張苗，文紅*，張啟恒，董曼，徐成，黃亞平

1. 湖北省食品質量安全監(jiān)督檢驗研究院（武漢 430075）；2. 湖北省食品質量安全檢測工程技術研究中心（武漢 430075）

白酒之所以具有醇甜之感，主要來源于糧食發(fā)酵過程中產生的醇類，特別是多元醇，因甜味來自醇基，當物質的羥基增加時，其醇的甜味也增加，多元醇都有甜味基團和助甜基團，如己六醇、丙三醇、丁四醇、戊五醇等[1-2]。品質優(yōu)良的白酒由于其復雜特殊的釀造工藝，在發(fā)酵過程中就能產生一些醇甜物質，但這一切的實現(xiàn)都需要一定時間、精良的技術以及優(yōu)良的原料。而很多技術工藝不達標、原材料品質不好的小酒廠為了讓酒口感變好，可能會在制造過程中添加一些甜味劑和其他物質來賦予酒類良好的口感[3-7]。

甜味劑在GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》中的定義是賦予食品甜味的物質，根據(jù)標準白酒中大部分甜味劑都是不得使用的，通過市場監(jiān)管總局每年抽檢監(jiān)測公布的白酒不合格數(shù)據(jù)來看，因為超范圍使用甜味劑的情況占整體不合格率的比重較大，說明在白酒的生產過程中還存在違規(guī)添加甜味劑的情況。因此，建立一種高準確度、高靈敏度、高效快速的甜味劑檢測方法，加強白酒中甜味劑的監(jiān)管就顯得尤為重要。

目前國家抽檢監(jiān)測白酒中甜味劑的項目主要是甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜和紐甜這8種。通過查詢相應實施細則和國家標準方法發(fā)現(xiàn)，這8種甜味劑只有甜蜜素采用高效液相色譜-質譜聯(lián)用法，其余的糖精鈉、三氯蔗糖、紐甜這3種甜味劑均采用高效液相色譜法，而現(xiàn)有檢測甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、安賽蜜、阿斯巴甜的國家標準方法不適用于白酒的檢測。

目前國內有關檢測甜味劑的方法主要有液相色譜法[8-9]、離子色譜法[10-11]、毛細管電泳法[12-13]、電化學法[14]等，主要以液相色譜法為主。由于不同甜味劑的分子結構式、化學性質和光譜性質存在差異，以上方法在測定這8種甜味劑混合物時存在一定的缺陷，一般只能用來分析其中一種或結構相似的幾種甜味劑混合物。其中，液相色譜-串聯(lián)質譜法[15]因其選擇性強、靈敏度高和抗干擾能力強的優(yōu)點在甜味劑的分析檢測中被廣泛應用。然而，已報道的質譜檢測方法并未完全覆蓋國家抽檢監(jiān)測的這8種甜味劑。

試驗建立了高效液相色譜-質譜聯(lián)用法同時檢測白酒中8種甜味劑的方法，通過考察稀釋倍數(shù)和增加加熱凈化的步驟，基本上排除了基質效應的影響，提升了該方法檢測結果的穩(wěn)定可靠性。方法簡單快捷、準確可靠，既能確保檢驗結果的準確性，又能提高檢驗效率。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

TQD超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀（美國Waters公司）；分析天平（瑞士梅特勒公司）；渦旋混勻器（德國IKA公司）；Milli2Q型超純水器（美國Millipore公司）；恒溫水浴鍋（德國美墨爾特公司）。

乙腈（色譜純，德國Merck公司）；乙酸銨（色譜純，美國Sigma公司）；甲酸（色譜純，上海安譜科學儀器有限公司）。

對照品：甜菊糖苷（Stevioside，純度99.7%，CAS號57817-89-7）、甜菊雙糖苷（Steviolbioside，純度98.7%，CAS號41093-60-1）、安賽蜜（Acesulfame Potassium，純度99.0%，CAS號33665-90-6）、糖精鈉（Sodium saccharine，純度99.9%，CAS號128-44-9）、甜蜜素（Sodium N-cyclohexylsulfamate，純度98.9%，CAS號139-05-9）、三氯蔗糖（Sucralose，純度99.0%，CAS號56038-13-2）、阿斯巴甜（Aspartame，純度97.2%，CAS號22839-47-0）、紐甜（Neotame，純度99.4%，CAS號165450-17-9），均購于上海安譜科學儀器有限公司。

1.2 標準溶液的配制

分別稱取10.0 mg甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜標準品，用水溶解并定容至10.0 mL容量瓶中，配制成質量濃度均為1.0 mg/mL的單標儲備液，置于4 ℃冰箱中保存。

用移液器分別準確移取1.0 mL單標儲備液于100.0 mL容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，配制成質量濃度為10.0 μg/mL的混合標準中間液；最后，移取不同體積的混合標準中間液，用空白基質配制成一系列不同濃度的混合標準工作液，臨用前配制。

1.3 樣品前處理

稱取10.0 g（精確至0.01 g）酒樣，置于50 mL燒杯中，在60 ℃水浴中邊加熱邊用玻璃棒攪拌約10 min，殘渣全部轉移至100.0 mL容量瓶中，用10 mL超純水洗燒杯并轉移至容量瓶中，用水定容至刻度并搖勻，經0.22 μm水相微孔濾膜過濾后備用。如果樣品溶液的甜味劑含量過高，可根據(jù)實際濃度適當稀釋至標準曲線范圍內。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱為Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫為30 ℃；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水；流速為0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0～0.5 min，10% A；0.5～2.5 min，10% A～90% A；2.5～3.0 min，90% A；3.1～3.5 min，90% A～10% A；3.6～5.0 min，10% A。進樣量為5 μL。

