楊 倩，汪小澗

（1國家知識產權局專利局專利審查協作北京中心，北京100160；2中國醫(yī)學科學院、北京協和醫(yī)學院藥物研究所，天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京100050）

鞘脂（sphingolipids）是生物膜的重要組成部分，具有兩性結構，兩端分別是長鏈脂肪酸和極性醇［1］。在生物體內，鞘脂可通過溶酶體中的神經磷脂酶催化水解生成神經酰胺（ceramide，Cer），然后被神經酰胺水解酶水解生成鞘氨醇（sphingosine，Sph），再 通過 鞘氨 醇激 酶（sphingosine kinase，SphK）磷酸化得到鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine 1-phosphate，S1P）。S1P也可以通過鞘氨醇-1-磷酸磷酸酶轉化為Sph，進而在神經酰胺合成酶的作用下重新生成Cer。Cer-Sph-S1P 之間可逆的動態(tài)平衡被稱為鞘脂-變阻器（sphingolipid-rheostat）。其中，SphK作為催化Sph生成S1P過程中的限速酶，在調控該平衡時起重要作用［2］。研究表明，SphK 抑制劑可以使Cer/Sph 的比例升高以及S1P 含量降低，從而促進腫瘤細胞凋亡，具有良好的藥物開發(fā)前景［3-6］。

1 SphK1的結構生物學

SphK 分為SphK1 和SphK2 兩種亞型，序列高度同源，但是在分布和功能上有一定差異。從器官和組織分布來看，SphK1 在脾和肺中含量較高，SphK2 在心臟和肝中含量較高；從細胞內分布來看，SphK1 主要存在于細胞質，SphK2 主要存在于細胞核。從對Cer-Sph-S1P 平衡的調控作用來看，下調SphK1 的表達時平衡向Cer 方向移動，而下調SphK2 的表達時則會促使平衡向S1P 方向移動［6］。其中，SphK1參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的調控作用受到較多關注。

SphK1 的激活會引發(fā)一系列信號通路級聯傳遞，涉及PI3K/AKT/GSK3 通路和S1P/S1PR3/Notch等通路［7-8］。SphK1 具有致癌作用，在肺癌、乳腺癌、胃癌、結腸癌等多種腫瘤細胞中SphK1 的表達和mRNA 水平明顯高于正常細胞［9］。Olivera 等［10］發(fā)現，NIH/3T3 成纖維細胞中SphK1 活性提高后S1P 含量隨之升高，使得細胞增殖速度明顯加快。同時，SphK1 活性提高還可以使NIH/3T3 成纖維細胞和HEK293 細胞在無血清培養(yǎng)或高濃度神經酰胺條件下免于凋亡，具備了類似腫瘤細胞的增殖能力。Xia 等［11］將SphK1 高表達的SK-3T3 細胞移植到小鼠體內，四周后所有的小鼠都發(fā)生了癌變。SphK1 也具有促進腫瘤組織血管生成的作用［12］。Nava 等［13］發(fā)現注射高表達SphK1 的MCF-7 細胞的裸鼠腫瘤組織周圍的血管密度增加。SphK1 活性也與腫瘤細胞對化療或放療的敏感性相關。Min等［14］發(fā)現加入SphK1 抑制劑后黏菌細胞對順鉑的敏感性提高。Sauer等［15］發(fā)現抑制SphK1的活性可以降低前列腺癌細胞對多西他賽的耐藥性。Bonhoure 等［16］發(fā)現對伊馬替尼有耐藥性的LAMA84-s細胞中SphK1 高表達，當使用SphK1 抑制劑F-12509a 抑制SphK1 的活性或者用siRNA 沉默SphK1 的表達時，耐藥性得到顯著改善。 Nava等［17］發(fā)現對放療不敏感的前列腺癌細胞LNCaP 中SphK1活性較正常細胞更高，抑制SphK1的活性后伽馬射線誘導LNCaP凋亡的效果顯著增強。

