張紫玲，陸 茜，徐登球，俞沁瑋*，江振洲，2，3**

（1中國(guó)藥科大學(xué)新藥篩選中心，南京210009；2中國(guó)藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009；3中國(guó)藥科大學(xué)藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009）

骨骼肌與肝臟之間存在著密切的器官應(yīng)答關(guān)系。骨骼肌功能障礙會(huì)影響體內(nèi)的脂質(zhì)平衡，患有骨骼肌疾?。ㄈ缍攀霞I(yíng)養(yǎng)不良癥和肌肉減少癥）的患者患上代謝相關(guān)性脂肪性肝?。╩etabolic associated fatty liver disease，MAFLD）的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)相應(yīng)增加［1-2］。研究表明，肌少癥是誘發(fā)MAFLD 的危險(xiǎn)因素之一，其病理生理機(jī)制包括胰島素抵抗、血脂異常和炎癥增加［3］，肌少癥還可能是糖尿病易感性的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)［4］。同時(shí)，快速的骨骼肌萎縮預(yù)示肝硬化患者的生存率降低［5］。運(yùn)動(dòng)干預(yù)治療MAFLD 的結(jié)果表明，通過(guò)有氧運(yùn)動(dòng)和耐力運(yùn)動(dòng)促進(jìn)肌再生能降低肝臟脂肪含量［6］，肝臟與脂肪組織、骨骼肌與微生物群之間的相互作用也可能是肌再生對(duì)MAFLD 的影響之一［7］。闡明骨骼肌與肝臟之間的關(guān)系，有利于從骨骼肌方向干預(yù)MAFLD的發(fā)病進(jìn)程，或提示骨骼肌損傷患者關(guān)注肝臟病變，提早進(jìn)行肝臟保護(hù)治療。

杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（Duchene muscular dystrophy，DMD），即假肥大型進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥，是一種X 連鎖隱性遺傳的嚴(yán)重進(jìn)行性肌肉萎縮性疾病，會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)困難，最終發(fā)展為需要輔助通氣和過(guò)早死亡［8］。其發(fā)病原因是染色體上編碼抗肌萎縮蛋白的部分基因重復(fù)、突變或缺失，造成抗肌萎縮蛋白在肌纖維上的缺失或功能異常［9］。臨床數(shù)據(jù)表明，DMD 嬰兒有肝功能生化異常的情況，在臨床兒科上出現(xiàn)了原因不明無(wú)黃疸的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）升高，甚至有曾被誤診為肝炎的案例［10］，并且小兒DMD 患者血脂異常的發(fā)生率很高［11］。然而，DMD 對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝的影響及其作用機(jī)制尚未闡明。C57BL/10ScSn-Dmdmdx/Jnju（mdx）小鼠是用于研究DMD 疾病的模型動(dòng)物，該動(dòng)物編碼抗肌萎縮蛋白的基因4號(hào)外顯子出現(xiàn)無(wú)義突變，導(dǎo)致抗肌萎縮蛋白無(wú)法表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)以mdx 小鼠為DMD 模型，探究其肝臟脂質(zhì)代謝變化情況。

脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）在動(dòng)物肝臟脂質(zhì)生成、沉積的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［12］。乙酰輔酶A 羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）是催化脂肪酸合成代謝第一步反應(yīng)的限速酶［13-14］，其中ACC1在肝臟、脂肪和泌乳乳腺中表達(dá)量較高［15］。FASN 能利用ACC1 生成的丙二酰輔酶A在胞質(zhì)中合成脂肪酸。同時(shí)，除脂質(zhì)合成的相關(guān)酶以外，肝臟脂質(zhì)合成的過(guò)程還受多種飲食和激素因素的調(diào)節(jié)，這些因素控制著脂肪合成相關(guān)酶的表達(dá)。膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatory element binding proteins，SREBPs）是一類(lèi)固定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核被膜上的膜連接蛋白，其中SREBP-1c 作為負(fù)責(zé)胰島素增強(qiáng)脂質(zhì)生成的胰島素應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控脂質(zhì)合成中發(fā)揮著重要的作用［16］。然而，這些脂質(zhì)合成酶是否在DMD 誘發(fā)肝臟脂質(zhì)代謝異常的的過(guò)程中起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用，還有待進(jìn)一步探究。

本課題基于DMD患者臨床上所出現(xiàn)的血脂異?，F(xiàn)象，以及骨骼肌疾病和MAFLD 之間緊密的聯(lián)系，探究DMD 對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝的影響及其作用機(jī)制。研究結(jié)果可為臨床DMD患者檢測(cè)肝臟脂質(zhì)代謝情況提供理論依據(jù)，提示患者盡早進(jìn)行肝臟保護(hù)治療，也為治療MALFD提供一個(gè)新的研究思路。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

