張 展，馮 雁，李 謙，崔 莉**

（1上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物代謝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200240；2中國藥科大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南京210009）

大多數(shù)構(gòu)型的吡喃糖分子及其衍生物在自然界中較為稀有［1］且具有廣泛的生物活性譜，如D-阿洛酮糖可用作低卡路里甜味劑，同時(shí)具有血糖抑制、活性氧清除和神經(jīng)保護(hù)等活性［2］，D-塔格糖具有低熱量、降血糖、抗齲齒和抗肥胖等特性［3-4］，L-塔格糖可用作治療半乳糖貯積癥的分子伴侶藥物米格斯他的起始原料［5］。然而，化學(xué)合成稀有功能糖必須克服糖分子多手性中心的障礙，生物酶合成法為解決這個(gè)難題提供了方案，為更加便利高效精準(zhǔn)地生產(chǎn)各種構(gòu)型的稀有功能糖，日本香川大學(xué)教授Izumori 等［6］提出了可用來生產(chǎn)所有稀有糖的生物制備策略，即以廉價(jià)的單糖為原料，利用醛糖異構(gòu)酶、D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶等糖異構(gòu)酶生產(chǎn)稀有功能糖，其中幫助糖分子實(shí)現(xiàn)羥基構(gòu)型變化而生成稀有功能糖的是糖差向異構(gòu)酶（EC 5.1.3.-），根據(jù)作用于糖分子手性中心位置的不同，其可以分為C-1 差向異構(gòu)酶，如醛糖1-異構(gòu)酶、C-2 差向異構(gòu)酶（如N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向異構(gòu)酶）和C-3 差向異構(gòu)酶（如D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶等）。

UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶（EC 5.1.3.2）是作用于UDP-葡萄糖或UDP-半乳糖的C-4 差向異構(gòu)酶，能夠特異性改變4-羥基構(gòu)型以實(shí)現(xiàn)兩種底物相互轉(zhuǎn)化。不同來源的UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶對底物的雜泛性不同，據(jù)此可被分為3 類：第1 類是對UDP-葡萄糖/UDP-半乳糖具有偏好性，第3 類是對UDP-N-乙酰葡萄糖胺/UDP-N-乙酰半乳糖胺均具有偏好性，如來自大腸埃希菌O5：K4：H4 的UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶顯示出對乙?；孜锔叩幕钚裕?］，而第2 類是對兩種底物均不具有偏好性［8］。UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶具有諸多研究價(jià)值，例如，該酶參與的遺傳疾病會導(dǎo)致嚴(yán)重的半乳糖血癥［9-10］，該酶可參與致病細(xì)菌的主要致病因子脂多糖O-抗原的生物合成，可參與鏈霉菌具有抗菌活性的次級代謝產(chǎn)物莫諾霉素的生成［11］，可參與有價(jià)值的半乳糖基化產(chǎn)物的生物催化［12］。此外，該酶還可被用來催化生成稀有功能糖，Kim等［13］利用來自大腸埃希菌的UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶催化生成塔格糖，且通過對UDP 基團(tuán)附近的氨基酸進(jìn)行飽和突變篩選，獲得了對塔格糖催化能力提高的突變體，為稀有功能糖的合成開辟了新的方法和思路。然而這種催化能力還需進(jìn)一步提高，為了達(dá)到這個(gè)目的，除了對這個(gè)酶本身進(jìn)行改造，也可以通過選擇與其具有一定相似性的不同來源的異構(gòu)酶作為候選改造模板。

本研究對與大腸埃希菌UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶進(jìn)化關(guān)系較近的鮑曼不動桿菌AB0057 來源的同工酶Gne1 的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征，通過序列比對、同源建模與分子對接等方法揭示了其與底物、輔因子的結(jié)合模式和催化機(jī)制，為蛋白質(zhì)工程改造提高酶活力進(jìn)而應(yīng)用于稀有功能糖的生物合成提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 菌株與質(zhì)粒

UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶Gne1（GenBank：ACJ39545.1）來源于鮑曼不動桿菌AB0057；異源表達(dá)宿主大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶基因與表達(dá)載體pET-28a（上海生工生物工程股份有限公司）；T7 通用引物（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司）。

1.2 主要試劑

PrimeSTAR Max Premix DNA 高保真聚合酶（日本寶日醫(yī)公司）；限制性核酸內(nèi)切酶（美國賽默飛世爾公司）；質(zhì)粒DNA 小量制備試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒（美國康寧公司）；PAGE 蛋白電泳凝膠制備試劑盒（西安晶彩生物科技有限公司）；Bradford 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）；蛋白質(zhì)親和色譜介質(zhì)Ni NTA Bead 6FF（常州天地人和生物科技有限公司）；超濾管Amicon Ultra-15（美國默克公司）；尿苷-5'-二磷酸葡萄糖二鈉鹽（uridine 5'-diphosphoglucose disodium salt，UDPG，上海源葉生物科技有限公司）；尿苷-5'-二磷酸半乳糖二鈉鹽（上海麥克林生化科技有限公司）；其余試劑為市售分析純。

1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，固體培養(yǎng)基須再加入2%的瓊脂糖。

1.4 儀 器

Mastercycler PCR 儀（德國Eppendorf 公司）；Mupid-2plus 核酸電泳儀（日本Mupid 公司）；Mini-PROTEAN Tetra 蛋白電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；UH-06 高壓勻質(zhì)儀（永聯(lián)生物公司）；1260 高效液相色譜儀（美國Agilent公司）。

2 方 法

2.1 目的基因的合成及驗(yàn)證

UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶與表達(dá)載體連接的酶切位點(diǎn)選擇NdeI 和EcoR I，并根據(jù)大腸埃希菌常用密碼子對目的基因進(jìn)行優(yōu)化，委托公司進(jìn)行合成。合成的質(zhì)粒與大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞混勻后42 ℃熱激90 s 轉(zhuǎn)化，加入LB 培養(yǎng)基800 μL 于37 ℃，220 r/min恒溫?fù)u床復(fù)蘇1 h。復(fù)蘇后經(jīng)4000 r/min 離心去上清液600 μL，剩余培養(yǎng)基重懸菌體后均勻涂布到含有25 μg/mL 卡那霉素的LB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)12 h 后挑取單克隆轉(zhuǎn)接到含有25 μg/mL 卡那霉素LB 液體培養(yǎng)基5 mL 中，同時(shí)使用T7 通用引物對單克隆進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證并送金唯智公司測序。轉(zhuǎn)接后的5 mL LB液體培養(yǎng)基37 ℃，220 r/min培養(yǎng)12 h后提取質(zhì)粒，限制性核酸內(nèi)切酶與質(zhì)粒反應(yīng)1 h 后使用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。PCR 體系和程序以及酶切體系見表1 ～表2。

Table 1 PCR contents of gne1

Table 2 Amplification conditions of Gne1

Table 3 Enzymatic digest of recombinant plasmid

2.2 Gne1重組酶的表達(dá)純化

挑取測序正確的單克隆接種于含25 μg/mL 卡那霉素的LB培養(yǎng)基5 mL中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過夜，將菌液（0.5%接種量）5 mL轉(zhuǎn)接于含25 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基1000 mL中，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)至A600為0.6 ～0.8（2 ～3 h），加入IPTG 至濃度為1 mmol/L，20 ℃，誘導(dǎo)20 h。誘導(dǎo)結(jié)束后，菌液經(jīng)5000 r/min 離心20 min 收集菌體，加入Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH 8.0，250 mmol/L NaCl）80 mL 重懸，使用高壓細(xì)胞勻質(zhì)儀破碎菌體。破碎完成后，4 ℃、10000 r/min、30 min離心2次，收集上清液過Ni 柱2 次。使用洗滌液1（30 mmol/L 咪唑、50 mmol/L Tris-HCl、250 mmol/L NaCl）和洗滌液2（50 mmol/L 咪唑、50 mmol/L Tris-HCl、250 mmol/L NaCl）各150 mL（30 倍Ni 柱體積）以洗脫雜蛋白，使用25 mL（5 倍Ni 柱體積）洗脫液（200 mmol/L 咪唑、50 mmol/L Tris-HCl、250 mmol/L NaCl）洗脫目的蛋白并收集在離心管中。純化出的酶經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳驗(yàn)證，并轉(zhuǎn)移至截流量為10 kD的超濾管中，5000 r/min 離心20 min，棄濾液，向超濾管中加入Tris-HCl 緩沖液（50 mmol/L，pH 8.0）至最高限，5000 r/min，20 min，重復(fù)此步驟5 次，將濃縮液轉(zhuǎn)移至2 mL 離心管中，加入少量甘油。使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。