近期研究結果顯示：SphK1 和S1PR3 受體與GC 細胞的趨化性和調節(jié)密切相關［18］。在血液中存在的鞘脂溶血磷脂酸處理的MKN1 GC細胞中觀察到SphK1 mRNA 和蛋白水平的增加，而SphK2的表達不受影響。SphK1 和S1PR3 受體介導LPA 和EGF刺激的MKN1細胞遷移和侵襲，但LPA調節(jié)的新生血管形成因子（包括白細胞介素）的表達不受該激酶影響。

目前，人源SphK1晶體結構以及SphK1與底物鞘氨醇的共結晶結構已經被報道［19］。SphK1 由N-末端和C-末端兩個結構域組成，包含9個α 螺旋和17 個β 折疊結構。在SphK1 的C 端有一個J 型口袋，是底物鞘氨醇的結合部位。鞘氨醇結構中的脂肪鏈與J 型口袋的多個氨基酸殘基之間形成疏水作用，2-氨基-1，3 二醇末端與Asp81，Asp178 和Ser168 形成氫鍵作用。SphK1 的ATP 結合域位于N-末端和C-末端間的裂縫區(qū)域，ATP 的堿基與Glu55，Arg56 和Asn22 之間形成π-π堆積作用，磷酸基團與Asp341，Glu343，Arg185和Arg191形成氫鍵和靜電鹽橋作用。鞘氨醇和ATP 在SphK1 的結合位點在空間上較為接近。近年來，研究者們通過對底物鞘氨醇進行結構改造或高通量篩選新結構分子等多種手段進行SphK1 抑制劑的研究。本文根據抑制劑的結構特征和來源進行分類，并對各類抑制劑的構效關系進行綜述。

2 SphK1抑制劑的結構類型和構效關系

2.1 鞘氨醇（Sph）類似物

Sph（1）是SphK 的天然底物。從Sph 出發(fā)，將結構中的不飽和烯鏈替換為飽和脂肪鏈得到DHS（2）對SphK1有一定的抑制活性［20］。將Sph的氨基進行二甲基化后得到DMS（3），對SphK1 和SphK2均有抑制活性［21］。De Jonghe 等［22］進一步圍繞Sph開展結構改造研究，包括縮短脂肪鏈的長度（4），在短鏈中引入苯環(huán)（5，9 ～11），去除或改變雙鍵的位置（7），將羥基替換為氟等（6，8）。構效關系研究表明，縮短脂肪鏈長度不會明顯影響SphK1 抑制活性，引入苯環(huán)、氟原子取代羥基、改變雙鍵的位置等均能提高抑制活性，羥基或氟取代的碳原子構型對活性沒有太大影響。

2.2 環(huán)狀氨基醇類

FTY-720（12）是諾華制藥研發(fā)的S1P 受體激動劑，于2010年獲批上市，用于多發(fā)硬化癥的治療。研究發(fā)現FTY-720 也是SphK1 的底物競爭性抑制劑，可以誘導SphK1 蛋白降解。Xiang 等［23］將氨基丙二醇片段替換為五元環(huán)狀氨基醇片段，并通過酰胺鍵與苯環(huán)相連得到化合物13，對SphK1具有較強抑制作用，但是水溶性較差。首先，嘗試在烷基側鏈中引入五元芳雜環(huán)得到化合物14，雖然提高了水溶性，但是SphK1 的抑制活性顯著降低。隨后在化合物14的苯環(huán)和酰胺氮之間引入亞甲基獲得化合物15的抑制活性顯著提高。繼續(xù)優(yōu)化烷基側鏈，改變烷基側鏈的長度，將鏈狀烷烴替換為環(huán)烷烴或苯環(huán)等最終得到化合物16的活性和水溶性都有提高［24］。

