朱鐘妍，陳 楓，王 旋

0 引言

哮喘是一種慢性炎癥性疾病，以氣道阻塞和支氣管高反應(yīng)性為特征，臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的喘息、咳嗽、胸悶和呼吸急促，其病因尚未完全闡明，可能與基因和環(huán)境相互作用有關(guān)[1]。近年發(fā)表在柳葉刀的一項(xiàng)全國性橫斷面調(diào)查顯示，中國哮喘的總體患病率為4.2%[2]。目前哮喘的西醫(yī)治療包括糖皮質(zhì)激素、β2受體激動(dòng)劑、靶向生物制劑、變應(yīng)原免疫療法等[3]。但是由于長期使用西藥可能具有不良反應(yīng)和耐藥性，很多人也選擇口服中藥治療哮喘，亦取得了較好的療效。苓甘五味姜辛湯記載于《金匱要略》，包括茯苓、甘草、五味子、干姜、細(xì)辛五味中藥，是治療寒飲伏肺的代表方，臨床上常用于治療哮喘等肺系疾病。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，融合了計(jì)算機(jī)科學(xué)、生物信息學(xué)的新興交叉學(xué)科，可用于分析藥物與疾病和靶點(diǎn)之間“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”的協(xié)同作用關(guān)系，在闡釋中藥藥理機(jī)制、探究中藥的毒性機(jī)制、中藥新藥研發(fā)等方面發(fā)揮了重要作用[4]。分子對接是從已知結(jié)構(gòu)的受體及配體出發(fā)，依照幾何、能量、化學(xué)環(huán)境三大互補(bǔ)原則，進(jìn)行分子間的相互作用識(shí)別，并預(yù)測分子間的最佳結(jié)合模式，在中藥有效成分潛在靶點(diǎn)及作用機(jī)制探索、中藥復(fù)方藥理機(jī)制研究等方面具有重要價(jià)值和潛在優(yōu)勢[5]。本研究擬通過中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，探討苓甘五味姜辛湯治療哮喘的潛在作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 ①數(shù)據(jù)庫：中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP，https∶//tcmspw.com/index.php)[6]、Uniprot數(shù)據(jù)庫(http∶//www.uniprot.org)[7]、GeneCards數(shù)據(jù)庫(https∶//www.genecards.org)、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(https∶//www.disgenet.org)、TTD數(shù)據(jù)庫(http∶//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https∶//www.drugbank.ca)[8]、String數(shù)據(jù)庫(Version 11.0，https∶//string-db.org)[9]、DAVID數(shù)據(jù)庫(https∶//david.ncifcrf.gov)[10]和PDB數(shù)據(jù)庫(https∶//www.rcsb.org)。②在線繪圖工具：Venny(Version 2.1.0，https∶//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)，Bioinformatics(http∶//www.bioinform atics.com.cn)。③軟件：Cytoscape軟件(version 3.8)、AutoDock軟件(version 4.2.6)、AutoDock Tools軟件(version 1.5.6)和PyMOL軟件(version 2.4.0)。

1.2 苓甘五味姜辛湯成分及靶點(diǎn)篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫分別收集茯苓、甘草、五味子、干姜、細(xì)辛的化學(xué)成分，按照ADME進(jìn)行活性成分篩選，滿足口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18兩個(gè)條件。同時(shí)參考2015版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的中藥有效成分含量測定對其進(jìn)行補(bǔ)充。得到各藥物的活性成分后，在TCMSP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相應(yīng)靶點(diǎn)的檢索，應(yīng)用Uniprot數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)名稱進(jìn)行規(guī)范。采用Cytoscape軟件繪制苓甘五味姜辛湯活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 哮喘靶點(diǎn)篩選 以“asthma”(MeSH)為關(guān)鍵檢索詞，通過GeneCards、DisGeNET、TTD以及DrugBank數(shù)據(jù)庫檢索哮喘靶點(diǎn)。其中，Genecards數(shù)據(jù)庫的“Relevance score”和DisGeNET數(shù)據(jù)庫的“Score”均表示該靶點(diǎn)與檢索疾病的關(guān)聯(lián)度，若靶點(diǎn)過多則根據(jù)關(guān)聯(lián)度的中位數(shù)進(jìn)行篩選。將以上數(shù)據(jù)庫得到的靶點(diǎn)經(jīng)行合并，刪除重復(fù)值后得到哮喘靶點(diǎn)。

