丁小芬 周友龍 田明月 賈夢雅 李彥華 楊志孟

(河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046)

膝關節(jié)骨性關節(jié)炎是一種以軟骨破壞、軟骨下骨改變、骨贅形成及韌帶和半月板改變?yōu)樘卣?，多見于老年人關節(jié)退行性疾病〔1〕，軟骨破壞是膝骨性關節(jié)炎主要的病理狀態(tài)〔2〕。膝骨性關節(jié)炎被認為是65歲以上人群致殘的主要原因，由于肥胖和人口老齡化，其發(fā)病率正在上升〔3〕。調查顯示，膝關節(jié)骨性關節(jié)炎60歲以上患病率達50%，在75歲以上人群中患病率高達80%，致殘率為53%，發(fā)病率的增加帶來了嚴重的醫(yī)學和社會問題〔4～6〕。Wnt信號通路是調節(jié)發(fā)育、生長、內穩(wěn)態(tài)和疾病中的關鍵生物過程，特別是在關節(jié)和骨骼中，膝骨性關節(jié)炎的發(fā)病和嚴重程度與關節(jié)軟骨中Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路明顯相關〔7〕。本文通過Wnt/β-catenin信號通路探討膝骨性關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的分子機制、研究軟骨代謝對膝骨性關節(jié)炎的相關作用，為臨床診療提供支持。

1 Wnt信號通路

Wnt名字的由來：Wingless最早在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，是可以導致翅膀組織缺失的基因。Int1基因發(fā)現(xiàn)位于小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)整合位點附近，且與Wingless基因具有同源性、功能相似，故將二者名字合并得名為Wnt〔8〕。Wnt信號轉導通路分為經典的Wnt/β-catenin信號通路、Wnt/Ca2+信號通路、Wnt/平面細胞極性(PCP)信號通路。近年來，學者發(fā)現(xiàn)研究最多的經典Wnt/β-catenin信號通路在膝骨性關節(jié)炎的發(fā)病過程中起到重要的作用〔9，10〕，與膝骨性關節(jié)炎患者軟骨細胞的分化、增殖和凋亡有關，此通路的異常會導致膝骨性關節(jié)炎的形成。

1.1經典Wnt/β-catenin信號通路的組成 經典信號通路是由細胞外的信號蛋白、細胞膜上的跨膜受體、內源性抑制劑、胞質蛋白、核內轉錄因子、下游靶基因組成〔11〕。其中信號蛋白是Wnt蛋白家族，該蛋白是一類廣泛存在的分泌型糖蛋白，已發(fā)現(xiàn)有19個成員，其中Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a和Wnt10a等已被證實參與β-catenin上游基因激活經典通路〔12～15〕；跨膜受體包括低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)5/6、卷曲蛋白(Fzd)；胞質蛋白包括軸蛋白(Axin)、散亂蛋白(Dsh)、腺瘤性結腸息肉病基因(APC)、β-catenin、糖原合成酶激酶(GSK)-3β；核內轉錄因子有T淋巴因子(TCF)和淋巴增強因子(LEF)；下游靶基因包括基質金屬蛋白酶(MMP)、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)等。Wnt通路特異性抑制物有分泌性Dickkopf相關蛋白(DKK)-1、分泌型FZ相關蛋白(sFRP)、Wnt抑制因子(WIF)、硬化蛋白(SOST)等〔16〕，Wnt/β-catenin信號通路的各靶點都至關重要，在生理調控方面起關鍵作用。

1.2經典Wnt/β-catenin信號通路的轉導 Wnt信號轉導是一種進化上保守的信號轉導途徑，控制發(fā)育的多個方面，包括細胞增殖、細胞命運決定、凋亡、細胞遷移和發(fā)育過程中的細胞極〔17〕。當細胞外存在Wnt信號通路特異性抑制物(如DKK-1、SOST、WIF1、sFRP等)時，Wnt蛋白無法與受體Frz和輔助受體LRP5/6結合，APC、GSK-3β、Axin三者形成的降解復合物與細胞質中的β-catenin結合，該降解復合物上的GSK-3β可使β-catenin磷酸化后通過泛素蛋白酶體途徑降解，導致細胞質中的β-catenin水平顯著降低；當不存在Wnt信號通路抑制物時，Wnt蛋白通過與膜上的跨膜受體Frz和LRP5/6結合，阻礙APC、GSK-3β和Axin三者形成降解復合物，從而抑制β-catenin的磷酸化，導致β-catenin在細胞質內聚集，當達到一定量時，β-catenin向細胞核內轉移與TCF/LEF轉錄復合物結合，該復合物作為轉錄激活因子可引起經典Wnt信號通路的靶基因表達，從而發(fā)揮調控作用〔18〕。在正常機體內，Wnt/β-catenin信號通路的抑制和激活同時存在，維持動態(tài)平衡，并與機體生長狀態(tài)相適應〔19〕。