Baek 等［25］將FTY-720 的氨基丙二醇片段替換為六元環(huán)狀氨基醇片段，經過篩選發(fā)現4-羥基哌啶的活性最強，得到RB-005（17）。研究表明，RB-005 除了能夠抑制SphK1 的活性外，還能促進SphK1蛋白發(fā)生降解。構效關系研究顯示，哌啶環(huán)的羥基作為氫鍵供體是化合物具備SphK1 抑制活性的必須基團，將羥基替換為氨基（18）或將哌啶六元環(huán)換為五元環(huán)（19）都能保持活性，但是將哌啶的4-位羥基甲基化或氧化為羰基，缺失氫鍵供體則活性全部喪失。

輝瑞公司的研究人員在高通量篩選的基礎上結合結構優(yōu)化獲得PF-543（20），對SphK1 的抑制活性Ki達到3.6 nmol/L，對SphK2 的抑制活性僅為360 nmol/L，是目前報道的活性最強的SphK1 選擇性抑制劑。分析PF-543 與SphK1 的共結晶復合物可以看出，PF-543 采用一種彎曲構象與SphK1 結合，其末端的苯環(huán)伸展到由苯丙氨酸，亮氨酸等組成的疏水口袋中，環(huán)狀氨基醇極性片段靠近ATP結合位點，氮原子和羥基與影響底物識別的關鍵氨基酸殘基Asp264 的側鏈形成氫鍵作用（圖1）。PF-543 產生SphK1/SphK2 選擇性抑制作用的效果也可以通過分子結合模式得到印證。PF-543 結構末端苯環(huán)可以與SphK1 的芳香氨基酸殘基Phe374之間形成π-π堆積作用，而SphK2該在相應位置的氨基酸殘基是Cys374，無法與苯環(huán)形成相互作用，導致結合力顯著下降。除了對SphK1 抑制作用的選擇性外，PF-543 也可以作為底物被SphK1 磷酸化，但是磷酸化的PF-543 并不會與S1P 受體結合，即不會產生與S1P 類似的生物活性［26-27］。Zhang等［28］近期報道，PF-543 通過降低S1P 水平可顯著減少鐮刀狀紅細胞的生成，提示PF-543 可以被應用于治療鐮刀細胞貧血癥。對比在先報道的鞘氨醇類SphK1 抑制劑，PF-543 的親脂區(qū)域的磺酰苯環(huán)以及甲苯結構與SphK1 的親脂區(qū)域有更強的疏水結合作用，而親水作用的區(qū)域則可以與天冬氨酸264形成靜電鹽橋的作用力，提高了其對蛋白的結合活性。

圖1 PF-543（20）與鞘氨醇激酶1（SphK1）的結合模式

2.3 末端為脒基或胍基極性結構

除了環(huán)狀氨基醇結構，對氨基醇的改造還包括將其替換為脒基或胍基。Foss 等［29］報道了一類具有脒基末端的鞘氨醇激酶抑制劑，在S1P激動劑研究中獲得活性化合物VPC4512（21），進一步探索極性末端的修飾方式獲得化合物22 具有SphK抑制作用。將脒基替換為極性的羧基（23）和酰胺（24）后抑制活性完全喪失。分析原因，脒基質子化帶有正電荷，類似于鞘氨醇的胺基，可以與SphK1 的Asp177 形成鹽橋作用，對抑制活性至關重要，羧基在生理條件下帶負電荷，酰胺為中性，均不能形成鹽橋作用，因而活性喪失。進一步對手性中心進行改造，將甲基替換為環(huán)丙基消除手性同時增大立體體積，得到化合物25，與化合物24相比對SphK1 的選擇性增強1 倍。將化合物25 的烷基鏈替換為不同長度的脂肪鏈，結果顯示12 個碳原子的長度為最佳（26），調換酰胺側鏈方向（27）在保持SphK1 抑制活性的同時SphK2 抑制活性降低為原來的1/10，顯示出更優(yōu)的SphK1選擇抑制作用。第二輪結構改造中，將化合物26 的環(huán)丙基替換為環(huán)丁基（28），或是骨架躍遷為2-脒基四氫吡咯結構得到化合物29 和VPC96091（30），然而化合物28和29的活性都顯著下降，僅化合物30活性保持，表明脒基與酰胺鍵的二面角對于活性有重要影響。進一步將化合物30的脂肪鏈替換為苯環(huán)、環(huán)戊烷、環(huán)己烷、金剛烷等體積更大的側鏈考察對活性的影響，引入醚鍵調整化合物的clogP，最終得到的化合物31 對SphK1 的抑制活性有所增強。但是，化合物31 結構的自由度較大可能影響結合力，考慮適當增強剛性，保留脒基極性末端和環(huán)己烷脂肪側鏈獲得化合物32，對于SphK1 的抑制活性進一步提高［30］。

