張紫玲,陸 茜,徐登球,俞沁瑋*,江振洲,2,3**
(1中國(guó)藥科大學(xué)新藥篩選中心,南京210009;2中國(guó)藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京210009;3中國(guó)藥科大學(xué)藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京210009)
骨骼肌與肝臟之間存在著密切的器官應(yīng)答關(guān)系。骨骼肌功能障礙會(huì)影響體內(nèi)的脂質(zhì)平衡,患有骨骼肌疾?。ㄈ缍攀霞I(yíng)養(yǎng)不良癥和肌肉減少癥)的患者患上代謝相關(guān)性脂肪性肝?。╩etabolic associated fatty liver disease,MAFLD)的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)相應(yīng)增加[1-2]。研究表明,肌少癥是誘發(fā)MAFLD 的危險(xiǎn)因素之一,其病理生理機(jī)制包括胰島素抵抗、血脂異常和炎癥增加[3],肌少癥還可能是糖尿病易感性的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)[4]。同時(shí),快速的骨骼肌萎縮預(yù)示肝硬化患者的生存率降低[5]。運(yùn)動(dòng)干預(yù)治療MAFLD 的結(jié)果表明,通過(guò)有氧運(yùn)動(dòng)和耐力運(yùn)動(dòng)促進(jìn)肌再生能降低肝臟脂肪含量[6],肝臟與脂肪組織、骨骼肌與微生物群之間的相互作用也可能是肌再生對(duì)MAFLD 的影響之一[7]。闡明骨骼肌與肝臟之間的關(guān)系,有利于從骨骼肌方向干預(yù)MAFLD的發(fā)病進(jìn)程,或提示骨骼肌損傷患者關(guān)注肝臟病變,提早進(jìn)行肝臟保護(hù)治療。
杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchene muscular dystrophy,DMD),即假肥大型進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥,是一種X 連鎖隱性遺傳的嚴(yán)重進(jìn)行性肌肉萎縮性疾病,會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)困難,最終發(fā)展為需要輔助通氣和過(guò)早死亡[8]。其發(fā)病原因是染色體上編碼抗肌萎縮蛋白的部分基因重復(fù)、突變或缺失,造成抗肌萎縮蛋白在肌纖維上的缺失或功能異常[9]。臨床數(shù)據(jù)表明,DMD 嬰兒有肝功能生化異常的情況,在臨床兒科上出現(xiàn)了原因不明無(wú)黃疸的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)升高,甚至有曾被誤診為肝炎的案例[10],并且小兒DMD 患者血脂異常的發(fā)生率很高[11]。然而,DMD 對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝的影響及其作用機(jī)制尚未闡明。C57BL/10ScSn-Dmdmdx/Jnju(mdx)小鼠是用于研究DMD 疾病的模型動(dòng)物,該動(dòng)物編碼抗肌萎縮蛋白的基因4號(hào)外顯子出現(xiàn)無(wú)義突變,導(dǎo)致抗肌萎縮蛋白無(wú)法表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)以mdx 小鼠為DMD 模型,探究其肝臟脂質(zhì)代謝變化情況。
脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,F(xiàn)ASN)在動(dòng)物肝臟脂質(zhì)生成、沉積的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[12]。乙酰輔酶A 羧化酶(acetyl CoA carboxylase,ACC)是催化脂肪酸合成代謝第一步反應(yīng)的限速酶[13-14],其中ACC1在肝臟、脂肪和泌乳乳腺中表達(dá)量較高[15]。FASN 能利用ACC1 生成的丙二酰輔酶A在胞質(zhì)中合成脂肪酸。同時(shí),除脂質(zhì)合成的相關(guān)酶以外,肝臟脂質(zhì)合成的過(guò)程還受多種飲食和激素因素的調(diào)節(jié),這些因素控制著脂肪合成相關(guān)酶的表達(dá)。膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding proteins,SREBPs)是一類(lèi)固定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核被膜上的膜連接蛋白,其中SREBP-1c 作為負(fù)責(zé)胰島素增強(qiáng)脂質(zhì)生成的胰島素應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子,在調(diào)控脂質(zhì)合成中發(fā)揮著重要的作用[16]。然而,這些脂質(zhì)合成酶是否在DMD 誘發(fā)肝臟脂質(zhì)代謝異常的的過(guò)程中起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用,還有待進(jìn)一步探究。
本課題基于DMD患者臨床上所出現(xiàn)的血脂異?,F(xiàn)象,以及骨骼肌疾病和MAFLD 之間緊密的聯(lián)系,探究DMD 對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝的影響及其作用機(jī)制。研究結(jié)果可為臨床DMD患者檢測(cè)肝臟脂質(zhì)代謝情況提供理論依據(jù),提示患者盡早進(jìn)行肝臟保護(hù)治療,也為治療MALFD提供一個(gè)新的研究思路。