2.3 Gne1重組酶的活性表征

2.3.1 酶活力檢 測 Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.0）緩沖液的100 μL 反應(yīng)體系中包含5 mg/mL 純化后的蛋白，2 mmol/L 天然底物UDP-葡萄糖，37 ℃反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴3 min 使酶變性，12000 r/min 離心30 min，吸取上清液并使用0.22 μm濾膜過濾，濾液使用高效液相色譜儀分析，色譜柱為Agilent SB-C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）分析柱，流速為0.8 mL/min，乙酸三乙胺緩沖液（40 mmol/L，pH 6.0）等度洗脫，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量5 μL，紫外檢測器設(shè)置波長為262 nm，分析時(shí)間為15 min。

2.3.2 酶活力單位定義 44 ℃，pH 6.0 條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol底物所需要的酶量，即1個(gè)酶活力單位，以U 表示。反應(yīng)體系中的UDP-葡萄糖濃度按照下式計(jì)算：y= 2131.558x，R2= 0.99997，y為紫外信號峰面積（mAU×min），x為反應(yīng)體系中的UDP-葡萄糖的濃度（mmol/L）。酶活力（mU/mg）計(jì)算公式為：酶活力=× 106，其中，x0為反應(yīng)前體系中UDP-葡萄糖濃度（mmol/L）；t為反應(yīng)時(shí)間（min），60 min；m為反應(yīng)體系中酶的質(zhì)量（mg），0.5 mg；V為反應(yīng)體積（L），1 × 10-4L。

2.3.3 最適溫度探究 在pH 8.0的條件下，反應(yīng)體系中UDP-葡萄糖的濃度為1 mmol/L，溫度梯度選擇16 ℃、23 ℃、30 ℃、37 ℃、44 ℃、51 ℃。

2.3.4 最適pH 探究 在溫度為44 ℃條件下，反應(yīng)體系中UDP-葡萄糖的濃度為1 mmol/L，pH 梯度選擇5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，其中pH 梯度5.0、6.0、7.0 使用50 mmol/L 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制，pH 梯度7.0、8.0、9.0 使用50 mmol/L Tris-HCl 緩 沖 液 配 制，pH 梯 度9.0 和10.0 使 用50 mmol/L Gly-NaOH緩沖液配制。

2.3.5 動力學(xué)測定 在溫度為44 ℃，pH 6.0條件下，UDP-葡萄糖的濃度梯度為0.05，0.10，0.15，0.20，0.4，0.7，1.0，2.0，3.0，5.0 mmol/L。 使用Origin 軟件對不同底物濃度對應(yīng)的酶促反應(yīng)速率進(jìn)行Michaelis-Menten方程擬合即得到動力學(xué)參數(shù)KM和kcat。

