性對照片做陽性對照，PBS代替一抗做陰性對照，對照片與研究標(biāo)本在同一條件下進(jìn)行染色。免疫組化使用的抗體和EliVision-2試劑盒購自福州邁新生物公司。

1.3 免疫組化結(jié)果判定Claudin-1陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜。評分標(biāo)準(zhǔn)參照Sinicrope 1995年首次應(yīng)用的由Tanaka于2000年改良的定量記分法［8］，低倍鏡下觀察整張免疫組化染色切片，選取有代表性的不同區(qū)域進(jìn)一步高倍放大，隨機(jī)觀察至少5個高倍視野（長徑550 μm），綜合判斷高倍鏡下染色強(qiáng)度評分和陽性細(xì)胞百分比評分。按染色強(qiáng)度評分：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽性細(xì)胞百分比評分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分，百分比不同時取平均值。染色強(qiáng)度得分和陽性細(xì)胞百分比得分相乘，0分為（-），1～2分為（+），3～4分為（++），＞4分為（+++）；其中（-）和（+）為低表達(dá)，（++）和（+++）為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件對實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。分類數(shù)據(jù)采用率或百分?jǐn)?shù)表示，并采用χ2檢驗（必要時連續(xù)性校正）或Fisher確切概率法進(jìn)行比較，以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。按照臨床流行病學(xué)診斷試驗研究評價計算方法，計算Claudin-1診斷PTC的靈敏度和特異度。

2 結(jié)果

2.1 Claudin-1的表達(dá)Claudin-1在PTC、BTL與濾泡癌比較中均差異統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見表1。此外，Claudin-1在腫瘤周圍的正常甲狀腺組織中全部不表達(dá)；在16例有PTC轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中全部高表達(dá)（100%），并與甲狀腺內(nèi)原發(fā)癌灶的表達(dá)一致。

表1 緊密連接蛋白-1（Claudin-1）在甲狀腺乳頭狀癌（PTC）、甲狀腺良性病變（BTL）及濾泡癌中的表達(dá)

2.2 Claudin-1的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Claudin-1的高表達(dá)率在不同性別、年齡、癌結(jié)節(jié)長徑、癌結(jié)節(jié)數(shù)目、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期組間比較均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 緊密連接蛋白-1（Claudin-1）的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌（PTC）臨床病理參數(shù)的關(guān)系∕例（%）

2.3 Claudin-1表達(dá)的靈敏度和特異度評價Claudin-1診斷PTC的靈敏度為97.4%（113∕116），Claudin-1在PTC分別與BTL和濾泡癌的鑒別診斷中的特異度為88.3%（128∕145）和90.0%（9∕10）。

3 討論

本研究回顧性分析了271例甲狀腺良惡性病變組織中Claudin-1的表達(dá)情況，并分析了Claudin-1的表達(dá)與PTC侵襲轉(zhuǎn)移能力的相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)Claudin-1在PTC組織中的表達(dá)與在BTL和甲狀腺濾泡癌中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義；Claudin-1表達(dá)與PTC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期等不相關(guān)。

在當(dāng)前的研究中，Claudin-1在PTC中的高表達(dá)率（97.4%）顯著高于BTL（11.7%），在PTC分別與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、橋本甲狀腺炎、濾泡性腺瘤和濾泡癌比較，仍表現(xiàn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），呈現(xiàn)胞膜陽性表達(dá)模式。在所檢測病例的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性PTC癌灶中全部高表達(dá)，并與同一病人甲狀腺內(nèi)的原發(fā)癌灶表達(dá)一致。同時，研究表明正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞不表達(dá)Claudin-1。

