屈凌寒 余州 宋保強

癌癥治療技術(shù)的發(fā)展改善了癌癥患者的預(yù)后。自1991年以來，癌癥患者的病死率下降了29%，女性癌癥患者的5年生存率超過64%[1]。然而，化學藥物治療（化療）和放射治療（放療）的不良反應(yīng)可能導(dǎo)致卵巢早衰和不孕。因此，如何保存接受放、化療女性患者的卵巢組織活力和維持卵泡的受精能力已成為生殖領(lǐng)域的研究熱點。隨著卵巢凍存技術(shù)的發(fā)展，自體凍存卵巢組織移植已經(jīng)成為解決這一問題的最佳方案。但移植卵巢組織的活力仍較為有限，探索更加有效的能夠促進自體凍存卵巢組織移植存活的方法具有重要意義，本文就自體凍存卵巢組織移植的研究進展作一綜述。

1 人類自體凍存卵巢組織移植研究的起源和發(fā)展

Donnez等[2]于2004年10月報道了人類第1例自體凍存卵巢組織移植后成功活產(chǎn)的案例。該女性患者為霍奇金淋巴瘤Ⅳ期，在化療開始前進行卵巢皮質(zhì)凍存，在淋巴瘤治療之后，患者出現(xiàn)卵巢早衰。2003年該患者進行了腹腔鏡下自體凍存卵巢組織原位移植，11個月后，患者自然受孕，超聲檢查顯示宮內(nèi)妊娠，最終誕下1名健康女嬰。自體凍存卵巢組織移植已從實驗階段發(fā)展到了臨床應(yīng)用階段，造福了許多年輕的癌癥患者。放療和化療可能造成卵巢早衰，因此越來越多的癌癥患者選擇在放、化療前進行卵巢組織凍存，放、化療結(jié)束之后再進行自體凍存卵巢組織移植。臨床研究表明，自體凍存卵巢組織移植的效果與新鮮卵巢組織移植接近[3]，且沒有排斥反應(yīng)，這進一步推動了自體凍存卵巢組織移植技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。迄今為止，此類手術(shù)在全球范圍內(nèi)已經(jīng)進行了數(shù)百例，妊娠率為30%～50%，活產(chǎn)超過130例[4]。自體凍存卵巢組織移植后出生的新生兒出生缺陷或其他異常情況的發(fā)生率與常規(guī)新生兒相比，差異無統(tǒng)計學意義[5]，表明自體凍存卵巢組織移植是保存女性生育能力的有效手段。

2 影響自體凍存卵巢組織移植存活的因素

雖然在自體凍存卵巢組織移植受者中，術(shù)后95%的受者卵巢功能恢復(fù)，但移植物存活的時間不盡相同。部分受者的卵巢功能可以維持數(shù)年，而有的在術(shù)后幾個月內(nèi)就喪失功能。研究表明，移植物中的卵泡數(shù)量受多種因素影響，包括受者年齡，自然變異，移植前接受放、化療情況以及移植物大小等，且絕大多數(shù)原始卵泡會在卵巢組織凍存和移植過程中丟失[5]。而最終決定移植物壽命的是移植卵巢組織中存活下來的原始卵泡的數(shù)量。因此，如何最大限度地保證移植物中卵泡存活一直是人們研究的重點。

2.1 冷凍方法和冷凍保護劑

玻璃化冷凍和程序化慢速冷凍是卵巢凍存的常用方法，其中程序化慢速冷凍使用更廣泛[6]。目前報道的自體凍存卵巢組織移植后活產(chǎn)病例，絕大部分采用的是程序化慢速冷凍法，僅2例是玻璃化冷凍[7]。程序化慢速冷凍采用低濃度冷凍保護劑，可降低細胞毒性，但冷凍過程容易產(chǎn)生冰晶，造成細胞損傷，且步驟繁瑣、耗時較長、所需設(shè)備昂貴。玻璃化冷凍是一種快速降溫的方法，使細胞內(nèi)外液態(tài)直接轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷w的玻璃化態(tài)，此過程可減少細胞內(nèi)外冰晶形成，且不需要使用特殊的設(shè)備，節(jié)省時間和成本，但需要使用高濃度的冷凍保護劑，對細胞的毒性較大。有研究發(fā)現(xiàn)，與程序化慢速冷凍法相比，玻璃化冷凍的健康卵泡與原始卵泡的密度之比較高，原始卵泡的DNA鏈斷裂減少，能更好地保存基質(zhì)細胞，有效地保存卵巢組織和改善移植卵巢組織的功能[8]。由于卵泡存活率高且受損卵泡較少，玻璃化冷凍被認為是凍存卵巢組織最有效的方法。但由于目前臨床數(shù)據(jù)較少，玻璃化冷凍的臨床意義尚無法估計，還需要開展更多臨床研究確定其安全性和有效性。