1.4 共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)獲取 通過Venny將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，獲得苓甘五味姜辛湯與哮喘的共同靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。將得到的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，模式選擇“Multiple Protein”，物種選擇“Homo sapiens”，最低相互作用值設(shè)置為“Highest confidence(0.900)”，并隱藏游離節(jié)點(diǎn)，其他參數(shù)不變。將得到的node1、node2、combined score導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析。通過該軟件的Network analyzer功能進(jìn)行拓?fù)浞治?，并根?jù)degree值調(diào)整節(jié)點(diǎn)的大小、顏色深淺和透明度。同時(shí)采用該軟件內(nèi)置的cytoHubba插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行MCC算法。將degree前10位靶點(diǎn)與MCC算法前10位靶點(diǎn)取交集，得到苓甘五味姜辛湯治療哮喘的核心靶點(diǎn)。

1.5 GO富集及KEGG通路分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫對苓甘五味姜辛湯與哮喘的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集及KEGG通路分析。格式選擇“OFFICIAL GENE SYMBOL”，物種及背景均選擇“Homo sapiens”，分別進(jìn)行細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)、生物過程(BP)以及KEGG通路分析。將數(shù)據(jù)導(dǎo)出后按P值進(jìn)行排序，每項(xiàng)均選取P值最小的20個(gè)采用Bioinformatics繪制高級氣泡圖。

1.6 “苓甘五味姜辛湯成分-哮喘靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將共同靶點(diǎn)對應(yīng)的活性成分、共同靶點(diǎn)、前20條KEGG通路導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建“苓甘五味姜辛湯成分-哮喘靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。通過該軟件的Network analyzer功能進(jìn)行拓?fù)浞治觯鶕?jù)degree值篩選出苓甘五味姜辛湯治療哮喘的核心成分。

1.7 分子對接 將篩選出的核心成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行AutoDock分子對接。從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載核心成分的mol2格式文件，導(dǎo)入PyMOL轉(zhuǎn)化為pdb格式，之后導(dǎo)入AutoDock Tools保存為pdbqt 格式。從PDB數(shù)據(jù)庫下載核心靶點(diǎn)的pdb格式文件(選擇分辨率<3A且具有配體的蛋白復(fù)合物)，通過PyMOL進(jìn)行去水、加氫、去除原配體等處理，原子類型設(shè)定為Assign AD4 type，之后導(dǎo)入AutoDock Tools保存為pdbqt 格式。將蛋白復(fù)合物原配體所在的空間位置定義為活性口袋，選擇Lamarckian遺傳算法，運(yùn)行AutoDock進(jìn)行分子對接，以結(jié)合自由能為參考進(jìn)行篩選，最后利用PyMOL將最佳對接結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 苓甘五味姜辛湯成分及靶點(diǎn)獲取 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查找藥物成分，根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18進(jìn)行篩選，同時(shí)參考2015版《中華人民共和國藥典》，補(bǔ)充了甘草的成分甘草酸、五味子的成分五味子醇甲、干姜的成分6-姜辣素、細(xì)辛的成分細(xì)辛脂素。剔除無靶點(diǎn)成分并去除重復(fù)后，共獲得114個(gè)活性成分。其中，茯苓獨(dú)有成分6個(gè)、甘草獨(dú)有成分86個(gè)、五味子獨(dú)有成分8個(gè)、干姜獨(dú)有成分4個(gè)、細(xì)辛獨(dú)有成分7個(gè)、甘草和干姜共有成分1個(gè)、甘草和細(xì)辛共有成分1個(gè)、干姜和細(xì)辛共有成分1個(gè)。將114個(gè)活性成分按OB值由大到小排列，排名前20的成分見表1。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索，并應(yīng)用Uniprot數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)名稱進(jìn)行規(guī)范，共搜索到茯苓靶點(diǎn)22個(gè)、甘草靶點(diǎn)228個(gè)、五味子靶點(diǎn)20個(gè)、干姜靶點(diǎn)57個(gè)、細(xì)辛靶點(diǎn)108個(gè)，去重后共得到苓甘五味姜辛湯靶點(diǎn)250個(gè)。利用Cytoscape軟件繪制苓甘五味姜辛湯活性成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。