在FTY-720（12）的基礎上，將其氨基丙二醇片段替換為伯胺、仲胺、叔胺和季銨鹽結構的衍生物，其中化合物33 具有中等水平的SphK1/2 抑制活性和微弱的SphK2 選擇性。將季銨鹽結構替換為胍基，在生理條件下，胍基與脒基性質相似，其質子化后帶有正電荷，同樣可與Asp 殘基產生氫鍵、鹽橋等相互作用。進一步將環(huán)己烷結構替換為剛性更強的芳雜環(huán)結構，增強配體與蛋白之間的結合力，得到SLR080811（34）對SphK1 和SphK2均有一定的的抑制活性。值得注意的是，在噁二唑環(huán)和四氫吡咯環(huán)中間引入一個亞甲基后可增強對SphK1 的選擇性（35）［31］。將化合物34 的苯環(huán)替換為萘環(huán)骨架，在萘環(huán)上引入不同的醚鍵并進行取代基的修飾，結果顯示對位三氟甲基取代的芐氧基化合物SLC5091592（36）對SphK2 的選擇性顯著提高［32］。進一步修飾脂肪區(qū)的體積和親脂性得到SLM6071469（37）還可以進一步提高選擇性［33］。

2.4 通過高通量篩選獲得的五元芳雜環(huán)類

2003年，French等［34］通過高通量篩選發(fā)現4個新結構類型的SphK 抑制劑，分別命名為SKI-I（38）、SKI-II（39）、SKI-III（40）和SKI-IV（41），這些化合物對于多種激酶有抑制作用，其中SKI-II 對SphK1 具有選擇性抑制作用，毒性較小，表現出較高的口服生物利用度和適宜的半衰期（t1/2=15 h）。除了抑制SphK1 活性外，SKI-II 可以激活SphK1 的泛素-蛋白酶降解途徑，促進SphK1 蛋白在體內被降解。正常生理條件下，SKI-II 可顯著縮短SphK1蛋白的半衰期至0.8 h［35］，并且可以促進SphK1 被溶酶體的Cathepsin B 迅速降解。各項研究結果均提示SKI-II是一個優(yōu)質的先導化合物［36］。

Aurelio 等［37］在SKI-II 結構基礎上將噻唑環(huán)電子等排替換為噁二唑環(huán)后得到化合物42，對SphK1/2 的抑制活性略微提高，抑制腫瘤細胞PC3增殖活性提高達10倍。進一步將氨基連接鏈省略得到化合物43，對SphK1/2 的抑制活性沒有變化，但抑制腫瘤細胞PC3 增殖的能力卻喪失。 在SphK1蛋白降解實驗中，含噁二唑環(huán)結構的化合物42對SphK1的抑制能力比SKI-II強，卻沒有像SKIII 一 樣 誘 導SphK1 的 降 解，而 化 合 物44、45 對SphK1 的抑制能力雖然比SKI-II 弱，卻能夠有效誘導SphK1的降解，表明誘導SphK1降解的能力與抑制SphK1 活性并非直接相關。鑒于SphK1 蛋白降解與變構位點有關，因此推測化合物42 誘導SphK1 降解能力喪失可能是因為SKI-II 噻唑環(huán)換成噁二唑環(huán)后與變構位點的親和力下降所致?；衔颯KI-II 和化合物42 均具有抑制二氫神經酰胺脫氫酶（Des 1）的活性，其結構中的對氨基苯酚片段可被Des 1 氧化為亞胺醌結構，進而與Des 1 酶發(fā)生親核加成而共價結合，從而不可逆的抑制Des 1。SKI-II 衍生物46 中不含對氨基苯酚片段，則沒有Des 1 的抑制活性。雖然化合物46 對SphK1 和SphK2 具有一定的抑制活性，但抑制腫瘤細胞PC3增殖的活性較弱。