2 Wnt/β-catenin信號通路與膝骨性關節(jié)炎軟骨代謝

Wnt/β-catenin信號通路的傳導在膝關節(jié)骨性關節(jié)炎期間調節(jié)軟骨細胞分化中起著重要作用〔20〕，該通路下游基因和蛋白表達可影響關節(jié)軟骨生長代謝，與關節(jié)軟骨損傷相關〔21〕，這一經典途徑的激活，已被認為參與膝骨性關節(jié)炎的加重〔22〕。

2.1DKK-1 DKK是Wnt/β-catenin信號通路的信號抑制劑，經典的Wnt拮抗家族，可與跨膜受體LRP5/6結合，阻止細胞外Wnt蛋白的配體作用，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路的轉導〔23〕。DKK-1是一種分泌性糖蛋白，是Wnt/β-catenin信號通路上游的主要抑制因子之一，可以抑制骨形成〔24〕。Oh等〔23〕觀察到無論是通過關節(jié)內注射表達DKK-1的腺病毒(AdDKK-1)還是在軟骨細胞特異性DKK-1轉基因小鼠的背景下，關節(jié)軟骨中DKK-1的過度表達對包括關節(jié)軟骨破壞、骨贅形成和軟骨下骨硬化在內的膝骨性關節(jié)炎發(fā)病都具有保護作用，且DKK-1的抑制作用與其抑制Wnt介導的分解代謝因子(如MMP-13)在關節(jié)軟骨細胞中的表達能力有關。Sassi等〔10〕使用DKK-1處理的去分化人類關節(jié)軟骨細胞模型，研究結果顯示成纖維細胞樣形態(tài)出現(xiàn)延遲，表明DKK-1能起到抑制膝骨性關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的作用。Funck-Brentano等〔25〕發(fā)現(xiàn)DKK-1可能通過介導的Wnt/β-catenin信號通路，抑制β-catenin移位進入細胞核，控制軟骨下骨的激活，降低骨贅的破壞生成，導致膝骨性關節(jié)炎的嚴重程度降低。

2.2Wnt3a Wnt蛋白是Wnt/β-catenin信號通路的啟動因子。Wnt信號的穩(wěn)態(tài)水平對干細胞增殖、軟骨細胞分化和功能至關重要，該信號在膝骨性關節(jié)炎關節(jié)組織中上調，并驅動骨分化、軟骨降解、軟骨細胞肥大和炎癥〔26〕。在哺乳動物中，鑒定出19種Wnt蛋白，小鼠Wnt3a蛋白是第一個具有生化特性的蛋白〔10〕。Liu等〔27〕發(fā)現(xiàn)正常運動誘導膝骨性關節(jié)炎和損傷運動誘導膝骨性關節(jié)炎大鼠模型中，Wnt3a和β-catenin蛋白水平增加，Ⅱ型膠原減少。Wnt3a是Wnt/β-catenin信號通路典型的、特征良好的激活劑，在關節(jié)炎中有既定的作用，并且在關節(jié)軟骨中表達〔28〕。Thomas等〔29〕研究發(fā)現(xiàn)在Wnt3a刺激的軟骨細胞中分解代謝蛋白酶(MMP、ADAMTS-4和5)的表達上調，促進細胞外基質(ECM)的降解；Wnt3a會誘導MMP13基因在小鼠原代軟骨細胞中快速表達，導致骨關節(jié)炎樣表型〔30〕；Lietman等〔31〕也發(fā)現(xiàn)Wnt3a略微增加了人軟骨細胞中MMP-13的表達。Bouaziz等〔32〕發(fā)現(xiàn)Wnt3a可通過增強β-catenin到細胞核中的易位來增加Wnt/β-catenin的轉錄活性，增強分解代謝物(ADAMTS-4和5、MMP3、MMP-13)的表達。

