鐘偉杰 劉文武 李 軼△

（1 上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院神經外科，上海 200011；2 海軍特色醫(yī)學中心潛水與高氣壓醫(yī)學研究室，上海 200433）

卒中是由大腦血供不足而導致腦組織缺血從而引發(fā)的一系列危及生命的癥狀[1]，主要分為缺血性卒中和出血性卒中。盡管近年來卒中的發(fā)病率仍在增加，但是由于卒中預防教育的加強、卒中中心的建立、早診斷早治療以及護理質量的改善等，卒中的死亡率趨于下降[2]。但是，卒中仍然是全球第二大最常見的疾病，全世界9%的死亡與卒中相關[3]。當前，卒中的治療主要包括溶栓治療、抗凝、抗血小板以及活性氧清除、內皮一氧化氮合酶激活劑等[4]。其中僅溶栓治療的療效最為確切，但因受到溶栓時間窗的限制，導致溶栓治療的廣泛應用受限。因此亟需進一步開發(fā)用于治療卒中的新療法。

腦卒中可能通過谷氨酸的過度激活、離子失衡和過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生導致神經功能障礙，其損傷機制有壞死或程序性細胞死亡的參與[5]。細胞凋亡、自噬和壞死性凋亡是研究較多的3種程序性細胞死亡方式。腦缺血研究表明，梗死區(qū)的神經元主要表現為壞死，而在卒中后的最初幾個小時內，細胞凋亡是缺血半暗帶或壞死周圍組織神經元的主要死亡形式[6]。細胞凋亡是一種受調節(jié)的細胞死亡，在形態(tài)學上與壞死存在明顯不同[7]。長期以來，細胞壞死被認為是病理情況下（物理性或化學性刺激、缺氧、營養(yǎng)不良等）出現的一種被動死亡。隨著研究的進展，有證據顯示，某些壞死細胞的死亡類似于細胞凋亡，也受到一定的調控。Chan等[8]于2003年首先提出“壞死性凋亡”這一概念。2005年，Degterev等[9]在缺血性腦損傷模型中抑制caspase-8后發(fā)現，necrostatin-1（Nec-1）可抑制由Fas /腫瘤壞死因子受體1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）下游的受體相互作用蛋白1（receptor-interacting protein kinase 1，RIP1）介導的細胞壞死，而非細胞凋亡。種種研究表明，這種類型的細胞死亡受到調控，并且發(fā)生于凋亡之后，被稱為“壞死性凋亡”（necroptosis）[10]。近年研究表明，壞死性凋亡與多種疾?。òㄗ渲校┑闹虏∮嘘P[11]。本文主要介紹壞死性凋亡抑制劑的研究進展，基于動物實驗研究總結壞死性凋亡在卒中致病中的作用，并提出靶向壞死性凋亡在腦卒中治療時存在的一些問題。

1 壞死性凋亡的概述

壞死性凋亡與凋亡、自噬是研究較多的細胞死亡模式，主要基于形態(tài)學特征、死亡途徑與方式以及是否可控等特征進行區(qū)分。形態(tài)學上，壞死性凋亡的細胞膜、細胞質以及線粒體等細胞器會發(fā)生腫脹，細胞質呈現空泡化，但壞死性凋亡無核碎裂[12]。而細胞發(fā)生凋亡時，細胞質和細胞器出現碎裂，細胞核出現凝聚和分裂，同時有凋亡小體的形成。對于細胞自噬，透射電鏡可觀察到其特有的3種形態(tài)學結構，吞噬泡、自噬小體和自噬溶酶體[13]。調節(jié)這3種程序性死亡的途徑也存在差異，各自也有特殊的分子標志物。壞死性凋亡通過RIP1、RIP3和MLKL來調節(jié)，并受半胱氨酸天冬氨酸酶的抑制作用。而凋亡主要通過Bcl-2家族蛋白信號途徑調節(jié)，與半胱氨酸天冬氨酸酶的活化密切相關[5]。細胞自噬相關蛋白（autophagy-related gene product，ATG）被認為是參與自噬體形成過程中的關鍵蛋白，微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）則常被應用于細胞自噬體數量的檢測[13]。