冷凍保護劑的選擇也是決定低溫保存成功與否的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)使用乙二醇、丙二醇或二甲基亞砜凍存和解凍的生殖細胞存活率高，組織形態(tài)完整，細胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)良好，而甘油的保存效果較差[9]。二甲基亞砜是目前國際上最常用和最成熟的卵巢組織冷凍保護劑。

2.2 移植部位

卵巢組織一般是通過腹腔鏡手術(shù)進行原位移植，移植部位包括卵巢、卵巢窩和闊韌帶。與異位移植相比，原位移植可維持自然妊娠的能力。全球報道的大多數(shù)活產(chǎn)病例均來自原位移植的卵巢組織[10]。von Wol ff等[11]提出了卵巢旁腹膜、卵巢內(nèi)和卵巢上3個原位移植部位，其中卵巢上移植需要專業(yè)的腹腔鏡顯微外科技術(shù)才能在1～2 h內(nèi)完成手術(shù)。

據(jù)報道，異位移植會產(chǎn)生大量空卵泡，卵泡發(fā)育受阻，卵母細胞回收率低，受精率低，可能受環(huán)境溫度、局部壓力、旁分泌因子和血液供應(yīng)等因素的影響[12]。截止至2019年的文獻報道，僅有2例異位移植后活產(chǎn)，1例移植到腹壁，另1例移植到骨盆[6]。且異位移植后期還需回收卵子進行體外受精和胚胎移植，過程比較繁瑣，成本更高。有動物實驗比較了原位移植和不同部位異位移植的效果，包括肌肉、脂肪墊、腎包膜和皮下組織，其結(jié)果一致表明，原位移植可保留較高比例的原始卵泡，成功率更高[13]，與其他研究中心的臨床結(jié)果相一致[14-15]。

2.3 移植物大小

移植物大小會影響卵泡丟失情況。冷凍前將卵巢皮質(zhì)塊切割為薄的條塊，可以使低溫保護劑更好地滲透和排出，減少冰晶形成和細胞損傷，并為新生血管提供較短的穿過距離，縮短缺血期。通常，卵巢皮質(zhì)被制備成1～2 mm厚的條塊狀組織進行移植。然而，就氧氣擴散而言，擴散距離>0.2 mm就會受限，而生長因子和營養(yǎng)素等較大分子的擴散距離則更短。因此，人們推測減少移植物的大小和厚度可以促進移植物的血管形成，減少缺血和缺氧。有研究者嘗試制造更薄的移植物“微器官”，以進一步縮短營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣擴散距離。然而，一項異種移植研究比較了移植卵巢大小對移植卵巢血管形成的影響，發(fā)現(xiàn)減小移植卵巢不僅不會促進移植卵巢的血運重建，還會增加卵泡激活，導(dǎo)致休眠卵泡的損失增加，可能原因是組織的切割破壞了Hippo通路，觸發(fā)了卵泡的生長[16]。