Dystrophin 抗體(美國(guó)DSHB 公司);羊抗兔IgG(H+L)交叉吸附二級(jí)抗體(Alexa Fluor 488)、DAPI 染色液、羊抗兔IgG(H+L)二級(jí)抗體(HRP)(美國(guó)Thermo Fisher 公司);4% 多聚甲醛、抗熒光淬滅封片液、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所);總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽汁酸(total bile acid,TBA)、游離脂肪酸(free fatty acid,F(xiàn)FA)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所);ALT、AST 檢測(cè)試劑盒(中國(guó)東軟威特曼生物科技有限公司);總RNA 提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix、高敏型ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(南京諾維贊生物科技有限公司);FASN 抗體(美國(guó)Proteintech 公司);SREBP-1c抗體、ACC 抗體(美國(guó)Affinity 公司);p-ACC 抗體(美國(guó)CST 公司);β-actin(武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司);油紅O 粉末(上海阿拉丁試劑有限公司);蘇木精-伊紅染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司);引物(上海英駿生物技術(shù)有限公司);其他試劑均為市售分析純。
激光共聚焦顯微鏡、BX53 顯微鏡(日本Olympus 公司);多功能酶標(biāo)儀、高速低溫離心機(jī)、Nanodrop 2000/2000C(美國(guó)Thermo 公司);AB StepOne-Plus Real-Time PCR Instrument(美國(guó)生命科技有限公司);電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad 公司);低溫研磨儀(武漢賽維爾生物科技有限公司);冷凍切片機(jī)(德國(guó)Leica 公司);Tanon 4600 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。
雄性C57BL/10ScSn-Dmdmdx/JNju 鼠(以下簡(jiǎn)稱(chēng)mdx 小鼠)和雄性C57BL/6J 鼠(以下稱(chēng)為對(duì)照組)6周齡,SPF 級(jí),購(gòu)于南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(蘇)2016-0003。動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)藥科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障系統(tǒng),正常飲食飲水,晝夜交替。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。
對(duì)照組與mdx 小鼠各6 只,于7 周齡時(shí)處死,解剖取其肝臟組織和肌肉組織,取適宜大小進(jìn)行冷凍包埋,另取一塊放入4% 多聚甲醛中浸泡固定,送往江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病理科制作石蠟包埋進(jìn)行組織切片,剩余組織用錫紙包裹后置于液氮中,2 h后取出立即保存于-80 ℃冰箱。
將冷凍包埋后的骨骼肌組織于冷凍切片機(jī)制片,切片厚度為8 μm,制備好的載玻片樣品于室溫干燥5 min 后,浸入預(yù)冷丙酮(4 ℃)中固定15 min,用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌3 次,晾干液體后于組織樣本上覆蓋含有5% 驢血清的封閉液室溫封閉30 min。棄去液體,加上抗肌萎縮蛋白抗體,4 ℃避光孵育過(guò)夜。吸棄抗體,PBS 浸洗3 次,每次5 min,滴加熒光二抗,室溫避光孵育1 h。吸棄二抗,PBS 浸洗3 次,滴加DAPI染色液,室溫避光孵育10 min,吸棄DAPI 染色液,PBS 浸洗3 次,組織樣本上滴加適量抗熒光淬滅封片液,蓋片,在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。
稱(chēng)取肝組織20 mg,放入磁珠,加入生理鹽水200 μL 勻漿,于高速低溫離心機(jī)2500 r/min 離心10 min,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)上操作,于多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸收度,計(jì)算肝勻漿液中TC、TG 的含量。將上步勻漿液低溫11200 r/min 離心10 min,取上清液用BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白含量,用以計(jì)算TC、TG的終濃度。