研究表明，諸多因素都會觸發(fā)壞死性凋亡，包括：腫瘤壞死因子（TNF）家族成員、Toll樣受體激活（TLRs）及其他病原微生物等[14]。當半胱氨酸蛋白酶8（caspase 8）受到抑制時，細胞凋亡被抑制，壞死性凋亡被活化[15]。RIP1和RIP3結合形成被稱為“壞死小體”的復合物，而后誘導RIP3自磷酸化。RIP3使混合譜系激酶結構域樣蛋白（mixed lineage kinase domain-like，MLKL）磷酸化，誘導MLKL寡聚物形成，移位至細胞膜，導致其破裂，最終破壞細胞[16]。并且，細胞壞死性凋亡會進一步放大炎癥反應以及線粒體氧化應激形成惡性循環(huán)[5]。

RIP家族包括RIP1～7，其中與壞死性凋亡關系最密切的是RIP1和RIP3[17]。兩者均含有1個絲氨酸-蘇氨酸結構域，并且具有激酶和非激酶的作用。RIP1的中間結構為RIP同型結構域（RIP homotypic interaction motif，RHIM），后者發(fā)揮啟動多個下游信號轉導通路的作用。RIP3具有和RIP1相似的RHIM[18]。RIP1與RIP3之間便是通過其RHIM結構域之間的結合而形成“壞死小體”。而且RIP3可以通過其RHIM序列與其他信號分子相互作用從而對壞死性凋亡的信號進行整合[19]。RIP1與RIP3的結合則會招募MLKL，并觸發(fā)其構象改變，最終導致細胞破裂[20]。因此，壞死性凋亡研究中常通過檢測RIP1、RIP3及其兩者的結合來評價。

2 壞死性凋亡的抑制

對于壞死性凋亡的認識，主要來源于壞死性凋亡抑制劑以及基因修飾技術。迄今為止，人們已經開發(fā)了一些壞死性凋亡的抑制劑。

2.1 RIP1抑制劑

2005年，在篩選小分子表型時發(fā)現了第1個壞死性凋亡抑制劑Nec-1，它可抑制RIP1激酶和吲哚胺2,3-雙加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO）的活性。目前，已經開發(fā)出幾種結構不同的Nec（Nec-1、Nec-3、Nec-4、Nec-5、Nec-7），其中Nec-7不具備抑制RIP1激酶的作用[21]。Nec-1 stable（Nec-1s；7-Cl-O-Nec-1）是Nec-1的類似物，它不會抑制IDO活性，而且血漿穩(wěn)定性和RIP1的特異性增加，也無類似Nec-1的毒性[22]。

2.2 RIP3抑制劑

目前有3種RIP3激酶抑制劑：GSK'840、GSK'843和GSK'872。與RIP1激酶抑制劑相比，GSK'840、GSK'843和GSK'872能高特異性地結合激酶結構域，并抑制激酶活性，靶向壞死性凋亡的作用更廣泛[23]。但是，GSK'840在人體細胞能發(fā)揮作用，而對小鼠細胞無影響，這妨礙了它在鼠模型中的評估。

2.3 MLKL抑制劑

Necrosulfonamide（NSA）是一種抑制MLKL的復合物，用于確認MLKL為RIP3的下游靶標。由于NSA能烷基化人MLKL的Cys86，而鼠MLKL中不存在Cys86，因此NSA無法抑制鼠細胞的壞死性凋亡，不適合用于鼠臨床前研究。

3 壞死性凋亡與腦卒中

3.1 腦卒中體外研究

一些研究表明，壞死性凋亡與卒中的致病密切相關，因為使用Nec-1等抑制劑或對壞死性凋亡相關蛋白進行基因調節(jié)，可改善卒中后的腦損傷和神經功能。Liu等[24]報道TNF-α誘導的HT-22海馬神經元毒性與壞死性凋亡有關，且這些細胞僅在半胱天冬酶阻斷后才對TNF-α敏感，隨后發(fā)生壞死，并且敲低去泛素化酶（cylindromatosis，CYLD）、RIP1、RIP3或MLKL可以抑制細胞壞死性凋亡。在對谷氨酸誘導的小鼠海馬神經元（HT-22）細胞中顯示，壞死性凋亡與多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly（ADP ribose）-polymerase， PARP）活化有關[25]。研究采用血紅蛋白或血紅素處理神經元，模擬顱內出血，結果觀察到鐵死亡和壞死性凋亡，但未觀察到caspase依賴的凋亡或自噬，而抑制壞死性凋亡，對血紅蛋白或者血紅素誘導的毒性具有保護作用[26]。Qu等[27]研究了MLKL介導的缺血缺氧后神經元損傷機制。氧-糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）環(huán)境下，神經元給予caspase抑制劑ZVAD處理后，RIP1和RIP3表達上調，RIP1和RIP3與MLKL相互作用增加，而MLKL表達沉默后能改善OGD誘導的神經元壞死性凋亡。腦缺血體外模型中，RIP1和RIP3表達增加和形成壞死小體，并且OGD后caspase 8 mRNA的表達瞬時降低；RIP3敲除能改善OGD誘導的神經元壞死性凋亡，而RIP3過表達則導致OGD誘導的神經元壞死性凋亡惡化[28]。有研究顯示，壞死性凋亡是缺血性損傷后24 h內細胞死亡的早期機制[29]，這一點與細胞凋亡不同[30]。