2.4 Gne1的進(jìn)化、序列和結(jié)構(gòu)分析

使用MEGA 7.0 軟件對KEGG 數(shù)據(jù)庫中選擇E.C.number 為5.1.3.2、5.1.3.6 和5.1.3.7 共24條蛋白序列與GalE 序列進(jìn)行比對，比對參數(shù)選擇默認(rèn)值，進(jìn)化樹構(gòu)建方法選擇鄰接法，自展值設(shè)置為1000，進(jìn)化距離由p-distance 計(jì)算。在NCBI 中使用Batch CD-search 分析該組序列的保守結(jié)構(gòu)域及預(yù)測配體的結(jié)合位點(diǎn)。將進(jìn)化關(guān)系較近的Gne1的蛋白序列在NCBI中進(jìn)行Blast分析，數(shù)據(jù)庫選擇“PDB protein database”，選擇相似度較高5 條蛋白序列與Gne1 在ClustalX2 中進(jìn)行比對，參數(shù)選擇默認(rèn)值，比對結(jié)果使用ESPript 3.0 軟件進(jìn)行著色，二級結(jié)構(gòu)模板使用來自大腸埃希菌的同工酶（PDB：1XEL，相似度55.2%）。

2.5 Gne1的同源建模與分子對接

使用Swiss Model 在線網(wǎng)站對Gne1 的蛋白質(zhì)序列同源建模，使用大腸埃希菌的同工酶（PDB：1XEL，相似度55.2%）作為模板，構(gòu)建好的模型上傳至SAVES v6.0 在線網(wǎng)站進(jìn)行評估。使用Pymol軟件對同源建模的Gne1與含有配體的模板分子進(jìn)行比對，得到含有配體分子的Gne1，使用Discovery Studio展示配體與Gne1的相互作用。

3 結(jié) 果

3.1 目的基因的合成及驗(yàn)證結(jié)果

T7 通用引物擴(kuò)增的片段長度的理論值為1336 bp，菌落PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證正確（圖1，序號1-4）。提取重組質(zhì)粒經(jīng)NdeI和EcoR I 雙酶切后，得到線性載體片段與目的基因片段（圖1，序號5）。菌落PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后送公司測序，測序結(jié)果顯示目的基因成功構(gòu)建到載體上。

Figure 1 Colony PCR results and enzymatic digest verificationM: DNA ladder; 1-4: Coloy PCR results; 5: Recombinant plasmid digested by restriction enzymes

3.2 重組酶Gne1的表達(dá)純化結(jié)果

重組酶在1 L 的LB 培養(yǎng)基中經(jīng)1 mmol/L IPTG 20 ℃誘導(dǎo)20 h 后，離心去除培養(yǎng)基后得到濕菌體的質(zhì)量為44.5 g。重組酶質(zhì)量約為38.9 kD，10%SDS-PAGE 電泳顯示（圖2），純化的目標(biāo)蛋白位于蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)35 kD 和45 kD 之間，與預(yù)測值相符。另外，從細(xì)胞破碎液的電泳結(jié)果中可看出（圖2，序號1），重組酶在細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)，分析上清液可知該酶獲得了可溶性表達(dá)，純化液中重組酶濃度較高，該酶成功純化，共獲得重組酶85.2mg，重組酶產(chǎn)率為1.91 mg/g。

Figure 2 SDS-PAGE analysis of the recombinant enzymeM: Protein marker; 1: Cell lysate; 2: Lysate supernatant; 3: Purified Gne1

3.3 重組酶Gne1性質(zhì)表征

對重組酶Gne1的天然活性進(jìn)行驗(yàn)證，以UDP-葡萄糖為底物，其標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間為13.0 min，與Gne1 反應(yīng)1 h 后，檢測到產(chǎn)物UDP-半乳糖生成，保留時(shí)間為11.5 min，與UDP-半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間一致（圖3），由此驗(yàn)證天然底物活性。

該酶的最適溫度進(jìn)行研究（圖4-A）。設(shè)置溫度梯度的區(qū)間為16 ～51 ℃，7 ℃一個(gè)間隔，其在44 ℃時(shí)，酶活力達(dá)到最大，但是在該溫度下，觀察發(fā)現(xiàn)酶變性也較快，相比而言，37 ℃酶活力雖未達(dá)到最大，但在37 ℃下與天然底物反應(yīng)1 至數(shù)小時(shí)，均未發(fā)現(xiàn)蛋白沉淀產(chǎn)生，故37 ℃下的反應(yīng)更為穩(wěn)定。在溫度為51 ℃時(shí)，活力急劇下降至10%。