2.4.1 油紅染色(oil red O staining,OR O 染色)油紅粉末溶于異丙醇中制備成0.5% 油紅母液,母液與水以3∶2混合制備油紅稀釋液,濾紙過(guò)濾后進(jìn)行染色。油紅染完后使用蘇木素染色液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。最后滴加甘油明膠封片液,蓋上蓋玻片,于BX53顯微鏡下觀察并拍照。
2.4.2 蘇木精-伊紅染色(HE染色) 肝臟(肌肉)組織切片使用4% 多聚甲醛溶液固定1 min,而后干燥15 min,用HE 染色液對(duì)組織切片進(jìn)行染色,隨后用樹(shù)脂封片,待樹(shù)脂完全晾干后,于BX53 顯微鏡下觀察并拍照。
小鼠眼球取血收集血清,室溫靜置4 h 后以3000 r/min 轉(zhuǎn)速離心15 min,吸取上清液,保存于4 ℃冰箱。按試劑盒操作步驟檢測(cè)血清內(nèi)TC、TG、TBA、FFA、HDL,以及ALT 和AST 的含量,于多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸收度,計(jì)算相應(yīng)含量。
采用總RNA 提取試劑提取肝臟RNA。采用Nanodrop 2000/2000C 分光光度法測(cè)定RNA 濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后,使用SYBR Green 試劑在應(yīng)用生物系統(tǒng)StepOnePlus?Real-Time PCR 上進(jìn)行RT-PCR,檢測(cè)脂質(zhì)合成與代謝相關(guān)基因含量。引物序列如表1所示。
稱(chēng)取肝臟組織50 mg,使用RIPA 裂解液提取蛋白原液,于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。通過(guò)BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白樣品的濃度,再加入上樣緩沖液將其配制成質(zhì)量濃度為5 μg/μL 的蛋白樣品,95 ℃金屬浴煮10 min,制備上樣樣品。樣品通過(guò)蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)脂質(zhì)合成和代謝相關(guān)酶的蛋白含量。一抗為FASN 抗體、SREBP-1c 抗體、ACC 抗體、p-ACC 抗體、β-Actin,二抗為羊抗兔IgG 抗體。完成一抗與二抗的特異性結(jié)合后,使用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒在發(fā)光成像系統(tǒng)上檢測(cè)蛋白表達(dá)的信號(hào)強(qiáng)度。
Table 1 Sequences of real time PCR primers
使用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。所有數(shù)據(jù)采用±s表示,組間分析全部使用t檢驗(yàn),當(dāng)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
對(duì)mdx 小鼠的脛骨前?。╰ibialis anterior,TA)進(jìn)行抗肌萎縮蛋白的免疫熒光染色(圖1-A)和HE染色(圖1-B),結(jié)果顯示mdx 小鼠TA 肌細(xì)胞內(nèi)抗肌萎縮蛋白缺失,肌細(xì)胞皺縮,有較多中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。
Figure 1 Loss of dystrophin in tibialis anterior (TA)and muscle damage in mdx miceA: TA muscle was stained with dystrophin (green) and DAPI was used to stain the nuclei (blue) (Scale bar = 50 μm); B: HE staining of TA(Scale bar = 50 μm)DMD: Duchene muscular dystrophy
與對(duì)照組相比,mdx 小鼠的肝重系數(shù)上升(圖2-A),肝臟內(nèi)TC與TG含量均升高,其中TG大幅升高,是正常組含量的3 倍(圖2-B)。肝臟病理組織學(xué)染色檢查結(jié)果表明,mdx小鼠肝細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)許多大小不一的空泡,邊界清晰,將細(xì)胞核擠向一側(cè)。肝細(xì)胞呈現(xiàn)腫脹的形態(tài),無(wú)炎癥現(xiàn)象(圖2-C)。同時(shí),mdx小鼠的肝臟油紅染色結(jié)果顯示其肝臟內(nèi)脂滴顯著增多(圖2-C)。
與對(duì)照組相比,7 周齡的mdx 小鼠血清中ALT、AST 大幅度升高,有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)(圖3-E,3-F),而FFA、HDL、TBA、TC、TG 與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化,其中TBA略微上升,TC稍有下降,但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3)。血生化檢測(cè)結(jié)果顯示mdx 小鼠可能存在肝臟炎癥,血清中脂質(zhì)含量沒(méi)有明顯變化。
Figure 2 Increased lipid content in liver of mdx miceA: Liver index (±s, n = 6); B: Concentrations of TC and TG in liver (xˉ± s, n=6); C: HE staining and oil red O (ORO) staining of liver (20 × )*P <0.05 vs control group