Dystrophin 抗體（美國(guó)DSHB 公司）；羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二級(jí)抗體（Alexa Fluor 488）、DAPI 染色液、羊抗兔IgG（H+L）二級(jí)抗體（HRP）（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；4% 多聚甲醛、抗熒光淬滅封片液、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所）；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；ALT、AST 檢測(cè)試劑盒（中國(guó)東軟威特曼生物科技有限公司）；總RNA 提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix、高敏型ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（南京諾維贊生物科技有限公司）；FASN 抗體（美國(guó)Proteintech 公司）；SREBP-1c抗體、ACC 抗體（美國(guó)Affinity 公司）；p-ACC 抗體（美國(guó)CST 公司）；β-actin（武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司）；油紅O 粉末（上海阿拉丁試劑有限公司）；蘇木精-伊紅染色液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；引物（上海英駿生物技術(shù)有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

激光共聚焦顯微鏡、BX53 顯微鏡（日本Olympus 公司）；多功能酶標(biāo)儀、高速低溫離心機(jī)、Nanodrop 2000/2000C（美國(guó)Thermo 公司）；AB StepOne-Plus Real-Time PCR Instrument（美國(guó)生命科技有限公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；低溫研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）；冷凍切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）；Tanon 4600 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.3 動(dòng) 物

雄性C57BL/10ScSn-Dmdmdx/JNju 鼠（以下簡(jiǎn)稱(chēng)mdx 小鼠）和雄性C57BL/6J 鼠（以下稱(chēng)為對(duì)照組）6周齡，SPF 級(jí)，購(gòu)于南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（蘇）2016-0003。動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)藥科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障系統(tǒng)，正常飲食飲水，晝夜交替。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組與處理

對(duì)照組與mdx 小鼠各6 只，于7 周齡時(shí)處死，解剖取其肝臟組織和肌肉組織，取適宜大小進(jìn)行冷凍包埋，另取一塊放入4% 多聚甲醛中浸泡固定，送往江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病理科制作石蠟包埋進(jìn)行組織切片，剩余組織用錫紙包裹后置于液氮中，2 h后取出立即保存于-80 ℃冰箱。

2.2 肌肉組織免疫熒光染色

將冷凍包埋后的骨骼肌組織于冷凍切片機(jī)制片，切片厚度為8 μm，制備好的載玻片樣品于室溫干燥5 min 后，浸入預(yù)冷丙酮（4 ℃）中固定15 min，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3 次，晾干液體后于組織樣本上覆蓋含有5% 驢血清的封閉液室溫封閉30 min。棄去液體，加上抗肌萎縮蛋白抗體，4 ℃避光孵育過(guò)夜。吸棄抗體，PBS 浸洗3 次，每次5 min，滴加熒光二抗，室溫避光孵育1 h。吸棄二抗，PBS 浸洗3 次，滴加DAPI染色液，室溫避光孵育10 min，吸棄DAPI 染色液，PBS 浸洗3 次，組織樣本上滴加適量抗熒光淬滅封片液，蓋片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2.3 肝臟組織生化檢測(cè)

稱(chēng)取肝組織20 mg，放入磁珠，加入生理鹽水200 μL 勻漿，于高速低溫離心機(jī)2500 r/min 離心10 min，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)上操作，于多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸收度，計(jì)算肝勻漿液中TC、TG 的含量。將上步勻漿液低溫11200 r/min 離心10 min，取上清液用BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白含量，用以計(jì)算TC、TG的終濃度。

2.4 組織形態(tài)學(xué)檢查

2.4.1 油紅染色（oil red O staining，OR O 染色）油紅粉末溶于異丙醇中制備成0.5% 油紅母液，母液與水以3∶2混合制備油紅稀釋液，濾紙過(guò)濾后進(jìn)行染色。油紅染完后使用蘇木素染色液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。最后滴加甘油明膠封片液，蓋上蓋玻片，于BX53顯微鏡下觀察并拍照。

2.4.2 蘇木精-伊紅染色（HE染色） 肝臟（肌肉）組織切片使用4% 多聚甲醛溶液固定1 min，而后干燥15 min，用HE 染色液對(duì)組織切片進(jìn)行染色，隨后用樹(shù)脂封片，待樹(shù)脂完全晾干后，于BX53 顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 血清生化檢測(cè)