有研究者探索了帶血管吻合的凍存全卵巢移植，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種方法可以立即重建卵巢皮質(zhì)血運，并降低缺血性損傷的發(fā)生率[17]。但凍存一個大且完整的卵巢較為困難，因為冷凍保護劑很難充分擴散到大的組織塊，且血管內(nèi)冰晶的形成易造成血管損傷。但在動物實驗中，也有自體凍存全卵巢移植的報道。Campbell等[18]采用優(yōu)化的凍存技術(shù)和術(shù)后抗凝治療方法對成年綿羊進行了自體凍存全卵巢移植，術(shù)后卵巢功能完全恢復(fù)，自然受孕率高且多胎活產(chǎn)。Martinez-Madrid等[17]將完整的帶血管蒂的人類卵巢在冷凍容器內(nèi)的低溫保護液中進行緩慢冷凍，解凍后卵泡和小血管的存活率為75%。雖然綿羊自體凍存全卵巢移植后能產(chǎn)下健康的后代，但人類自體凍存全卵巢移植至今尚未出現(xiàn)活產(chǎn)。改善冷凍條件、優(yōu)化冷凍保護劑及提高微血管吻合技術(shù)可能使自體凍存全卵巢移植成為保存生育能力的一種手段。

3 促進自體凍存卵巢組織移植存活的方法

3.1 生長因子

自體凍存卵巢組織移植后，血運重建延遲引起的缺氧是導(dǎo)致卵泡過早衰竭的主要原因。卵巢皮質(zhì)片的移植沒有血管吻合，因此移植物的存活取決于血運重建。卵巢組織移植后的血運重建在嚙齒類動物中需要48 h，在人類中長達5 d[6]。多種生長因子可以促進移植卵巢組織新生血管的形成，目前研究比較多的包括堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）等。

3.1.1 堿性成纖維細胞生長因子 bFGF能促進血管生成和卵泡存活。將bFGF混合到小鼠和人類的自體凍存卵巢組織進行移植，可以顯著增加卵巢組織CD31陽性區(qū)域，并促進基質(zhì)細胞和血管內(nèi)皮細胞的增殖，降低移植卵巢組織的纖維化，使原始卵泡和初級卵泡密度顯著增加[19]。

3.1.2 血管內(nèi)皮生長因子 VEGF可促進移植卵巢組織的血管生成。自體凍存卵巢組織移植后，移植物的缺氧微環(huán)境會引起VEGF表達上調(diào)。但在靈長類動物的移植卵巢組織內(nèi)注射VEGF或外源性促性腺激素后，不能有效改善移植卵巢組織的功能和卵泡存活率。但也有研究發(fā)現(xiàn)，從生物材料中控制釋放的VEGF可有效促進血管生成。由于移植部位和移植物之間缺乏物理連接，限制了細胞浸潤和旁分泌通訊，研究人員用含有纖維蛋白-肝素結(jié)合肽（heparin-binding peptide，HBP）-VEGF的水凝膠包埋自體凍存卵巢組織進行移植，并進行卵泡計數(shù)和血管密度測量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF可以促進血管生成和原始卵泡存活[20]。

3.1.3 促紅細胞生成素 EPO可促進紅系祖細胞的分化和增殖，并防止細胞凋亡，提高移植組織的存活率。Suzuki等[21]將凍存的犬卵巢組織與EPO或去唾液酸EPO移植到免疫缺陷小鼠的卵巢囊，4周后取出卵巢進行組織學檢查，發(fā)現(xiàn)早期初級卵泡的存活率存在較大差異，EPO組為15.2%，去唾液酸EPO組為157.6%，而未治療組則僅為10.1%。表明使用去唾液酸EPO可以有效地提高凍存卵巢組織的卵泡存活率。且去唾液酸EPO組移植物中的初級卵泡數(shù)量增多，表明去唾液酸EPO可促進原始卵泡生長。目前尚不清楚去唾液酸EPO如何促進卵泡細胞的分化和增殖。但已有研究表明，女性生殖器官或組織（包括卵泡）在不同時期均表達EPO受體，EPO的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與了女性生殖器官的周期性變化，且去唾液酸EPO可有效預(yù)防凍存卵巢組織移植后卵泡丟失。

3.2 激 素

在自體凍存卵巢組織移植過程中，某些激素也可以發(fā)揮很好的保護作用。目前研究較多的是促性腺激素、雄激素和抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）。