OGD處理的少突膠質細胞，RIP3表達上調，RIP3與RIP1、MLKL和CaMKⅡδ的相互作用增加，而抑制RIP3-MLKL或RIP3-CaMKⅡδ相互作用則可抑制OGD誘導的少突膠質細胞死亡，而抑制RIP3-RIP1相互作用后未觀察到該現象[31]。Dai等[32]報道，鐵超載也可導致原代皮質神經元壞死性凋亡，而姜黃素能抑制氯化亞鐵誘導的壞死性凋亡。興奮毒性也是缺血性卒中時組織損傷的關鍵機制。研究表明，N-甲基-D-天冬氨酸誘導的大鼠皮層神經元興奮性毒性也與壞死性凋亡有關[33]。

3.2 缺血性腦卒中動物研究

Degterev等[9]首次發(fā)現，壞死性凋亡與大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）導致的腦損傷有關，且其致病機制與凋亡不同，Nec-1可抑制壞死性凋亡的關鍵步驟（而非凋亡），對MCAO動物發(fā)揮神經保護作用。動物研究顯示，中度缺血性腦卒中，壞死性凋亡主要見于病變中心，重度缺血性腦卒中周圍的壞死性凋亡比中度損傷腦組織明顯更多，并且壞死性凋亡細胞在周圍梗塞區(qū)域和病變核心一樣活躍[34]。腦缺血再灌注損傷可通過誘導壞死性凋亡，促進腦出血和神經炎癥反應；RIP1活化先誘導壞死性凋亡，隨后出現凋亡[35]。有研究者也評估了腦卒中時壞死性凋亡的細胞特異性：caspase 8主要見于神經膠質原纖維酸性蛋白（GFAP）陽性的星形膠質細胞和Iba-1陽性的小膠質細胞，而NeuN陽性神經元中不表達。因此，caspase 3和caspase 8可能不參與海馬CA1神經元壞死性凋亡的調節(jié)[36]。全腦缺血模型中，再灌注之前皮層就出現壞死性凋亡，再灌注后72 h仍可檢測到，而且海馬的壞死性凋亡不如大腦皮質明顯；并且壞死性凋亡與TNFR1無關[37]。

研究主要通過基因調節(jié)或抑制劑對壞死性凋亡進行干預，探討壞死性凋亡與腦卒中的關系。Degterev等是最早研究Nec-1神經保護作用的團隊。隨后，不同的研究團隊在不同的腦卒中模型中證實了壞死性凋亡抑制的神經保護作用。研究顯示，Nec-1對由缺血再灌注損傷引起的海馬神經元壞死性凋亡的保護作用與抑制RIP3上調和核轉運有關[36]。RIP1激酶突變、RIP3敲除和MLKL敲除通過阻斷壞死性凋亡對大鼠MCAO誘導的急性腦缺血發(fā)揮保護作用。急性缺血性卒中疾病中，RIP1和RIP3活化導致炎癥相關信號途徑激活[37-38]。敲除RIP1對神經元損傷發(fā)揮神經保護作用，可能與抑制RIP1-RIP3結合誘導的氧化損傷和炎癥有關[39]。在新生鼠缺血缺氧性腦病模型中，抑制RIP3-MLKL或RIP3-CaMKⅡδ的相互作用，能緩解髓鞘損傷[31]。Xu等[40]報道，Nec-1對小鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用，同時給予凋亡抑制劑Gly（14）-humanin具有協(xié)同神經保護作用。全腦缺血再灌注損傷模型中，Nec-1和3MA（自噬抑制劑）預處理能顯著抑制神經元壞死性凋亡和大鼠死亡率，并且損傷后伴有RIP3和AIF的核易位、共定位以及兩者之間的相互作用[41]。在高糖血癥小鼠腦缺血再灌注損傷模型中，也證實了Nec-1s的神經保護作用[42]。此外，即使在損傷發(fā)生后6 h使用Nec-1s，也可觀察到神經保護作用。他們推測，Nec-1s可延長神經保護的時間窗，另一方面反映了卒中時壞死性凋亡的延遲誘導[40]。