表1 苓甘五味姜辛湯活性成分前20位

圖1 苓甘五味姜辛湯活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 哮喘靶點(diǎn)獲取 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取哮喘靶點(diǎn)7 533個(gè)，由于靶點(diǎn)過多，將“Relevance score”由大到小排列，經(jīng)過2次選取大于中位數(shù)的靶點(diǎn)后，得到1 957個(gè)靶點(diǎn)。通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲取哮喘靶點(diǎn)2096個(gè)，將“Score”由大到小排列，經(jīng)過2次選取大于中位數(shù)的靶點(diǎn)后，得到663個(gè)靶點(diǎn)。補(bǔ)充TTD數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)177個(gè)、DrugBank數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)103個(gè)。將4個(gè)數(shù)據(jù)庫獲得的靶點(diǎn)合并，刪除重復(fù)值后，共獲得哮喘靶點(diǎn)2 393個(gè)。

2.3 共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)獲取 通過Venny將苓甘五味姜辛湯靶點(diǎn)與哮喘靶點(diǎn)取交集，獲得共同靶點(diǎn)136個(gè)，見圖2。將136個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖3(已隱藏13個(gè)游離節(jié)點(diǎn))。將得到的node1、node2、combined score導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析。通過Network analyzer功能對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，?jié)點(diǎn)的大小、顏色、透明度根據(jù)degree值變化，degree越大，則節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深、越不透明，見圖4。Degree值最小的前10位靶點(diǎn)依次為STAT3、JUN、TNF、AKT1、TP53、HSP90AA1、IL6、MAPK1、MAPK3、EGFR。利用內(nèi)置的cytoHubba插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行MCC算法分析，見圖5。MCC算法得到的前10位靶點(diǎn)為STAT3、TNF、IL1B、IL6、CXCL8、CCL2、IL4、JUN、IL10、MAPK3。將degree前10位靶點(diǎn)與MCC算法前10位靶點(diǎn)取交集，得到苓甘五味姜辛湯治療哮喘的核心靶點(diǎn)為STAT3、JUN、TNF、IL6、MAPK3。

圖2 苓甘五味姜辛湯-哮喘靶點(diǎn)韋恩圖

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鰸u變圖

圖5 MCC算法前10位

2.4 GO富集及KEGG通路分析 將136個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集及KEGG通路分析，共得到61個(gè)細(xì)胞組分(CC)、119個(gè)分子功能(MF)、606個(gè)生物過程(BP)以及126個(gè)KEGG通路。將數(shù)據(jù)導(dǎo)出后按P值進(jìn)行排序，每項(xiàng)均選取P值最小的20個(gè)通過Bioinformatics繪制高級氣泡圖。氣泡越紅表明P值越小，氣泡越大說明富集的基因數(shù)量越多。

GO-CC前20個(gè)富集結(jié)果為：細(xì)胞外隙、小凹、細(xì)胞質(zhì)膜、胞外區(qū)、膜筏、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞表面、質(zhì)膜組成部分、細(xì)胞外泌體、突觸后膜、質(zhì)膜外側(cè)、線粒體、細(xì)胞器膜、投射神經(jīng)元、細(xì)胞外基質(zhì)、頂端質(zhì)膜、受體復(fù)合物、突觸、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。見圖6。