3.2.1 促性腺激素 在移植前用卵泡刺激素（folliclestimulating hormone，F(xiàn)SH）培養(yǎng)卵巢組織，可增加移植后卵巢組織VEGF和bFGF的表達及血管密度[22]，其最佳使用條件為：用0.30 IU/mL的FSH干預(yù)自體凍存卵巢組織6 h，可加速移植卵巢組織的血運重建，且不會對卵巢產(chǎn)生過度刺激。用含有人絕經(jīng)期促性腺激素（human menopausal gonadotropin，HMG）的培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠卵巢組織并將其移植到小鼠腎包膜，結(jié)果顯示卵巢組織移植后VEGF表達增強，卵泡存活率提高[22]。黃體生成素（luteinizing hormone，LH）在自體凍存卵巢組織移植中也可促進正常卵泡的生成，并上調(diào)玻璃化凍存卵巢組織中VEGF、連接素Cx37和Cx43的表達，促進卵巢組織的存活，并維持其功能，縮短小鼠的發(fā)情周期，且妊娠率和第一胎產(chǎn)仔數(shù)均正常[23]。然而促性腺激素在促進移植卵巢組織中卵母細胞發(fā)育和成熟的同時，也會造成原始卵泡的丟失，縮短移植物的存活時間[22]。

3.2.2 雄激素 研究表明，雄性小鼠的激素環(huán)境可以支持移植卵巢中卵母細胞生長，并產(chǎn)生活的后代，因而雄激素也被認為是改善自體凍存卵巢組織移植存活的因素[20]。在異種移植模型中，將人類卵巢組織異種移植到雄性小鼠體內(nèi)，可以觀察到形態(tài)正常的卵泡，在HMG刺激后，會產(chǎn)生更多的竇前卵泡和竇卵泡[24]。此外，將人類和小鼠的卵巢組織異種移植到雄性嚙齒類動物，可以產(chǎn)生比雌性受體更多的卵母細胞，表明雄性受體可能是提高移植卵巢組織中卵母細胞產(chǎn)量的較好模型[24]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，在雄性受體中生長的小鼠卵母細胞可以受精，并發(fā)育成活幼仔，說明雄性小鼠的激素環(huán)境可以支持同種異體移植卵巢組織中卵母細胞的生長[25]。而雄激素在人類自體凍存卵巢組織移植中的作用，還有待進一步的研究。

3.2.3 抗苗勒管激素 AMH是轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β超家族的成員之一，也可改善自體凍存卵巢組織移植存活。AMH具有抑制卵泡激活的作用，而卵泡激活是移植卵巢中原始卵泡耗竭的重要原因[26-27]。研究發(fā)現(xiàn)，AMH在生長卵泡中高表達，AMH基因敲除小鼠的卵巢卵泡活動增強，原始卵泡儲備加速消耗，表明AMH可以抑制原始卵泡的激活[28]。而后續(xù)的綿羊模型研究發(fā)現(xiàn)，AMH不影響原始卵泡的動員，但可調(diào)節(jié)早期卵泡發(fā)育的速度[29]。AMH可能在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮多種作用，單排卵和多排卵物種之間AMH的功能可能存在差異，但抑制卵泡活動和減緩早期卵泡生長速度，可能會提高自體凍存卵巢組織移植后的卵泡產(chǎn)量。在實際應(yīng)用中，將AMH與細胞治療聯(lián)合用于卵巢組織移植，既能增加血管生成，又能減少卵泡激活，這種聯(lián)合方案顯示了良好的卵泡儲備保護功能[30]。

3.3 抗凋亡藥物

卵巢玻璃化冷凍和移植過程中原始卵泡丟失的機制尚不完全清楚。有研究表明，卵泡的死亡和丟失可能主要是由細胞凋亡引起[20]。因此，抗凋亡藥物如Kit配體、鞘氨醇-1-磷酸（sphingominol 1 phosphate,S1P）等被用于保護卵泡的存活，但抗凋亡藥物的作用有限，僅能減少部分卵泡的損失。Yang等[31]認為凋亡不是唯一的途徑，自噬（Ⅱ型程序性細胞死亡）在卵巢玻璃化冷凍和移植中也具有重要作用。另有研究表明，小鼠自體凍存卵巢組織移植過程中存在焦亡，抑制焦亡可提高移植物中原始卵泡、竇狀卵泡的密度以及雌二醇濃度，因此抑制焦亡可能會降低卵泡的激活和衰竭，從而改善移植卵巢組織的功能[32]。卵巢玻璃化冷凍和移植過程中原始卵泡丟失可能是多種機制共同作用的結(jié)果，但目前研究較多的仍是細胞凋亡。