Figure 3 Concentrations of TC (A), TG (B), TBA (C), HDL (D), ALT (E), AST (F) and FFA (G) in serum in control and mdx mice (±s, n = 6)***P <0.001 vs control group
與對(duì)照組相比,mdx小鼠肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)量均升高,其中Fasn,Srebp1-c表達(dá)量顯著提高,Scd1基因表達(dá)顯著升高,Acc基因表達(dá)上調(diào),以上4 個(gè)基因的表達(dá)對(duì)照組和模型組之間均有顯著性差異(P<0.05)(圖4-A)。Western blot 結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,mdx 小鼠肝臟內(nèi)FASN、SREBP-1c、ACC 和p-ACC 的蛋白表達(dá)量均顯著上調(diào),而ACC 的磷酸化水平?jīng)]有明顯變化(圖4-B)。結(jié)果提示mdx 小鼠肝臟脂質(zhì)含量增多是由于肝臟中脂質(zhì)合成的增加。
Figure 4 Increased expression of lipid synthesis related factors of liver in mdx mice (±s, n = 6)A: Gene expression of lipid synthesis related factors detected by qPCR; B: Protein expression of FASN, SREBP1-c, ACC and p-ACC/ACC in liver*P <0.05 ,**P <0.01, ***P <0.001 vs control group
小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示,mdx小鼠肝臟內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴,肝臟中TC 和TG 的含量均上升,提示肝臟中膽固醇運(yùn)輸出現(xiàn)問(wèn)題以及TG 發(fā)生累積。mdx 小鼠肝臟組織中脂質(zhì)合成以及氧化代謝相關(guān)酶中FASN,SREBP1-c 與ACC 的基因和蛋白表達(dá)量均顯著上調(diào),提示肝臟組織內(nèi)脂質(zhì)沉積可能是由于脂質(zhì)合成的增加,SREBP1-c 表達(dá)量上調(diào)也提示存在胰島素上調(diào)而增加脂肪的可能。
DMD 患者臨床數(shù)據(jù)表明,嬰兒期的DMD 患者肌酸激酶(creatine kinase,CK)活性明顯升高,并有研究表明血清CK 與ALT、AST水平有顯著相關(guān)性。雖然mdx 小鼠血清中ALT、AST 含量顯著升高,但ALT和AST缺乏肝臟特異性,因此對(duì)具有潛在肌肉功能障礙的患者肝細(xì)胞損傷的診斷受到嚴(yán)格限制。最新研究發(fā)現(xiàn),谷氨酸脫氫酶可作為肝損傷的肝臟特異性生物標(biāo)志物,具有改善潛在基礎(chǔ)性肌肉損傷患者肝細(xì)胞損傷診斷的潛力[17]。
肌肉生長(zhǎng)抑制素是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 超家族中高度保守的成員,是骨骼肌質(zhì)量的有效負(fù)調(diào)節(jié)因子。在成人組織中,肌肉生長(zhǎng)抑制素主要在骨骼肌中表達(dá),在脂肪組織和心臟中也有少量表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),在mdx 小鼠中阻斷肌肉生長(zhǎng)抑制素蛋白的表達(dá)能夠緩解mdx 小鼠肌肉萎縮的癥狀[18]。有臨床報(bào)道發(fā)現(xiàn),在肝移植及肝纖維化患者中,血漿肌肉生長(zhǎng)抑制素含量有明顯上調(diào),這一發(fā)現(xiàn)提示肌肉生長(zhǎng)抑制素是晚期肝病患者肌肉萎縮的關(guān)鍵因素。同時(shí),血清中肌肉生長(zhǎng)抑制素水平升高與肝硬化患者的生存率降低有關(guān),提示肌肉生長(zhǎng)抑制素在肝硬化發(fā)展進(jìn)程中可能起到了重要的調(diào)節(jié)作用[19-21]。課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),DMD 患者與mdx 鼠肌肉中的肌肉生長(zhǎng)抑制素的蛋白表達(dá)增加,非諾貝特能抑制腓腸肌與膈肌中肌肉生長(zhǎng)抑制素的蛋白表達(dá)。因此可考察肌肉生長(zhǎng)抑制素是否與脂質(zhì)合成相關(guān)酶有關(guān)聯(lián),初步探究骨骼肌和肝病之間相互影響的機(jī)制。
以上結(jié)果均提示了7 周齡的mdx 小鼠肝臟組織內(nèi)存在脂質(zhì)蓄積。mdx 小鼠展示了當(dāng)抗肌萎縮蛋白的基因被完全敲除后其肝臟的變化,抗肌萎縮蛋白的基因缺失導(dǎo)致了體內(nèi)骨骼肌減少。同時(shí),缺少運(yùn)動(dòng)或不健康飲食也會(huì)導(dǎo)致骨骼肌量的減少,骨骼肌量與肝臟脂肪面積呈負(fù)相關(guān)。脂肪合成相關(guān)酶FASN、SREBP1-c、ACC 和肌肉生長(zhǎng)抑制素是兩者相關(guān)機(jī)制的可能靶點(diǎn)。
綜上所述,mdx 小鼠肝臟脂質(zhì)含量顯著增加,其發(fā)生機(jī)制與脂質(zhì)合成相關(guān)酶FASN、SREBP1-c、ACC的上調(diào)有關(guān)。