Figure 3 HPLC assay of Gne1 activityA: UDP-glucose; B: UDP-galactose; C: UDP-glucose incubated with Gne1

酶的最適pH 探究發(fā)現(xiàn)（圖4-B），其活性在pH 6.0時(shí)活力達(dá)到最大，在pH 5.0時(shí)活力急劇下降到50%，在pH 7.0 及pH 8.0 時(shí)相對活力分別為75%及65%。

Figure 4 Optimal temperature, pH assay and kinetic parameters of Gne1 (±s,n = 3)A: Optimal temperature assay; B: Optimal pH assay; C: Kinetic parameters assay

根據(jù)得出的最適溫度44 ℃和最適pH 6.0 為反應(yīng)條件再次反應(yīng)，反應(yīng)體系中底物初始濃度為3.0 mmol/L，計(jì)算酶比活力為（1.558 ± 0.0697）mU/mg。

酶促反應(yīng)動力學(xué)研究表明（圖4-C），底物親和常數(shù)KM=（1.227 ± 0.0824）mmol/L，最大反應(yīng)速率vmax=（2.132 ± 0.0919）mU/mg，轉(zhuǎn)化數(shù)kcat=82.64 ± 3.562 × 10-3min，催化效率kcat/KM= 61.69 ±4.597 × 10-3min/（mmol·L-1）。

3.4 重組酶Gne1的進(jìn)化、序列和二級結(jié)構(gòu)

選擇來源于鮑曼不動桿菌AB0057 的UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶（Genbank：ACJ39545.1）進(jìn)行表征，一個(gè)重要的原因是其與研究較透徹的且顯示出塔格糖催化活性的來自于大腸埃希菌的同工酶（Genbank：NP_415280.3）進(jìn)化關(guān)系較近（圖5-B），它們的序列相似性達(dá)到55.22%。為了更好地為蛋白質(zhì)的改造做指導(dǎo)，除了對異構(gòu)酶進(jìn)行表征外，進(jìn)化分析、序列分析和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測是必不可少的。

進(jìn)化分析顯示（圖5-B），Gne1 屬于NADB_Rossmann 超家族。NADB 結(jié)構(gòu)域存在于許多代謝途徑如糖酵解的脫氫酶當(dāng)中，也存在于其他許多氧化還原酶中。由于異構(gòu)酶催化過程中同樣涉及到氧化還原，因此也需要NAD 的參與，故一些異構(gòu)酶具有與NAD 結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，Rossmann 折疊便是其中一種。該折疊的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為，第1 個(gè)β 折疊與其后的α 螺旋之間形成的轉(zhuǎn)角處的氨基酸與NAD形成氫鍵，特征序列為GXGXXG，異構(gòu)酶Gne1 的序列中同樣具有這種特征，如預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)中，β1 與α1 之間的序列GAGYIG。且序列比對結(jié)果（圖5-A）顯示相應(yīng)甘氨酸高度保守，這也許是很多異構(gòu)酶都具有的特征。 此外，Gne1 還分屬于UDP_G4E_1_SDR_e 亞家族，該亞家族作為短鏈脫氫酶家族的一員，序列中含有的特征基序?yàn)閅XXXK，從多序列比對結(jié)果看Y 與K 同樣是完全保守的，且被預(yù)測為關(guān)鍵催化殘基，Gne1中存在的該特征序列為YGYTK。

Figure 5 Bioinformatic analysis of Gne1 with its homologsA: Multiple sequence alignments; B: Phylogenetic tree analysis

預(yù)測催化活性位點(diǎn)除了Y150和K154外，還包括上游的N101 及S125。預(yù)測的NAD 結(jié)合位點(diǎn)為G8，A10，G11，Y12，I13，D32，N33，L34，S35，N36，S37，G58，D59，I60，F(xiàn)81，A82，G83，K85，N100，S123，S124，S125，Y150，K154，Y178，F(xiàn)179，P181。預(yù)測的底物結(jié)合位點(diǎn)為S125，A126，T127，Y150，Y178，F(xiàn)179，N180，N199，N200，L201，L216，S217，I218，Y219，G230，R232，Y234，V270，R293，D296。