Gustin 等［38］以SKI-II 為先導物，運用拼合策略，通過將酚羥基替換為不同結構的環(huán)狀氨基醇片段、改變氨基醇片段N 原子與苯環(huán)之間的距離、將氯原子替換為其他取代基等多種修飾策略，考察取代基電性、體積、位置等因素對活性的影響，通過多輪優(yōu)化得到的化合物47 和48 均對SphK1有較強的抑制活性。

分析化合物47 與SphK1 的結合模式可以看出，該化合物與鞘氨醇采取相同的構象結合在J型口袋中，六元環(huán)狀氨基醇末端可以與SphK1 相應的氨基酸殘基產生氫鍵作用。其中，哌啶環(huán)的4-位羥基與Asp81 的羧基距離2.8 ?，與Asp81 殘基的羰基發(fā)生氫鍵作用，2-位的羥甲基與Asp178 的羧基距離2.5 ?，與鞘氨醇的3-位羥基相似，與Asp178 發(fā)生氫鍵作用。同時，2-位羥甲基還可以通過水分子介導與Ala339、Gly342、Asp341、Ser168發(fā)生氫鍵作用，而Asp81、Asp178、Ser168 等都是影響SphK1識別底物的關鍵氨基酸殘基（圖2）。

圖2 化合物47與SphK1的結合模式

2.5 金剛烷類

French 等［39］從化合物庫中篩選到一個具有金剛烷骨架結構的鞘氨醇激酶抑制劑，進而合成了一系列金剛烷類衍生物，其中ABC294640（49）因具有較高的口服生物利用度而受到關注。ABC294640 作為選擇性SphK2 抑制劑（Ki= 9.8 μmol/L），對包括肺癌、結腸癌、卵巢癌等多種實體腫瘤都有抑制作用。此外，ABC294640 對胰腺癌細胞也有很強的誘導凋亡作用，并且能夠增強其對化療的敏感性。目前ABC294640 在歐洲以孤兒藥形式被批準治療特定類型胰腺癌，治療白血病的研究已進入臨床Ⅱ期階段。將ABC294640 的吡啶基團替換為鄰苯二酚基團得到化合物ABC294735（50）是一個SphK1 和SphK2 的雙重抑制劑。雖然這兩個化合物抑制SphK 亞型的選擇性有所區(qū)別，但是體內都觀察到具有抗腎癌和胰腺癌增殖的作用，提示在該結構基礎上開發(fā)SphK1抑制劑的可能性［40］。

2.6 ATP競爭性抑制劑

化合物51是首個被報道的以ATP結合位點為靶點的SphK1 抑制劑，雖然化合物51 對于SphK2沒有抑制活性，但是，廣泛的激酶測試數據表明，2 μmol/L濃度下該化合物對65種激酶中的12種抑制率在50%以上，顯示出多激酶抑制效果［41］。

Pitman 等［42］用2 個細菌類脂質激酶（DgkB 和Yegs）進行同源模建，模擬SphK1 的ATP 結合位點結構，對超過10 萬個化合物進行虛擬篩選得到MP-A08（52），其在細胞水平能夠促進腫瘤細胞（A549、BJ7、MCF-7、MDA-MB-231）的Cer-Sph-S1P平衡向Cer方向偏移，誘導腫瘤細胞凋亡。在移植人肺癌細胞A549 的小鼠模型上觀測到化合物52能有效地抑制腫瘤細胞的增殖并阻斷腫瘤組織血管的生成。該化合物并不具有抑制其他激酶的活性，提示了在該結構基礎上進一步研究選擇性SphK1抑制劑的良好前景。