圖6 GO-CC氣泡圖

GO-MF前20個(gè)富集結(jié)果為：酶結(jié)合、蛋白同源二聚化活性、相同蛋白結(jié)合、藥物結(jié)合、血紅素結(jié)合、細(xì)胞因子活性、蛋白異源二聚化活性、G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、受體信號蛋白酪氨酸激酶活性、類固醇結(jié)合、蛋白磷酸酶2A結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、氧化還原酶活性、輔酶Ⅱ結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白磷酸酶結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、NO合成酶活性調(diào)節(jié)和芳香化酶活性。見圖7。

圖7 GO-MF氣泡圖

GO-BP前20個(gè)富集結(jié)果：對藥物的反應(yīng)、對乙醇的反應(yīng)、衰老、對缺氧的反應(yīng)、對雌二醇的反應(yīng)、正向調(diào)節(jié)NO生物合成過程、負(fù)向調(diào)節(jié)凋亡過程、對脂多糖的反應(yīng)、正向調(diào)節(jié)基因表達(dá)、正向調(diào)節(jié)RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞對有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)、脂多糖介導(dǎo)的信號通路、血管生成、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、正向調(diào)節(jié)血管生成、正向調(diào)節(jié)ERK1和ERK2級聯(lián)、正向調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、正向調(diào)節(jié)DNA模板轉(zhuǎn)錄、炎癥反應(yīng)和正向調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖。見圖8。

圖8 GO-BP氣泡圖

KEGG前20個(gè)富集結(jié)果：乙型肝炎、癌癥信號通路、TNF信號通路、南美(美洲)錐蟲病、HIF-1信號通路、弓形體病、癌癥中的蛋白聚糖、膀胱癌、Toll樣受體信號通路、胰腺癌、利什曼病、結(jié)直腸癌、NOD樣受體信號通路、FoxO信號通路、甲型流感、PI3K-Akt信號通路、前列腺癌、百日咳、瘧疾和鈣信號通路。見圖9。TNF信號通路見圖10。

圖9 KEGG氣泡圖

圖10 TNF信號通路

2.5 “苓甘五味姜辛湯成分-哮喘靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建“苓甘五味姜辛湯成分-哮喘靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，見圖11。通過Network analyzer功能進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)degree值篩選出苓甘五味姜辛湯治療哮喘的核心成分，前5位依次為檞皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、7-甲氧基-2-甲基異黃酮(7-Methoxy-2-methyl isoflavone)、美迪紫檀素(Medicarpin)。

圖11 “苓甘五味姜辛湯成分-哮喘靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對接結(jié)果 將核心成分檞皮素、山柰酚、β-谷甾醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、美迪紫檀素分別與核心靶點(diǎn)STAT3、JUN、TNF、IL6、MAPK3進(jìn)行分子對接。配體與受體的結(jié)合自由能越低，構(gòu)象越穩(wěn)定，表明兩者的親和力越強(qiáng)[11]。一般情況，結(jié)合自由能小于0則表明配體與受體可自發(fā)結(jié)合[12]。本研究分子對接得到的結(jié)合自由能均為負(fù)值，說明親和力較好，結(jié)果見表2。其中β-谷甾醇與TNF的結(jié)合自由能最低(-13.5 kcal/mol)，應(yīng)用PyMOL對其分子對接結(jié)果進(jìn)行可視化，見圖12。