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，Gne1 蛋白包含11 個(gè)α 螺旋和13 個(gè)β 折疊。與NAD 相互作用的二級結(jié)構(gòu)涉及7 個(gè)β 折疊與3 個(gè)α 螺旋，分布在Gne1 的N端。與底物相互作用的二級結(jié)構(gòu)涉及5 個(gè)β 折疊和4個(gè)α螺旋，分布在Gne1的C端。關(guān)鍵催化氨基酸靠近序列中間位置，位于與NAD 相互作用位點(diǎn)和與底物相互作用位點(diǎn)的交疊處。

3.5 重組酶Gne1的同源建模及分子對接

除了進(jìn)化分析、序列分析和二級結(jié)構(gòu)的研究，同源建模及分子對接可以揭示Gne1 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，從而更加明確蛋白與配體的相互作用，對異構(gòu)酶的改造作出更明確的指導(dǎo)。

以相似性較高的來自大腸埃希菌的異構(gòu)酶（序列相似性為55.22%）為模板（PDB ID：1XEL）在Swiss Model 網(wǎng)站對Gne1 進(jìn)行同源建模，對建模進(jìn)行評估顯示（圖6-B），271（90.4%）個(gè)氨基酸落在主要允許區(qū)，25（8.6%）個(gè)氨基酸落在額外允許區(qū)，3（1%）個(gè)氨基酸落在可用允許區(qū)，落在非允許區(qū)的氨基酸數(shù)目為0。GMQE 指標(biāo)通常在0 到1 之間，數(shù)值越高，表示建模的可靠性越高，結(jié)果顯示建模的GMQE值較高為0.84。QMEAN指標(biāo)在0附近表示模型結(jié)構(gòu)與相似大小的實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)之間具有良好的一致性，小于-4時(shí)則表明模型質(zhì)量較低，建模的QMEAN 值為-1.27，說明與相似大小實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)的一致性較好。另外Overall quality factor 的數(shù)值為95.4128，與高分辨率結(jié)構(gòu)通常產(chǎn)生的數(shù)值相當(dāng)。平均3D-1D score 不低于0.2 的殘基比例為90.48%，達(dá)到80% 的閾值。綜合以上各項(xiàng)評價(jià)指標(biāo)可以說明建模的質(zhì)量較高，可以用于后續(xù)的分析。

同源建模結(jié)果顯示（圖6-A），單體亞基包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是靠近N 端的NAD 結(jié)合區(qū)域，另一個(gè)是靠近C端的底物結(jié)合區(qū)域，在兩個(gè)區(qū)域的表面形成的裂隙成為催化的活性位點(diǎn)。

Figure 6 Homologous modelling structure and Ramachandran plotA: Protein structure of Gne1 homologous modelling; B: Ramachandran plot of Gne homologous modelling

酶與配體的相互作用結(jié)果顯示（圖7），與NADH具有氫鍵相互作用的氨基酸為Tyr12，Ile13，Asp32，Asn33，Ser35，Asn36，Ser37，Asp59，Ile60，Asn100，Tyr150，Lys154。其中，Ile13，與煙酰胺核苷酸的磷氧形成氫鍵，Asp32，與腺嘌呤核糖同時(shí)形成兩個(gè)氫鍵，Tyr150 和Lys154 分別與煙酰胺核糖形成氫鍵，這四個(gè)位點(diǎn)在序列比對中顯示出完全的保守性。另外，Lys85 與兩個(gè)磷酸基團(tuán)分別形成鹽橋，幫助錨定NAD，除了6KV9 和6ZL6 這兩種分別來自鏈霉菌和蠟狀芽孢桿菌的以UDP-葡萄糖醛酸為底物的C-4 差向異構(gòu)酶的序列外，在參與比對的UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶的序列中均完全保守。