小鼠眼球取血收集血清，室溫靜置4 h 后以3000 r/min 轉(zhuǎn)速離心15 min，吸取上清液，保存于4 ℃冰箱。按試劑盒操作步驟檢測(cè)血清內(nèi)TC、TG、TBA、FFA、HDL，以及ALT 和AST 的含量，于多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸收度，計(jì)算相應(yīng)含量。

2.6 Real-Time PCR（RT-PCR）

采用總RNA 提取試劑提取肝臟RNA。采用Nanodrop 2000/2000C 分光光度法測(cè)定RNA 濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，使用SYBR Green 試劑在應(yīng)用生物系統(tǒng)StepOnePlus?Real-Time PCR 上進(jìn)行RT-PCR，檢測(cè)脂質(zhì)合成與代謝相關(guān)基因含量。引物序列如表1所示。

2.7 蛋白免疫印跡法

稱(chēng)取肝臟組織50 mg，使用RIPA 裂解液提取蛋白原液，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。通過(guò)BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白樣品的濃度，再加入上樣緩沖液將其配制成質(zhì)量濃度為5 μg/μL 的蛋白樣品，95 ℃金屬浴煮10 min，制備上樣樣品。樣品通過(guò)蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)脂質(zhì)合成和代謝相關(guān)酶的蛋白含量。一抗為FASN 抗體、SREBP-1c 抗體、ACC 抗體、p-ACC 抗體、β-Actin，二抗為羊抗兔IgG 抗體。完成一抗與二抗的特異性結(jié)合后，使用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒在發(fā)光成像系統(tǒng)上檢測(cè)蛋白表達(dá)的信號(hào)強(qiáng)度。

Table 1 Sequences of real time PCR primers

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。所有數(shù)據(jù)采用±s表示，組間分析全部使用t檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 mdx小鼠肌肉損傷

對(duì)mdx 小鼠的脛骨前?。╰ibialis anterior，TA）進(jìn)行抗肌萎縮蛋白的免疫熒光染色（圖1-A）和HE染色（圖1-B），結(jié)果顯示mdx 小鼠TA 肌細(xì)胞內(nèi)抗肌萎縮蛋白缺失，肌細(xì)胞皺縮，有較多中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。

Figure 1 Loss of dystrophin in tibialis anterior （TA）and muscle damage in mdx miceA: TA muscle was stained with dystrophin (green) and DAPI was used to stain the nuclei (blue) (Scale bar = 50 μm); B: HE staining of TA(Scale bar = 50 μm)DMD: Duchene muscular dystrophy

3.2 mdx小鼠肝臟脂質(zhì)含量增加

與對(duì)照組相比，mdx 小鼠的肝重系數(shù)上升（圖2-A），肝臟內(nèi)TC與TG含量均升高，其中TG大幅升高，是正常組含量的3 倍（圖2-B）。肝臟病理組織學(xué)染色檢查結(jié)果表明，mdx小鼠肝細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)許多大小不一的空泡，邊界清晰，將細(xì)胞核擠向一側(cè)。肝細(xì)胞呈現(xiàn)腫脹的形態(tài)，無(wú)炎癥現(xiàn)象（圖2-C）。同時(shí)，mdx小鼠的肝臟油紅染色結(jié)果顯示其肝臟內(nèi)脂滴顯著增多（圖2-C）。

3.3 血清生化檢測(cè)

與對(duì)照組相比，7 周齡的mdx 小鼠血清中ALT、AST 大幅度升高，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）（圖3-E，3-F），而FFA、HDL、TBA、TC、TG 與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化，其中TBA略微上升，TC稍有下降，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3）。血生化檢測(cè)結(jié)果顯示mdx 小鼠可能存在肝臟炎癥，血清中脂質(zhì)含量沒(méi)有明顯變化。

3.4 mdx小鼠肝臟內(nèi)脂質(zhì)合成相關(guān)因子含量上調(diào)

Figure 2 Increased lipid content in liver of mdx miceA: Liver index (±s, n = 6); B: Concentrations of TC and TG in liver (xˉ± s, n=6); C: HE staining and oil red O (ORO) staining of liver (20 × )*P ＜0.05 vs control group

Figure 3 Concentrations of TC (A), TG (B), TBA (C), HDL (D), ALT (E), AST (F) and FFA (G) in serum in control and mdx mice (±s, n = 6)***P ＜0.001 vs control group

與對(duì)照組相比，mdx小鼠肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)量均升高，其中Fasn，Srebp1-c表達(dá)量顯著提高，Scd1基因表達(dá)顯著升高，Acc基因表達(dá)上調(diào)，以上4 個(gè)基因的表達(dá)對(duì)照組和模型組之間均有顯著性差異（P＜0.05）（圖4-A）。Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，mdx 小鼠肝臟內(nèi)FASN、SREBP-1c、ACC 和p-ACC 的蛋白表達(dá)量均顯著上調(diào)，而ACC 的磷酸化水平?jīng)]有明顯變化（圖4-B）。結(jié)果提示mdx 小鼠肝臟脂質(zhì)含量增多是由于肝臟中脂質(zhì)合成的增加。