圖12 β-谷甾醇與TNF對接模式

表2 分子對接結(jié)果

3 討論

3.1 苓甘五味姜辛湯組方分析 哮喘屬中醫(yī)“哮病”、“喘證”等范疇。中醫(yī)學(xué)強(qiáng)調(diào)“痰”在哮病中的作用，認(rèn)為本病發(fā)生與肺脾腎虛、宿痰內(nèi)伏有關(guān)，因外感、飲食、情志、勞倦等誘因而引觸[13]?！安√碉嬚撸?dāng)以溫藥和之”，故溫肺化飲為哮喘的常用治法，經(jīng)方可選用苓甘五味姜辛湯。方中干姜為君，入肺、脾經(jīng)，既溫肺化飲，又溫脾化濕。細(xì)辛為方中臣藥，溫肺散寒化飲，助干姜溫散凝聚之寒飲。茯苓健脾滲濕，既可化已聚之痰，又能杜生痰之源，亦為臣藥。咳喘日久，必耗散肺氣，方中諸藥又是以辛散溫燥之藥為主，恐更傷肺氣，故佐以五味子斂肺止咳，與干姜、細(xì)辛為伍，一散一收，開闔相濟(jì)，散不傷正，收不留邪，既防辛散耗傷肺氣，又使肺臟宣降有權(quán)。使以甘草和中，調(diào)和藥性。全方配伍，共奏溫肺化飲之功[14]。臨床研究表明，苓甘五味姜辛湯治療哮喘效果顯著，可以更好地控制哮喘發(fā)作，改善肺功能，使臨床癥狀好轉(zhuǎn)[15]。

3.2 苓甘五味姜辛湯治療哮喘核心成分分析 本研究通過中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法,初步篩選出苓甘五味姜辛湯治療哮喘的核心成分為檞皮素、山柰酚、β-谷甾醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、美迪紫檀素等。槲皮素是一種黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、止咳、平喘、抗過敏等作用，可預(yù)防過敏原及血小板活化因子誘導(dǎo)的支氣管阻塞以及支氣管高反應(yīng)性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,槲皮素保護(hù)支氣管哮喘小鼠的作用與下調(diào)白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-5等有關(guān)，對氣道炎癥具有抑制作用，可緩解哮喘反應(yīng)[16]。山柰酚可抑制肥大細(xì)胞脫顆粒，還可以通過阻止Akt激活來降低Th2細(xì)胞因子和TNF-α水平，對細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶也有抑制作用，起到抑制氣道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增生肥大的作用，有利于減輕氣道狹窄[17]。β-谷甾醇具有抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用，可抑制巨噬細(xì)胞IL-6活性，減少腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性因子分泌[18]。研究表明,β-谷固醇具有抗哮喘作用，可顯著增加潮氣量并減少呼吸頻率，降低嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞水平，抑制Th2細(xì)胞因子的合成和釋放[19]。美迪紫檀素等黃酮類化合物可以通過抑制Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)起到抗哮喘的作用[20]。關(guān)于7-甲氧基-2-甲基異黃酮對于哮喘的作用目前暫無研究，可能是新的發(fā)現(xiàn)，尚有待實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 苓甘五味姜辛湯治療哮喘核心靶點(diǎn)分析 本研究根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)得到核心靶點(diǎn)STAT3、JUN、TNF、IL6、MAPK3。STAT3是一種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子，哮喘患者支氣管黏膜組織信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3水平顯著升高。干擾STAT3基因可減輕哮喘氣道損傷，其作用機(jī)制與抑制JAK/STAT信號通路激活、炎癥細(xì)胞因子的分泌、細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[21]。研究表明，STAT3能有效誘導(dǎo)IL-6的免疫反應(yīng)，可調(diào)節(jié)哮喘氣道炎癥，而STAT3 mRNA的表達(dá)與肺功能指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)[22]。轉(zhuǎn)錄激活因子AP-1是由JUN參與編碼的轉(zhuǎn)錄因子，AP-1家族成員在激活免疫系統(tǒng)及控制細(xì)胞反應(yīng)中起重要作用，可調(diào)節(jié)IL-4的表達(dá)，此外AP-1過度活化是哮喘糖皮質(zhì)激素抵抗的機(jī)制[23]。TNF-α在哮喘患者體內(nèi)存在高表達(dá)現(xiàn)象，TNF-α是單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的多肽，和機(jī)體炎癥、免疫反應(yīng)密切相關(guān)，可激活T淋巴細(xì)胞分泌NO等介質(zhì)，參與氣道炎性反應(yīng)和肺上皮細(xì)胞損傷過程，從而導(dǎo)致哮喘發(fā)生[24]。IL-6在哮喘發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，能活化B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，在哮喘急性期調(diào)節(jié)前列腺素等炎性遞質(zhì)的合成與分泌，還能誘導(dǎo)血清中抗體水平的升高[25]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)參與核因子κB(NF-κB)跨膜轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)，而NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和哮喘氣道重塑關(guān)系密切[26]，此外，芯片實(shí)驗(yàn)與熒光定量驗(yàn)證結(jié)果表明，MAPK3與哮喘炎癥發(fā)展密切相關(guān)[27]。