以往的多項研究也對各種甲狀腺病變中的Claudin-1進(jìn)行過免疫組化染色評估。Nemeth等［9］通過定量評估的方法來測定甲狀腺腫瘤組織中Claudin-1陽性區(qū)域，結(jié)果顯示在PTC組織中腫瘤細(xì)胞胞膜強(qiáng)烈表達(dá)Claudin-1，而在甲狀腺濾泡性腺瘤和濾泡癌組織中表達(dá)微弱或陰性，單獨(dú)用Claudin-1區(qū)分PTC和濾泡性腫瘤有100%的特異度和70.3%的靈敏度。Abd El Atti等［10］研究發(fā)現(xiàn)Claudin-1可用于PTC和其他濾泡性結(jié)節(jié)的鑒別，與CD56（Claudin-1+∕CD56-）聯(lián)合后診斷PTC具有更高的特異度（100%）和敏感度（81.3%）。Tzelepi等［4］研究也發(fā)現(xiàn)Claudin-1在PTC中高表達(dá)（敏感度93%）。這些研究結(jié)果均與我們的研究結(jié)果相似。因此，Claudin-1免疫組化染色在區(qū)分PTC和BTL及濾泡癌方面具有重要參考價值，可作為PTC的診斷性標(biāo)志物。高靈敏度和特異度使得Claudin-1在PTC轉(zhuǎn)移灶的判斷中又具有特殊意義，即在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中Claudin-1陰性應(yīng)謹(jǐn)慎考慮PTC，需與甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（TTF-1）和甲狀腺球蛋白（Tg）聯(lián)合應(yīng)用以確定是否為PTC轉(zhuǎn)移。需要指出的是文獻(xiàn)中Claudin-1表達(dá)率的不同可能在很大程度上受到截點(diǎn)值標(biāo)準(zhǔn)和一抗稀釋濃度的影響。

緊密連接Claudin-1是調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附的關(guān)鍵蛋白。Claudin-1表達(dá)的減弱或缺失可能導(dǎo)致細(xì)胞間黏附性喪失，造成細(xì)胞緊密連接功能失常和極性消失，可能會增加營養(yǎng)物質(zhì)和其他生長生子向腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、增殖和獲得轉(zhuǎn)移潛能［3，6，11］。相反，Claudin-1的過度表達(dá)能抑制癌細(xì)胞的分離，從而抑制腫瘤細(xì)胞遷移、入侵和轉(zhuǎn)移［3，12-17］。因此，目前認(rèn)為Claudin蛋白是與腫瘤關(guān)系最為密切的緊密連接蛋白。雖然Claudin-1已經(jīng)在多種惡性腫瘤中被研究，但其預(yù)后作用并未完全闡明。Pyo等［6］關(guān)于Claudin-1在各種惡性腫瘤中的預(yù)后作用的薈萃分析顯示，Claudin-1的低表達(dá)與乳腺癌、結(jié)直腸癌、食管癌、膽囊癌、頭頸部癌和肺癌的生存期短顯著相關(guān)，而與宮頸癌、肝癌或胃癌的生存期短無關(guān)。

另外，根據(jù)Pyo等［6］的研究結(jié)果，Claudin-1的低表達(dá)與甲狀腺癌的無病生存期短顯著相關(guān)。Tzelepi等［4］對Claudin在不同甲狀腺癌類型中的總體表達(dá)情況進(jìn)行了深入研究，結(jié)果顯示Claudin-1在去分化的甲狀腺癌中表達(dá)減少，單變量分析顯示Claudin-1表達(dá)的減少或喪失與無病生存期短之間存在相關(guān)性。在本研究中顯示Claudin-1高表達(dá)幾乎發(fā)生在所有的PTC病例中，即使在PTC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶內(nèi)癌細(xì)胞仍然高表達(dá)Claudin-1，并且在形態(tài)學(xué)上癌細(xì)胞仍具有很強(qiáng)的黏附性（形成乳頭狀或腺管樣結(jié)構(gòu)），這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步表明PTC中Claudin-1高表達(dá)可能具有抑制腫瘤細(xì)胞分離的作用。因此，高表達(dá)Claudin-1可能是PTC總體預(yù)后很好的重要因素之一。此外，Claudin-1高表達(dá)可作為PTC復(fù)發(fā)的重要預(yù)測指標(biāo)［4，9］，以及潛在的藥物治療靶點(diǎn)［11-12，18-20］。

總之，在臨床實(shí)踐中檢測Claudin-1對不典型PTC病例的確診具有重要參考價值，并且具有高度的敏感性和特異性，可作為PTC與TBL和濾泡癌鑒別診斷的首選抗體，有助于提高正確診斷率。在判斷頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性腫瘤的原發(fā)部位時，聯(lián)合檢測Claudin-1、Tg和TTF-1有 助 于 確 定 轉(zhuǎn) 移 性PTC。Claudin-1高表達(dá)可能是PTC總體預(yù)后很好的關(guān)鍵因素之一。