腫瘤壞死因子受體相關因子2（TNF receptor-associated factor 2，TRAF2）也與小鼠MCAO誘導的細胞壞死性凋亡有關，而Nec-1預處理能抑制TRAF2敲除導致的細胞壞死性凋亡[43]。近期研究顯示，RIP3敲除能抑制血腦屏障損傷和炎癥誘導的神經元損傷，MCAO能誘導轉化生長因子β活化激酶1（transforming growth factor-activated kinase 1，TAK1）（RIP1的一個抑制劑）的降解，并誘導壞死性凋亡向凋亡過渡；而敲除小膠質細胞/浸潤巨噬細胞和神經元的TAK1，可加重腦缺血[35]。在缺血再灌注損傷模型中顯示，M1型巨噬細胞可通過分泌TNF-α，誘導內皮細胞壞死性凋亡，導致血腦屏障通透性增加，而給予英夫利昔單抗（TNF-α單抗）可明顯改善內皮細胞壞死性凋亡，抑制血腦屏障通透性增加，從而改善卒中預后[44]。此外，缺血后1 h和24 h給予salubrinal（選擇性eIF2α抑制劑），能抑制壞死性凋亡和神經元丟失，說明內質網應激也參與了壞死性凋亡[37]。以上證據表明，壞死性凋亡與缺血性卒中密切相關，并且對其進行調控可以改善缺血性卒中后腦損傷和神經功能。

3.3 出血性腦卒中動物研究

在膠原酶誘導的腦出血模型中，腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）后24 h電鏡下觀察到壞死性凋亡的超微結構，而RIP3缺陷小鼠ICH后壞死性凋亡細胞較少[45]。在自體血注射的蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）模型中，Shuai等[46]報道，SAH后RIP3在大鼠腦表達增加，損傷后24 h達到峰值。此外，使用RIP3抑制劑（GSK872）或者敲除RIP3可降低SAH誘導的腦損傷，而過表達RIP3則加重腦損傷和神經損傷。通過藥物抑制RIP1或基因敲除RIP1，能改善ICH動物的腦水腫和神經系統(tǒng)功能，含氧血紅蛋白誘導的離體細胞模型中也證實該結果[47]。Nec-1可顯著減少膠原酶誘導的ICH動物腦血腫體積，抑制細胞壞死性凋亡，減少血腦屏障開放，緩解水腫，改善神經行為學[48]。在血管內穿刺誘導的SAH大鼠模型中顯示，腦內RIP1、RIP3、磷酸化DRP1和NLRP3炎癥小體含量增加，而給與Nec-1能抑制RIP1、RIP3、磷酸化DRP1表達和NLRP3炎癥小體，減輕腦損傷[49]。SAH后腦室內給予Nec-1，可抑制cAMP反應元件結合蛋白和腦源性神經營養(yǎng)因子的下降，從而抑制壞死性凋亡，發(fā)揮神經保護作用[50]。此外，Nec-1預處理能抑制SAH大鼠腦內基質金屬蛋白酶9活化，從而減少緊密連接蛋白的降解，抑制血腦屏障通透性增加和神經炎癥，發(fā)揮神經保護作用[51]。Nec-1在抑制壞死性凋亡的同時，也能通過抑制凋亡和自噬，對ICH發(fā)揮神經保護作用。

4 展望

在過去對卒中的研究中，大量的藥物在臨床前研究被證明有效，但并未在后續(xù)的臨床試驗中獲得證實。因此，對于壞死性凋亡在臨床卒中的治療作用，還需要大量的研究進行探索。除此之外，卒中時其他細胞是否也會出現壞死性凋亡及其在卒中中的致病作用，也需要進一步的探究?？偟膩碚f，盡管抑制壞死性凋亡很有可能作為臨床上治療卒中的靶標，但仍需更多的臨床前和臨床研究以證實這些治療的療效及其安全性，為臨床使用奠定基礎。