何健楠 孫啟全

2020年美國(guó)移植年會(huì)（American Transplant Congress，ATC）于2020年5月30日至6月1日以線(xiàn)上會(huì)議形式舉行，主題為“明天的科學(xué)始于今天”（The Science of Tomorrow Starts Today）。本次會(huì)議內(nèi)容豐富，涉及移植相關(guān)的各個(gè)領(lǐng)域，重磅報(bào)道眾多，展示了移植臨床、基礎(chǔ)研究及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的新思路、新技術(shù)與新進(jìn)展。本文摘取了本次會(huì)議中腎移植相關(guān)的重點(diǎn)報(bào)道，就其中基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的國(guó)際前沿?zé)狳c(diǎn)和新進(jìn)展作一綜述。

1 免疫記憶

免疫記憶被認(rèn)為是適應(yīng)性免疫的一種特征，在免疫反應(yīng)中，初始T細(xì)胞和B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為記憶表型，為機(jī)體提供長(zhǎng)期的保護(hù)。記憶性細(xì)胞在保護(hù)性免疫中不可或缺，但在移植中卻是一個(gè)獨(dú)特的挑戰(zhàn)。一方面，記憶性細(xì)胞能夠抵御病原體入侵，降低機(jī)體感染的風(fēng)險(xiǎn)；而另一方面，供體反應(yīng)性的記憶性細(xì)胞會(huì)影響移植物的存活，并導(dǎo)致移植物丟失。記憶性細(xì)胞的兩面性在移植物存活管理中形成了治療的難點(diǎn)。隨著研究的深入，人們對(duì)記憶性細(xì)胞的認(rèn)識(shí)正在不斷演變。

1.1 組織定居型記憶性T細(xì)胞

記憶性細(xì)胞雖然是由血液循環(huán)中的初始細(xì)胞和效應(yīng)性細(xì)胞分化形成，但部分細(xì)胞在局部組織中成熟后可駐留在局部，成為定居型細(xì)胞，其位置和功能受局部特定環(huán)境調(diào)節(jié)。因此，對(duì)移植物局部的記憶性細(xì)胞進(jìn)行探索和處理，將能避免全身性消除記憶性細(xì)胞所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。組織定居型記憶性T細(xì)胞（tissue resident memory T cell，TRM）在功能、轉(zhuǎn)錄和表型上都不同于循環(huán)效應(yīng)性T細(xì)胞和中央記憶性T細(xì)胞。現(xiàn)在普遍認(rèn)為T(mén)RM在局部組織中起到了重要的免疫監(jiān)視和應(yīng)對(duì)感染的作用[1-2]。而TRM在移植中的作用尚不清楚。

美國(guó)匹茲堡大學(xué)Abou-Daya等[3]利用小鼠腎移植模型，探索了TRM在移植中的作用。研究者首先將同基因B6小鼠和異基因（B6×Balb/c）F1.ova小鼠的腎臟分別移植給B6受體小鼠，第2 日予輸注100萬(wàn)的OT-I效應(yīng)性T細(xì)胞。移植術(shù)后測(cè)定血清肌酐的變化，在第4周和第8周取移植物、血液、骨髓等組織進(jìn)行分析。剔除帶有體內(nèi)標(biāo)記的T細(xì)胞后，TRM的表型確定為CD44highCD62LlowCD69+CD103+/-細(xì)胞。結(jié)果顯示，異基因組小鼠的平均血清肌酐水平高于同基因組，異基因組移植物的組織學(xué)表現(xiàn)為急性和慢性混合性排斥反應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)上述表型的TRM存在于OT-I效應(yīng)性T細(xì)胞和內(nèi)源性T細(xì)胞中。

為了進(jìn)一步證明TRM的定居特性，研究者將移植術(shù)后4周的CD45.1 B6小鼠（含OT-I效應(yīng)性T細(xì)胞）和接受了F1.ova供腎的CD45.2 B6小鼠（不含OT-I效應(yīng)性T細(xì)胞）進(jìn)行聯(lián)體共生實(shí)驗(yàn)（通過(guò)聯(lián)體手術(shù)使得兩只小鼠形成血液、體液交互）。然而OT-I效應(yīng)性T細(xì)胞在共生鼠的移植腎和血液循環(huán)中均未檢測(cè)到，說(shuō)明TRM確實(shí)只是定居在移植物中而不會(huì)進(jìn)入血液循環(huán)。