與底物UDP-葡萄糖的結(jié)合具有重要作用的氨基酸包括Ser125，Asn180，Asn200，Leu201，Ser217，Try219，Asp296。Ser125與葡萄糖的4-羥基緊密接觸，距離僅為2.55 ?，除了來自蠟狀芽孢桿菌里的蛋白，該位點(diǎn)完全保守，推測其為催化關(guān)鍵位點(diǎn)。Asn180 分別與葡萄糖6-羥基和β-磷氧形成氫鍵，除了鏈霉菌和蠟狀芽孢桿菌的蛋白，該位點(diǎn)完全保守。Arg232 和Arg293，分別β-磷氧與和α-磷氧形成氫鍵及鹽橋，前者完全保守，后者除蠟狀芽孢桿菌的蛋白外完全保守。Asp296與腺嘌呤核糖的2-羥基形成氫鍵，除蠟狀芽孢桿菌的蛋白，該位點(diǎn)嚴(yán)格保守。

Figure 7 Interaction with ligands in Gne1A: Interaction with NAD; B: Interaction with substrate

4 討論

本研究對來源于鮑曼不動桿菌的UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶進(jìn)行了表征并對與配體結(jié)合及催化的相關(guān)氨基酸進(jìn)行了探究。Gne1 在大腸埃希菌BL21（DE3）中獲得可溶性表達(dá)，并顯示出對于天然底物UDP-葡萄糖的催化活力，其最適溫度和pH分別為44 ℃和pH 6.0，底物濃度為3.0 mmol/L 時(shí)測得其酶比活力為（1.558 ± 0.0697）mU/mg，米氏常數(shù)KM與催化常數(shù)kcat分別為（1.227 ± 0.0824）mmol/L 和（82.64 ± 3.562）× 10-3min，Gne1 雖與來自大腸埃希菌的同工酶具有55.2% 的相似性，然而動力學(xué)特征存在差別，后者的動力學(xué)參數(shù)KM與kcat分別為225 μmol/L 與760 s-1［14-16］。這種親和力與轉(zhuǎn)換數(shù)的較大差距表明Gne1可能更適用于改造提升塔格糖催化活性。因?yàn)閁DP-葡萄糖與塔格糖在結(jié)構(gòu)上存在差別——UDP 基團(tuán)，在改造提升對塔格糖的催化活性時(shí)，也許需要適當(dāng)縮小底物口袋或者減小與UDP 的相互作用等，客觀上也會造成酶與UDP-葡萄糖親和力降低的結(jié)果。此外，改造還需進(jìn)一步考量酶與配體NAD 及UDP-葡萄糖的相互作用以及關(guān)鍵催化氨基酸。

異構(gòu)酶通常與NAD具有非常高的親和力，純化出的酶一般都含有完整的NAD，其可在濃鹽酸胍中變性而后從酶中分離出來［17］。NAD 在實(shí)現(xiàn)異構(gòu)酶催化活性的過程中非常關(guān)鍵，底物吡喃糖4-羥基氫被催化堿提取并被轉(zhuǎn)移至NAD 形成NADH。Gne1序列分析結(jié)果也顯示，其屬于NADB_Rossmann 超家族，該家族的特點(diǎn)是具有能夠與NAD（P）/NAD（P）H 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，Gne1 也存在這種結(jié)構(gòu)域的特征GXGXXG，序列為GAGYIG，此外，底物對接后相互作用分析顯示，與NAD 形成氫鍵相互作用的氨基酸多達(dá)12 個(gè)，鹽橋2 個(gè)，其中還有高度保守的氨基酸Tyr150 和Lys154，這兩個(gè)氨基酸也屬于NADB_Rossmann 超家族中的亞家族——短鏈脫氫酶家族的特征氨基酸，序列形式一般為YXXXK。Lys154 的ε-氨基通過與煙酰胺核糖核環(huán)的4-羥基進(jìn)行氫鍵作用，Lys154 在被突變?yōu)镸et 后，酶與NAD 的結(jié)合明顯減弱，因而該位點(diǎn)對NAD 的結(jié)合做出重要貢獻(xiàn)［18］，另外Asp32與腺嘌呤核糖2-羥基和3-羥基同時(shí)形成2個(gè)氫鍵，且在序列比對中顯示完全保守，推測其對于NAD 的結(jié)合也是十分重要的。如此多的相互作用和關(guān)鍵位點(diǎn)的高度保守性也解釋了NAD 與Gne1 具有高度親和力以至于無需在反應(yīng)體系中額外添加輔酶的原因。