2.3β-catenin β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的核心元件〔33〕，在軟骨細胞的分化、成熟、凋亡中發(fā)揮重要作用，細胞中β-catenin表達多少決定著經典Wnt信號通路是否被激活〔34〕。Zhu等〔35〕發(fā)現(xiàn)成年小鼠關節(jié)軟骨細胞中β-catenin的激活導致MMPs的明顯增加，引起ECM降解，軟骨細胞過早分化并發(fā)展成膝骨性關節(jié)炎樣表型。Zhou等〔36〕發(fā)現(xiàn)條件性激活β-catenin信號的轉基因小鼠表現(xiàn)出嚴重的軟骨變性、軟骨下骨侵蝕和骨贅形成。Held等〔37〕通過對β-catenin進行染色，測試該蛋白是否作為典型Wnt信號轉導的突出效應器，實驗觀察到隨著膝骨性關節(jié)炎分級的增加，β-catenin染色增加，這證實了人膝骨性關節(jié)炎軟骨中典型Wnt信號的激活。Bouaziz等〔38〕發(fā)現(xiàn)阻斷β-catenin/TCF的相互作用，能夠減輕小鼠的膝骨性關節(jié)炎表型并下調MMP-13的表達。研究表明〔39，40〕，β-catenin缺失的軟骨細胞降低了骨保護素的表達或增加了核因子(NF)-κB配體的受體激活因子的活性，導致破骨細胞形成增加，小梁骨形成和重塑減少。

2.4MMP-13 MMPs是一種蛋白水解酶，是Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因。在人類MMP家族中至少有26種類型的分子，與正常軟骨相比，MMP-1、MMP-3、MMP-13和MMP-28在膝骨性關節(jié)炎軟骨中的表達明顯增強，特別是MMP-13在軟骨破壞中發(fā)揮中心作用〔2〕。MMP-13是在對乳腺癌組織研究時被發(fā)現(xiàn)與鑒定出來的，其在正常組織中不表達，而在膝骨性關節(jié)炎軟骨細胞中有高表達〔41〕。MMPs主要參與膝骨性關節(jié)炎中ECM的分解，其表達增加與膝骨性關節(jié)炎的進展密切相關，在這些MMPs中，MMP-13通過降解ECM被認為在膝骨性關節(jié)炎的進展中發(fā)揮關鍵作用，例如Ⅱ型膠原的降解，這是ECM的主要組成成分〔42〕。Yuasa等〔43〕發(fā)現(xiàn)Wnt3a激活Wnt/β-catenin途徑后，兔關節(jié)軟骨中的MMP-3和MMP-13的基因表達增加。先前的一項研究還發(fā)現(xiàn)，轉基因小鼠中MMP-13的高表達水平可導致膝骨性關節(jié)炎樣病理改變的出現(xiàn)〔44〕，Wnt/β-catenin信號通路在這一過程中起重要作用，β-catenin的過度表達可導致MMP-13基因表達增加，從而導致軟骨基質降解〔27〕。因此，抑制MMP-13的表達可能給予軟骨保護，這在膝骨性關節(jié)炎的治療中具有治療價值〔45〕。

3 中西醫(yī)調控Wnt/β-catenin信號通路與膝骨性關節(jié)炎軟骨代謝

Wnt/β-catenin信號通路的轉導是調節(jié)膝骨性骨關節(jié)炎發(fā)展的獨特信號通路，參與了膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的發(fā)病機制〔46〕。越來越多的研究者通過大量的實驗，用不同的干預方法證實了Wnt/β-catenin通路與膝骨性關節(jié)炎有著特殊的聯(lián)系。