最后，為驗(yàn)證TRM是否足以引起排斥反應(yīng)，研究者在再次移植模型中，使用切除脾臟的LTBR-/-小鼠作為含有TRM的F1.ova腎臟的二級(jí)受體。為了進(jìn)一步確定定居型OT-I效應(yīng)性T細(xì)胞（TRM）和排斥反應(yīng)之間的因果關(guān)系，實(shí)驗(yàn)組在移植術(shù)后第4周使用Thy1.1單克隆抗體將OT-I效應(yīng)性T細(xì)胞耗盡，其排斥反應(yīng)明顯弱于未使用Thy1.1單克隆抗體組。這項(xiàng)研究說(shuō)明了供體特異性的TRM具有效應(yīng)功能，而且在排斥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。

1.2 記憶性細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能及抑制性受體

記憶性細(xì)胞并非任何時(shí)候都持續(xù)執(zhí)行其記憶功能，在某些移植模型中，研究者發(fā)現(xiàn)記憶性細(xì)胞中的亞群顯示出調(diào)節(jié)性細(xì)胞的功能，促進(jìn)了移植物的生存，這與其本來(lái)定義的功能恰恰相反[4-5]。由此說(shuō)明，記憶性細(xì)胞的功能并不是單向的，其在不同條件下會(huì)發(fā)生改變。為了尋找移植術(shù)后調(diào)控記憶性T細(xì)胞功能的新途徑，美國(guó)埃默里大學(xué)Morris等[6]對(duì)傾向于免疫耐受及傾向于免疫排斥的兩組CD8+記憶性T細(xì)胞群體進(jìn)行了高維免疫表型分析。FcγRⅡB是一種抑制性IgG受體，既往認(rèn)為FcγRⅡB僅表達(dá)于B細(xì)胞和初始免疫細(xì)胞表面。研究者發(fā)現(xiàn)在同種免疫反應(yīng)過(guò)程中，F(xiàn)cγRⅡB亦可表達(dá)于CD44highCD8+記憶性T細(xì)胞表面。FcγRⅡB在CD8+記憶性T細(xì)胞上的表達(dá)水平與皮膚移植動(dòng)物模型中的受體中位存活時(shí)間呈正相關(guān)，且與共刺激阻斷治療相關(guān)。與野生型小鼠相比，當(dāng)敲除移植物CD8+記憶性T細(xì)胞的FcγRⅡB基因后，即使給予共刺激阻斷治療，皮膚移植小鼠仍出現(xiàn)加速性排斥反應(yīng)。該研究表明，在異基因免疫應(yīng)答過(guò)程中，F(xiàn)cγRⅡB是CD8+記憶性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)因子，提示針對(duì)該通路的靶向治療可改善致敏個(gè)體的移植結(jié)局。

1.3 天然免疫細(xì)胞的記憶功能

已有研究表明某些類(lèi)型的先天性免疫細(xì)胞，如自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，也可獲得記憶特性，從而強(qiáng)化免疫記憶反應(yīng)[7-8]。最近的一項(xiàng)研究中，Dai等[9]報(bào)道了一個(gè)顛覆性的發(fā)現(xiàn)——天然免疫細(xì)胞具有抗原特異性記憶功能。研究者發(fā)現(xiàn)小鼠單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞獲得了針對(duì)主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ抗原的特異性記憶反應(yīng)，并明確A型配對(duì)免疫球蛋白樣受體（paired immunoglobulin-like receptor A，PIR-A）是記憶反應(yīng)所必需的。敲除受體體內(nèi)的PIR-A或阻斷PIR-A與供體MHCⅠ結(jié)合，均可阻斷記憶反應(yīng)，并減弱腎移植和心臟移植的排斥反應(yīng)。因此，先天性免疫細(xì)胞的同種異體抗原特異性記憶反應(yīng)將是進(jìn)一步改善移植物存活的重要靶點(diǎn)。