Gne1 除了其N 端與NAD 結(jié)合的結(jié)構(gòu)域外，還有一個(gè)用于與底物UDP-葡萄糖結(jié)合的較小的C 端結(jié)構(gòu)域。與NAD 相比，該結(jié)構(gòu)域中與底物相互作用形成氫鍵的氨基酸僅有7 個(gè)，形成鹽橋的有2個(gè)，其他相互作用均比NAD少。其中，與UDP形成氫鍵相互作用的氨基酸有6個(gè)，而與吡喃糖相互作用的氨基酸僅有2個(gè)，與UDP結(jié)合作用強(qiáng)而與吡喃糖結(jié)合作用較弱，這反映了在催化過程中，UDP 基團(tuán)對吡喃糖起到重要的定位作用，因此其對吡喃糖4-羥基構(gòu)型的催化特異性可能是由于UDP 基團(tuán)的正確定位產(chǎn)生的，同時(shí)作用力的減弱也增加了底物的活動性。對大腸埃希菌來源的同工酶晶體結(jié)構(gòu)研究表明，UDP-葡萄糖，UDP-甘露糖，UDP-4-脫氧-4-氟-葡萄糖和UDP-4-脫氧-4-氟-半乳糖在吡喃糖基結(jié)合位點(diǎn)中，吡喃糖的取向是不同的［19］。另外在與UDP-半乳糖的晶體結(jié)構(gòu)研究中顯示，與UDP-葡萄糖相比，吡喃糖的構(gòu)象發(fā)生了較大的翻轉(zhuǎn)，這些研究均充分證實(shí)了在活性位點(diǎn)，羥基氫被催化堿提取接著被轉(zhuǎn)移至NAD 形成NADH 后，形成的4-酮基吡喃糖中間體發(fā)生了翻轉(zhuǎn)，使氫從NADH 返回到吡喃糖的另一面，實(shí)現(xiàn)吡喃糖4-羥基構(gòu)型的變化［20］。在Gne1 中，催化構(gòu)型變化的關(guān)鍵氨基酸極有可能為Ser125，在序列比對中，其與結(jié)構(gòu)功能已知的大腸埃希菌的同工酶活性位點(diǎn)Ser124 相對應(yīng)，且該位點(diǎn)高度保守。并且Gne1 與配體的相互作用顯示，Ser125與葡萄糖的4-羥基形成氫鍵，距離僅為2.55 ?。

然而，除了Ser125，Tyr150 可能也參與到了催化作用中，在一些研究中表明，Tyr 提供了一般酸堿催化的驅(qū)動力，與Ser 在介導(dǎo)質(zhì)子轉(zhuǎn)移中起著重要作用。 這兩個(gè)位點(diǎn)的雙重突變Tyr149Phe/Ser124Ala-GalE 的最大活性僅為野生型的千分之一，單點(diǎn)突變后的活性為野生型的千分之一以下［16］，并且這種突變并未影響到空間結(jié)構(gòu)，因此突變后造成的影響是動力學(xué)性質(zhì)的。Gne1與配體的相互作用顯示Tyr150 與煙酰胺核糖2-羥基存在氫鍵，而與吡喃糖僅存在范德華力，雖然在實(shí)際催化過程中其距離吡喃糖4-羥基的距離可能會更近［21］，但具體的作用有待通過Gne1 與底物的晶體結(jié)構(gòu)研究進(jìn)一步闡明。