1.4.2 質譜條件

離子源為電噴霧電離（ESI）源；根據(jù)被測化合物在正、負離子掃描模式下響應靈敏度的大小，選擇正離子掃描方式或負離子掃描方式；檢測模式為多反應監(jiān)測（MRM）模式。質譜采用正、負離子同時掃描，去溶劑氣流量為1 000 L/Hr；去溶劑氣溫度為450℃；毛細管電壓為2.50 kV。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

試驗分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水作為流動相體系時的分離效果，結果發(fā)現(xiàn)使用乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時，所有目標化合物均能在5.0 min以內出峰，且大部分化合物響應比使用其他3種流動相時響應明顯增強，化合物之間分離效果較好。因此，選擇使用乙腈-0.1%甲酸水作為流動相體系，此時8種目標化合物分析時間較短，分離效果好且響應高。

2.2 質譜條件的優(yōu)化

首先采用手動調諧中MS Scan（全掃描）的方式進行質譜全掃描檢測，得出被測化合物的一級質譜圖，找出每個化合物對應的母離子，通過調整毛細管電壓、錐孔電壓、去溶劑氣溫度、去溶劑氣流量，找到目標母離子最強的信號，確定母離子的準確質量數(shù)。然后打開氬氣采用子離子掃描，確定主要離子碎片后，通過優(yōu)化各個子離子的碰撞能量，最后得到甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜8種甜味劑的最優(yōu)質譜參數(shù)，如表1所示。甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、安賽蜜、糖精鈉、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜僅在負離子模式下有很好的響應，而甜蜜素在正負離子模式下均有明顯的響應，故采用正負離子同時監(jiān)測掃描。使用TQD超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀對8種甜味劑進行分析，各待測化合物的多反應監(jiān)測色譜圖見圖1。

圖1 8種目標化合物的多反應監(jiān)測色譜圖

表1 8種目標化合物的質譜參數(shù)

2.3 方法學評價

2.3.1 基質效應

由于白酒是以曲類、酒母為糖化發(fā)酵劑，利用淀粉質原料，經蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾、陳釀和勾兌而釀制成的酒，基質中的雜質成分復雜，以電噴霧電離源為離子源的質譜分析可能會產生基質效應，影響分析結果的準確度和靈敏度。在沒有稀釋的白酒原液中加入一定量的混合標準溶液，配制成質量濃度為100 ng/mL的加標樣品，以考察基質效應對目標化合物的影響。結果表明，白酒樣品受基質干擾影響比較大，采用定容溶劑配制成的標準曲線處理加標樣品，大部分的目標化合物回收率均低于80%。

為了消除白酒基質對目標化合物定量的影響，在前處理中加入待處理樣品在60 ℃水浴中邊加熱邊用玻璃棒攪拌約10 min這一步驟，目的是為了除去白酒樣品中沸點較低的醛類和醇類，起到凈化樣品的作用。然后考察白酒稀釋1，2，5，10和20倍后，白酒樣品作為定容溶劑繪制標曲曲線。結果表明，稀釋10倍和20倍的白酒樣品作為定容溶劑配制的標準曲線相關系數(shù)R2均大于0.995，而稀釋倍數(shù)在10倍以下的白酒樣品作為定容溶劑配制的標準曲線相關系數(shù)R2均小于0.99?？紤]到稀釋倍數(shù)會影響方法的檢出限和定量限，試驗最終采用稀釋10倍的白酒樣品作為空白基質配制標準曲線進行方法學考察。

2.3.2 方法的線性范圍、檢出限和定量限

取1.2小節(jié)配制的混合標準工作液，以目標化合物的定量離子的峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。結果表明，在考察的線性范圍內，8種目標化合物均呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)均≥0.995。

通過向白酒的陰性樣品中添加8種待測成分，考察方法的檢出限（S/N≥3）和定量限（S/N≥10），不同目標物的檢出限為15～30 μg/kg，定量限為50～100 μg/kg（見表2）。

表2 8種目標化合物的線性范圍、檢出限和定量限

2.3.3 回收率和精密度

按照1.3小節(jié)的前處理方法，向空白基質中準確加入一定量的混合標準溶液，配制成4個水平（50，100，200和500 μg/kg）的加標樣品，進行加標回收率和精密度試驗（n=6），結果見表3。空白基質中8種化合物的平均回收率為80.2%～97.4%，相對標準偏差為2.4%～9.7%。方法的加標回收率和精密度均符合GB/T 27404實驗室質量控制規(guī)范的要求。

表3 白酒中8種目標化合物的加標回收率和相對標準差（n=6）

2.4 實際樣品檢測

采用試驗方法對某酒廠送檢的4種不同類型的原酒進行檢測。結果表明：#1號樣品檢測出三氯蔗糖、紐甜、阿斯巴甜、糖精鈉、安賽蜜、甜蜜素、甜菊糖苷這7種甜味劑，質量分數(shù)分別是131，1 978，3 174，924，135，128和140 μg/kg；#2號樣品檢測出紐甜、阿斯巴甜、糖精鈉這3種甜味劑，質量分數(shù)分別是540，1 180和101 μg/kg；#3號樣品檢測出三氯蔗糖、紐甜、阿斯巴甜、糖精鈉、安賽蜜、甜蜜素這6種甜味劑，質量分數(shù)分別是142，2 210，2 880，999，142和121 μg/kg；#4號樣品檢測出紐甜、阿斯巴甜、糖精鈉這3種甜味劑，質量分數(shù)分別是403，1 300和58.2 μg/kg。

3 結論

試驗建立了高效液相色譜-質譜聯(lián)用法同時測定白酒中8種甜味劑的方法。方法靈敏度高、前處理簡單且回收率良好，適用于白酒中多組分甜味劑的同時快速定性和定量分析，可以為白酒中甜味劑的檢測工作提供有力的技術支持。