2 排斥反應(yīng)和免疫耐受

2.1 CD11b與CD154的相互作用

T細(xì)胞針對(duì)外來(lái)抗原產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答需要2種不同的分子信號(hào)：一是由抗原特異性T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）與抗原提呈細(xì)胞上的MHC-抗原肽復(fù)合物結(jié)合提供的第一信號(hào)；二是由共刺激分子參與傳遞的第二信號(hào)。在已發(fā)現(xiàn)的對(duì)排斥反應(yīng)起關(guān)鍵作用的多種協(xié)同刺激通路中，CD40-CD154是最具特征的信號(hào)通路之一[10]。數(shù)十年來(lái)，阻斷CD40-CD154共刺激通路，被認(rèn)為是抑制T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)的有效方法，可提高小鼠及非人靈長(zhǎng)類(lèi)哺乳動(dòng)物的移植物存活率，但抗CD154單克隆抗體的血栓栓塞并發(fā)癥阻礙了其臨床應(yīng)用，并促使產(chǎn)生靶向CD40的藥物作為替代治療[11]。然而，抗CD40單克隆抗體在提高移植物存活率方面不如抗CD154單克隆抗體，提示CD154可能與另一受體相結(jié)合從而發(fā)揮作用。Liu等[12]研究發(fā)現(xiàn)CD11b很可能擔(dān)當(dāng)了這一重要角色。研究者通過(guò)對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，在野生型和CD40-/-受體小鼠中，使用抗CD154單克隆抗體均可顯著減少移植物CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)，表明CD154的作用不依賴(lài)于CD40。研究者進(jìn)一步使用了一種特定的肽拮抗劑，可以阻斷CD154與CD11b的結(jié)合，但對(duì)CD154和CD40的相互作用沒(méi)有影響。結(jié)果顯示，與單獨(dú)使用抗CD40單克隆抗體相比，阻斷CD154與CD11b的結(jié)合顯著增強(qiáng)了抗CD40單克隆抗體在提高移植物存活率方面的效果，并減少了移植物CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)，其效果與抗CD154單克隆抗體相當(dāng)。這些數(shù)據(jù)表明，CD11b很可能正是CD154的另一受體。因此，了解CD154和CD11b的相互作用及其影響，并進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用，對(duì)改善目前臨床上抗CD40單克隆抗體的治療效果有著非常重要的意義。

2.2 重組促紅細(xì)胞生成素在誘導(dǎo)移植免疫耐受中的作用

在誘導(dǎo)移植免疫耐受的轉(zhuǎn)化研究方面，美國(guó)和德國(guó)的研究者利用靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物進(jìn)行了嘗試。先前的研究表明，使用重組促紅細(xì)胞生成素（recombinant erythropoietin，rEPO）進(jìn)行治療，可以延長(zhǎng)小鼠心臟移植物的存活時(shí)間，其機(jī)制與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）的增殖有關(guān)。Ahrens等[13]首次在MHC完全錯(cuò)配的食蟹猴心臟移植模型中，使用高劑量促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）和抗CD8單克隆抗體治療后，成功誘導(dǎo)免疫耐受。這些數(shù)據(jù)為進(jìn)一步研究EPO和抗CD8單克隆抗體治療對(duì)移植物存活時(shí)間的影響提供了基礎(chǔ)。

3 異種移植

同種移植已經(jīng)在臨床上廣泛應(yīng)用，而目前用于移植的供者器官主要來(lái)源于公民逝世后器官捐獻(xiàn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足終末期器官衰竭患者的需求，而異種移植有望開(kāi)辟新的器官來(lái)源途徑。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，經(jīng)過(guò)多基因編輯的豬有望成為器官供體[14]。器官供體豬的基因改造工程主要涉及2個(gè)方面：（1）敲除豬的3個(gè)關(guān)鍵抗原中的1個(gè)或多個(gè)基因；（2）插入人類(lèi)轉(zhuǎn)基因，以保護(hù)器官免受人類(lèi)補(bǔ)體或凝血活動(dòng)的影響[15]。隨著新技術(shù)的出現(xiàn)（如CRISPR-Cas9），在豬體內(nèi)實(shí)現(xiàn)多基因操作變得越來(lái)越容易，成本也越來(lái)越低，從而加速了該技術(shù)在臨床應(yīng)用方面的進(jìn)展[14]。