3.4 苓甘五味姜辛湯治療哮喘信號通路分析 富集分析得到的TNF信號通路、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、PI3K-Akt信號通路、鈣信號通路等均與哮喘關(guān)系密切，主要與氣道炎癥、免疫、氣道平滑肌相關(guān)。JUN、TNF、IL6、MAPK3等核心靶點(diǎn)均位于TNF信號通路上，TNF在減輕、維持和增強(qiáng)炎癥反應(yīng)過程中起到調(diào)節(jié)作用，在哮喘發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[28]。哮喘急性發(fā)作時(shí)，TNF-α通路激活，引起細(xì)胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-8和Caspase-3水平升高，使細(xì)胞凋亡發(fā)生，最終誘發(fā)哮喘[29]。特異性阻斷TNF-α的藥物可延緩疾病進(jìn)程，控制并緩解炎癥[30]。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)是適應(yīng)缺氧的關(guān)鍵介質(zhì)，可增強(qiáng)各種靶基因的轉(zhuǎn)錄，通過調(diào)節(jié)代謝來降低氧依賴性途徑[31]。研究表明，HIF-1α可與下游靶蛋白血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)協(xié)同作用，促使嗜酸粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，并參與氣道重塑，在哮喘的發(fā)生中具有重要作用[32]。Toll樣受體對于哮喘具有雙重作用，能加劇或改善氣道炎癥反應(yīng)，Toll樣受體信號可以通過干擾B細(xì)胞的免疫球蛋白同種型轉(zhuǎn)換或通過干擾參與過敏性炎癥的細(xì)胞，從而影響早發(fā)型哮喘反應(yīng)和晚發(fā)型哮喘反應(yīng)[33]。體內(nèi)及體外試驗(yàn)表明，NOD1和NOD2介導(dǎo)的免疫機(jī)制是通過調(diào)節(jié)人體嗜酸性粒細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞的相互作用，調(diào)節(jié)表面黏附分子及細(xì)胞內(nèi)IL-4Ra表達(dá)，刺激過敏性哮喘趨化因子和細(xì)胞因子釋放[34]。PI3K-Akt信號通路在支氣管哮喘中起著重要作用，特異性PI3K抑制劑可以顯著下調(diào)小鼠肺組織Akt的磷酸化，抑制Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、黏液產(chǎn)生以及氣道高反應(yīng)性?？赡嫘詺獾雷枞窍闹匾卣鳎渲饕獧C(jī)制是氣道平滑肌的功能異常，而鈣信號是調(diào)節(jié)氣道平滑肌細(xì)胞功能的重要機(jī)制，鈣通道在哮喘氣道高反應(yīng)性和氣道重塑中具有重要作用[35]。

4 小結(jié)

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，初步發(fā)現(xiàn)苓甘五味姜辛湯中的檞皮素、山柰酚、β-谷甾醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、美迪紫檀素等成分，可能通過TNF信號通路、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、PI3K-Akt信號通路、鈣信號通路等多種途徑，作用于STAT3、JUN、TNF、IL6、MAPK3等哮喘靶點(diǎn)，從而發(fā)揮緩解氣道炎癥、調(diào)節(jié)免疫和氣道平滑肌等作用。本研究通過AutoDock分子對接對研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，對接結(jié)果的結(jié)合自由能均為負(fù)，靶蛋白與配體分子的親和力較強(qiáng)。綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，初步探討了苓甘五味姜辛湯治療哮喘的潛在作用機(jī)制，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供了理論基礎(chǔ)和依據(jù)。