Figure 4 Increased expression of lipid synthesis related factors of liver in mdx mice (±s, n = 6)A: Gene expression of lipid synthesis related factors detected by qPCR; B: Protein expression of FASN, SREBP1-c, ACC and p-ACC/ACC in liver*P ＜0.05 ,**P ＜0.01, ***P ＜0.001 vs control group

4 討論

小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，mdx小鼠肝臟內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴，肝臟中TC 和TG 的含量均上升，提示肝臟中膽固醇運(yùn)輸出現(xiàn)問(wèn)題以及TG 發(fā)生累積。mdx 小鼠肝臟組織中脂質(zhì)合成以及氧化代謝相關(guān)酶中FASN，SREBP1-c 與ACC 的基因和蛋白表達(dá)量均顯著上調(diào)，提示肝臟組織內(nèi)脂質(zhì)沉積可能是由于脂質(zhì)合成的增加，SREBP1-c 表達(dá)量上調(diào)也提示存在胰島素上調(diào)而增加脂肪的可能。

DMD 患者臨床數(shù)據(jù)表明，嬰兒期的DMD 患者肌酸激酶（creatine kinase，CK）活性明顯升高，并有研究表明血清CK 與ALT、AST水平有顯著相關(guān)性。雖然mdx 小鼠血清中ALT、AST 含量顯著升高，但ALT和AST缺乏肝臟特異性，因此對(duì)具有潛在肌肉功能障礙的患者肝細(xì)胞損傷的診斷受到嚴(yán)格限制。最新研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸脫氫酶可作為肝損傷的肝臟特異性生物標(biāo)志物，具有改善潛在基礎(chǔ)性肌肉損傷患者肝細(xì)胞損傷診斷的潛力［17］。

肌肉生長(zhǎng)抑制素是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 超家族中高度保守的成員，是骨骼肌質(zhì)量的有效負(fù)調(diào)節(jié)因子。在成人組織中，肌肉生長(zhǎng)抑制素主要在骨骼肌中表達(dá)，在脂肪組織和心臟中也有少量表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在mdx 小鼠中阻斷肌肉生長(zhǎng)抑制素蛋白的表達(dá)能夠緩解mdx 小鼠肌肉萎縮的癥狀［18］。有臨床報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在肝移植及肝纖維化患者中，血漿肌肉生長(zhǎng)抑制素含量有明顯上調(diào)，這一發(fā)現(xiàn)提示肌肉生長(zhǎng)抑制素是晚期肝病患者肌肉萎縮的關(guān)鍵因素。同時(shí)，血清中肌肉生長(zhǎng)抑制素水平升高與肝硬化患者的生存率降低有關(guān)，提示肌肉生長(zhǎng)抑制素在肝硬化發(fā)展進(jìn)程中可能起到了重要的調(diào)節(jié)作用［19-21］。課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，DMD 患者與mdx 鼠肌肉中的肌肉生長(zhǎng)抑制素的蛋白表達(dá)增加，非諾貝特能抑制腓腸肌與膈肌中肌肉生長(zhǎng)抑制素的蛋白表達(dá)。因此可考察肌肉生長(zhǎng)抑制素是否與脂質(zhì)合成相關(guān)酶有關(guān)聯(lián)，初步探究骨骼肌和肝病之間相互影響的機(jī)制。

以上結(jié)果均提示了7 周齡的mdx 小鼠肝臟組織內(nèi)存在脂質(zhì)蓄積。mdx 小鼠展示了當(dāng)抗肌萎縮蛋白的基因被完全敲除后其肝臟的變化，抗肌萎縮蛋白的基因缺失導(dǎo)致了體內(nèi)骨骼肌減少。同時(shí)，缺少運(yùn)動(dòng)或不健康飲食也會(huì)導(dǎo)致骨骼肌量的減少，骨骼肌量與肝臟脂肪面積呈負(fù)相關(guān)。脂肪合成相關(guān)酶FASN、SREBP1-c、ACC 和肌肉生長(zhǎng)抑制素是兩者相關(guān)機(jī)制的可能靶點(diǎn)。

綜上所述，mdx 小鼠肝臟脂質(zhì)含量顯著增加，其發(fā)生機(jī)制與脂質(zhì)合成相關(guān)酶FASN、SREBP1-c、ACC的上調(diào)有關(guān)。