本次ATC報(bào)道了一項(xiàng)相關(guān)的最新研究成果，研究者嘗試將經(jīng)過(guò)三基因敲除及插入的基因編輯豬的腎臟移植給食蟹猴，觀察其存活情況。所有供體豬均被敲除三聯(lián)抗原基因，并在3種變異豬體內(nèi)表達(dá)不同水平的人類(lèi)補(bǔ)體、凝血和免疫調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因。移植術(shù)后受體接受單克隆抗體的誘導(dǎo)治療，并使用抗CD154單克隆抗體、嗎替麥考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）、甲潑尼龍和西羅莫司進(jìn)行維持治療。隨后對(duì)受體進(jìn)行臨床隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)項(xiàng)目包括實(shí)驗(yàn)室檢查、超聲檢查和常規(guī)活組織檢查（活檢）等。其中存活時(shí)間最長(zhǎng)的受體在移植術(shù)后237 d活檢時(shí)無(wú)排斥反應(yīng)，而在術(shù)后265 d死于繼發(fā)性難治性貧血[16]。此前報(bào)道的基因編輯豬腎臟移植給靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的異種腎移植受體最長(zhǎng)存活時(shí)間為125 d[17]。通過(guò)敲除異種抗原基因和插入人類(lèi)轉(zhuǎn)基因的基因修飾，異種腎移植受體的存活時(shí)間得到了很大的提高，這為進(jìn)一步的研究和臨床轉(zhuǎn)化帶來(lái)了希望。

4 抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)

在過(guò)去的30年中，免疫抑制劑的使用已顯著降低T細(xì)胞介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率，但移植物的長(zhǎng)期存活改善甚微。研究認(rèn)為，抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)（antibody-mediated rejection，AMR）是晚期移植物丟失的主要原因之一[18]。目前臨床尚無(wú)經(jīng)批準(zhǔn)可明確有效治療AMR的藥物，因此，相關(guān)藥物的研發(fā)和臨床轉(zhuǎn)化顯得尤為迫切。

補(bǔ)體是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和移植物損傷的主要因素，在缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）、移植物功能延遲恢復(fù)（delayed graft function，DGF）及急、慢性AMR的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中尤其重要。C1抑制劑（C1 inhibitor，C1-INH）在發(fā)揮其抑制炎癥和抗移植物損傷作用的同時(shí)，保留了旁路途徑和膜攻擊復(fù)合物（C5-9），因此機(jī)體的天然抗菌防御功能保持不變，保障了機(jī)體安全。來(lái)自動(dòng)物和體外實(shí)驗(yàn)的大量數(shù)據(jù)表明，C1-INH可改善IRI和慢性AMR[19]。為促進(jìn)C1-INH在移植中的臨床轉(zhuǎn)化，來(lái)自美國(guó)和新西蘭的研究者Blanton等[20]通過(guò)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了使用重組人C1-INH（recombinant human C1-INH，rhC1-INH）可有效減少AMR的發(fā)生。研究者通過(guò)使用獼猴腦死亡供體模型發(fā)現(xiàn)，與單純供體或受體治療相比，供、受體接受rhC1-INH的雙重干預(yù)后，受體的腎功能恢復(fù)更快，無(wú)AMR生存率更高。該研究表明，供、受者雙重干預(yù)的rhC1-INH治療方法是預(yù)防腎移植術(shù)后DGF和降低AMR發(fā)生率的一種新策略，有望應(yīng)用于臨床試驗(yàn)。

5 納米醫(yī)學(xué)

納米凝膠是一種納米級(jí)別的聚合物納米顆粒，通過(guò)聚合物鏈交聯(lián)形成三維網(wǎng)絡(luò)，能夠封裝生物活性材料，如低分子量藥物、蛋白質(zhì)、核酸等[21]。在熱、光、酸、堿等外部刺激下，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的改變或凝膠相的轉(zhuǎn)變可以使封裝的材料從納米凝膠中釋放出來(lái)。將蛋白質(zhì)有效地輸送到靶向部位或特定細(xì)胞，長(zhǎng)期控制其釋放，并確保其在體內(nèi)的穩(wěn)定性，這對(duì)于用作治療疾病的蛋白質(zhì)類(lèi)生物制劑來(lái)說(shuō)至關(guān)重要[22]。目前納米凝膠在移植中鮮有應(yīng)用，美國(guó)、英國(guó)和荷蘭的研究者進(jìn)行了白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-2納米凝膠的嘗試[23]。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，體外擴(kuò)增的Treg過(guò)繼輸注在自身免疫和同種免疫方面具有巨大潛力，但Treg療法在臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用上進(jìn)展緩慢，主要原因是Treg的內(nèi)穩(wěn)態(tài)需要持續(xù)的TCR配體和IL-2來(lái)維持。研究者曾嘗試通過(guò)注射低劑量的IL-2來(lái)增加內(nèi)源性Treg的反應(yīng)性，然而全身性應(yīng)用IL-2會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化，從而造成不良后果。通過(guò)利用納米凝膠技術(shù)，研究者構(gòu)建了IL-2納米凝膠工程化Treg，從而維持抗原接觸部位的細(xì)胞數(shù)量。納米凝膠與IL-2形成納米顆粒，可持續(xù)釋放IL-2。IL-2納米凝膠工程化的免疫調(diào)節(jié)性CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞通過(guò)抗原-TCR的相互作用，為T(mén)reg在抗原富集區(qū)（移植物或移植物淋巴結(jié)引流區(qū)）的過(guò)繼輸注提供了細(xì)胞因子所介導(dǎo)的生存環(huán)境。結(jié)果顯示，IL-2納米凝膠工程化的Treg可以大大提高移植物存活率。