2.7 天然產物來源的抑制劑

Kono等［43］從天然產物中分離得到了一批結構新穎的SphK1 抑制劑。其中，化合物53 是從真菌Discomycete中分離得到的SphK 底物競爭抑制劑，其抑制SphK1 和SphK2 的IC50分別為41 和11 μmol/L。Bonhoure 等［44］發(fā)現化合物53 對于耐藥性白血病時具有潛在的臨床應用價值，對于多重耐藥的急性髓細胞白血病，可以抑制腫瘤細胞HL-60內S1P 的生成，提高Cer 的含量，誘導腫瘤細胞凋亡。在化合物53 的作用下，慢性粒細胞白血病腫瘤細胞對伊馬替尼的耐藥性顯著下降?；衔?4是Kono 等［45］從海洋細菌SANK 71896中分離得到的SphK 底物競爭抑制劑，其抑制SphK1 和SphK2的IC50分別為7.8 和5.0 μmol/L，研究發(fā)現化合物54 可以增強前列腺癌細胞LNCaP 和PC-3 對多西他賽和喜樹堿的敏感性。此外，Kono 等［46］還從真菌Zopfiella inermis中分離得到化合物55 和56，抑制小鼠肝組織SphK 的IC50分別為2.5 和1.6 μmol/L。

Jaspine B（57）是從海綿動物體內分離得到的天然產物，從結構上可以看做是鞘氨醇分子內脫水的類似物，能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖。構效關系研究顯示，結構中四氫呋喃環(huán)的3個手性中心，其構型對鞘氨醇激酶抑制活性有比較大的影響，以化合物58 和59 的相對構型活性較好，脂肪鏈的長度以14個碳原子的長度為宜（60，61）［47］。

3 總結與展望

鞘脂及其代謝產物是生物體內重要的活性分子，參與細胞的生長、分化和衰老相關的信號轉導過程。鞘氨醇激酶在鞘脂變阻器的動態(tài)平衡發(fā)揮重要作用，目前對于SphK1 亞型的生物學和抑制劑研究較為深入。已報道的SphK1 抑制劑包括鞘氨醇底物的結構修飾物、環(huán)狀氨基醇類、脒基或胍基極性末端的化合物，也包括通過高通量篩選、天然產物分離提取得到的新結構分子?？傮w而言，SphK1 抑制劑的結構多樣性尚未被充分挖掘。而且，通過檢索德溫特專利數據庫發(fā)現，SphK1 和SphK2 抑制劑相關的公開不到300 項，表明該類抑制劑的結構研究和專利保護仍有較大空間。SphK1抑制劑可以促進腫瘤細胞凋亡，提高化療藥敏感性、降低或延緩耐藥性，是抗腫瘤藥物的優(yōu)良靶標，而SphK2 抑制劑作為抗腫瘤藥物、抗炎藥物開發(fā)的關注度也逐漸提高。因此，進一步提高SphK1/ SphK2 選擇性或者開發(fā)SphK 抑制劑并提高對其他激酶的選擇性都是可以嘗試的思路。目前SphK1的晶體結構已經被解析，抑制劑與SphK1的作用模式研究比較深入，SphK2的結構和與抑制劑的作用模式還需要進一步研究。因此，可以從SphK1 的三維結構出發(fā)，針對其三維結構觀察到的，底物鞘脂與ATP 位點在空間位置上有所重疊的特點，開展基于結構的藥物設計，嘗試獲得底物及ATP 均有結合作用的抑制劑，從而提高SphK1的選擇性，或者提高SphK 與其他激酶的選擇性，闡明抑制劑結構與活性、選擇性的變化規(guī)律，研究其在體內的作用機制，充分挖掘該類抑制劑針對重大疾病的治療價值。