3.1中醫(yī)療法 顏春魯?shù)取?7〕研究發(fā)現(xiàn)大劑量右歸丸干預后，能夠有效促進膝骨性關節(jié)炎模型組大鼠DKK-1mRNA和蛋白的表達，抑制WISP1、Wnt1、β-catenin和LRP5 mRNA和蛋白質表達，進而推測右歸丸可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路起到治療膝骨性關節(jié)炎的目的。還發(fā)現(xiàn)富硒黃芪皂苷的治療機制可能是通過升高DKK-1基因和蛋白的表達，降低WISP1、β-catenin、LRP5基因和蛋白的表達，實現(xiàn)對膝骨性關節(jié)炎的治療作用〔48〕。何曉娟等〔49〕研究結果顯示跳骨片治療膝關節(jié)骨性關節(jié)炎可能通過上調GSK-3β的表達、下調β-catenin、Frizzled-2的表達，調控Wnt/β-catenin信號通路，達到保護關節(jié)軟骨的作用。Zhong等〔50〕發(fā)現(xiàn)青蒿素通過抑制白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α和MMP-13等促炎趨化因子和細胞因子的表達，在IL-1β誘導的大鼠OA軟骨細胞和OA患者來源的細胞中顯示出強大的抗炎作用。鄺高艷等〔51〕研究發(fā)現(xiàn)加味獨活寄生合劑治療膝骨性關節(jié)炎的作用機制可能與調控Wnt信號通路有關，通過抑制炎癥反應，從而減輕疼痛，改善膝骨關節(jié)功能。馬勇等〔52〕研究初步證明了姜黃素對軟骨細胞的保護作用是通過調控Wnt/β-catenin信號通路，從而促進正常軟骨細胞增殖，中藥姜黃具有抗骨關節(jié)炎作用，是因為姜黃素是有效成分之一。張媛媛等〔53〕通過電針“內膝眼”“犢鼻”可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的轉導，降低下游靶基因MMP-13的表達，從而抑制軟骨基質的降解和軟骨細胞的凋亡，起到延緩膝骨性關節(jié)炎發(fā)展進程的作用。周偉等〔54〕在對活血膏作用于膝骨性關節(jié)炎作用機制探討中發(fā)現(xiàn)膝骨性關節(jié)炎發(fā)病后的確存在Wnt/β-catenin信號通路被激活，抑制該通路過表達是治療膝骨性關節(jié)炎的關鍵，發(fā)現(xiàn)活血膏可明顯抑制這一過程。

3.2西醫(yī)療法 Yu等〔55〕發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可以緩解膝骨性關節(jié)炎相關的疼痛，抑制OA患者的Wnt/β-catenin信號轉導，該信號通路途徑的調節(jié)在辛伐他汀誘導的軟骨細胞分化的調節(jié)中起重要作用。Xu等〔56〕通過研究首次證明聚半乳酸通過抑制Wnt/β-catenin和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路抑制大鼠軟骨細胞MMPs的表達和軟骨細胞的炎癥反應，表明聚半乳酸可以作為OA的治療劑。姜鵬等〔57〕研究發(fā)現(xiàn)關節(jié)腔注射臭氧后膝關節(jié)軟骨β-catenin和MMP-13表達降低，臭氧可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活治療膝關節(jié)骨性關節(jié)炎。吳小川〔58〕探討阿侖膦酸鈉治療膝骨性關節(jié)炎作用機制發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin可與骨保護素(OPG)/NF-κB受體活化因子(RANK)/RANK配體(RANKL)等信號通路共同作用于軟骨細胞軟骨下骨，并影響下游MMP-13、β-catenin及Ⅱ型膠原蛋白的表達，起到治療膝骨性關節(jié)炎的作用。

綜上，近年來，學者們主要著眼于細胞因子水平的研究，調控內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的眾多信號通路成為研究的熱點，炎癥介質、生長因子和不同的信號通路可能同時參與了這個過程并相互影響，如Wnt、NF-κB、MAPK、OPG/RANK/RANKL、Notch等信號通路〔59，60〕與膝骨性關節(jié)炎的發(fā)病關系均可查到相關文獻，為進一步闡明膝骨性關節(jié)炎的發(fā)病機制奠定了基礎。開發(fā)選擇性地針對該途徑的關鍵調控因子，作為治療膝骨性關節(jié)炎等許多骨疾病的新治療方式的基礎療法似乎具有很大潛力，并且在這方面的動物實驗已經取得了一些進展。雖然動物實驗對于闡明Wnt信號轉導調節(jié)軟骨生物學和病理學的細胞和分子機制至關重要，但人類生物學方面的多樣性和復雜性遠遠高于其他生物，人類是高級生物，因此，我們不應該高估動物實驗的結果，應該謹慎地將這些發(fā)現(xiàn)應用于人類。我們已經了解到該途徑在骨生物學的許多方面發(fā)揮的核心作用，但還需要更細致的了解Wnt/β-catenin信號通路在生理和病理環(huán)境下是如何運作的，才能尋找出該通路上最有效增強劑或抑制劑來治療膝骨性關節(jié)炎。