6 排斥反應(yīng)的分子學(xué)信號(hào)

6.1 移植腎損傷分子標(biāo)志物

為尋找更加合適的用于評(píng)估移植腎損傷以及預(yù)測(cè)術(shù)后移植物長(zhǎng)期存活的分子標(biāo)志物，歐洲多家中心的研究者對(duì)移植受者單核細(xì)胞源性微小核糖核酸（microRNA，miRNA，miR）進(jìn)行了定量檢測(cè)[24]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)血液中有14種miRNA與AMR相關(guān)，在發(fā)生AMR的受者中表達(dá)下調(diào)；生物統(tǒng)計(jì)分析顯示，3種miRNA（miR-15b、miR-106a、miR-374a）可作為AMR的最佳分子標(biāo)志物；miRNA與臨床生物化學(xué)指標(biāo)相結(jié)合可提高移植腎AMR的診斷準(zhǔn)確性。該研究為miRNA作為移植腎損傷分子標(biāo)志物及其在AMR中發(fā)揮的關(guān)鍵作用提供了新的見(jiàn)解。

6.2 單細(xì)胞RNA測(cè)序評(píng)估移植腎疾病

單細(xì)胞RNA測(cè)序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）是在單細(xì)胞水平對(duì)全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序的一項(xiàng)新技術(shù)[25]。其原理是將分離的單個(gè)細(xì)胞的微量全轉(zhuǎn)錄組RNA進(jìn)行擴(kuò)增后進(jìn)行高通量測(cè)序。scRNA-seq可以識(shí)別罕見(jiàn)細(xì)胞類(lèi)型、新細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞間信號(hào)通路，為復(fù)雜的生物系統(tǒng)提供了新的探索策略，逐漸被應(yīng)用到各種復(fù)雜疾病的研究中[26]。在器官移植中移植物細(xì)胞類(lèi)型多樣，因此scRNA-seq的應(yīng)用尤為必要[27]。

腎移植術(shù)后腎小球疾病的發(fā)生率較高，其發(fā)病機(jī)制目前無(wú)法用免疫機(jī)制解釋。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能與腎小球疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。美國(guó)密歇根大學(xué)的Naik等[28]通過(guò)scRNA-seq評(píng)估移植腎腎小球內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化，以揭示腎小球疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。研究者在活體供腎移植物再灌注前、術(shù)后3個(gè)月及術(shù)后12個(gè)月時(shí)進(jìn)行活檢，并通過(guò)scRNA-seq評(píng)估腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的活化狀態(tài)。差異表達(dá)基因分析顯示，在術(shù)后不同時(shí)間段，與細(xì)胞-細(xì)胞黏附、細(xì)胞-基質(zhì)黏附、血管生成及生長(zhǎng)因子相關(guān)的基因表達(dá)存在差異，這可能會(huì)導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的增殖?？梢?jiàn)，在移植物腎組織尚未出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損傷時(shí)，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)已經(jīng)發(fā)生改變。

7 小 結(jié)

總體而言，移植免疫在腎移植基礎(chǔ)研究中仍然占據(jù)著主導(dǎo)地位，通過(guò)移植模型來(lái)探索免疫新機(jī)制體現(xiàn)了移植研究在人類(lèi)醫(yī)學(xué)發(fā)展中的重要意義，其中對(duì)于免疫記憶的顛覆性發(fā)現(xiàn)更是具有里程碑式的意義。AMR是近幾十年來(lái)一直困擾著移植研究者和臨床醫(yī)師的難題，盡管舉步維艱，但每一點(diǎn)新的突破都值得期待，同時(shí)研究者要拓寬角度、多管齊下，利用新技術(shù)和跨學(xué)科研究突破重圍?；蚓庉嫾夹g(shù)的發(fā)展推動(dòng)異種移植邁進(jìn)了新里程，而如何實(shí)現(xiàn)同種異體移植完全免疫耐受仍需不懈的探索。