3.3.1 Kit配體 Kit配體由顆粒細胞分泌，也稱為干細胞因子、Steel因子或肥大細胞生長因子，參與原始卵泡的激活、卵母細胞的生長以及顆粒細胞和卵泡膜細胞的增殖。其受體位于小鼠、大鼠和人類產(chǎn)后卵母細胞和卵泡膜細胞表面，并刺激原始卵泡激活。Kit配體也可以作為一種生存因子，有效地促進卵泡的存活，減少細胞凋亡。Jin等[33]發(fā)現(xiàn)，使用Kit配體處理大鼠卵巢可顯著減少凋亡卵母細胞的數(shù)量。這種抗凋亡作用可能是通過磷酸酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）途徑介導(dǎo)的，它抑制了Fas介導(dǎo)的細胞凋亡。Liu等[34]證明Kit配體可下調(diào)新生大鼠卵巢原始卵泡和卵母細胞中p27 KIP1和促凋亡因子（如Bim、Bad和Bax）的表達，表明Kit配體對促進卵泡細胞存活和減少竇前卵泡凋亡至關(guān)重要[35]。

3.3.2 鞘氨醇-1-磷酸 S1P是G蛋白偶聯(lián)受體家族的配體，是一種凋亡抑制因子。早期研究證明，S1P可抑制化療和放療引起的細胞凋亡[36]。研究人員發(fā)現(xiàn)，在人類卵巢組織異種移植模型中，S1P可增加血管密度，加速血管生成并可促使卵巢間質(zhì)細胞顯著增殖，減少組織缺氧和壞死，降低卵泡的凋亡率[37]。在玻璃化冷凍卵巢組織的過程中，將S1P加入到玻璃化冷凍液中可防止原始卵泡池的凋亡。

3.4 缺血-再灌注損傷中的保護

凍存卵巢組織移植中無血管吻合，因而血運重建的時間會對移植物中卵泡的存活和功能產(chǎn)生重要影響。移植物在新生血管形成后會發(fā)生缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI），在移植后的最初3日表現(xiàn)最為明顯，IRI過程會產(chǎn)生大量活性氧物質(zhì)，導(dǎo)致細胞損傷和線粒體功能下降，造成大多數(shù)原始卵泡死亡，Caspase-1是介導(dǎo)這一過程的酶[38]。近年來研究人員發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化的冷凍保護劑灌注比浸泡在冷凍保護劑中冷凍保存全卵巢更有效[39]；冷藏后低溫機械灌注對卵巢運輸過程中的短期保存效果優(yōu)于單純冷藏[40]。低溫機械灌注可清除微血栓和代謝產(chǎn)物，改善內(nèi)皮細胞和實質(zhì)細胞的微環(huán)境，防止三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的耗竭和線粒體水腫[33]。

此外，內(nèi)源性抗氧化因子可中和缺血應(yīng)激期間產(chǎn)生過量的氧自由基，外源性抗氧化劑，如維生素E、褪黑素等可能有助于提高卵巢組織移植后卵泡存活率。但抗氧化劑對卵巢組織移植的作用有限，且存在很大爭議[20]。研究發(fā)現(xiàn)，維拉帕米可有效保存卵泡池，減輕小鼠卵巢組織移植引起的IRI，但其作用機制尚不清楚[41]。

3.5 細胞聯(lián)合移植

與干細胞或其他類型細胞的聯(lián)合移植也是改善自體凍存卵巢組織移植存活的新途徑，尤其是間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）、脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cell，ADSC）和外源性內(nèi)皮細胞。

3.5.1 間充質(zhì)干細胞 MSC可分化為內(nèi)皮細胞和周細胞，從而提供穩(wěn)定新生血管所必需的細胞成分。在異種移植模型中已經(jīng)觀察到，與MSC聯(lián)合移植可促進卵巢組織的血管生成[20]。MSC在低溫卵巢組織中可以提高VEGF和bFGF的表達水平，尤其是血管生成素的表達水平，顯著刺激新生血管形成，增加移植物的血液灌注[20]。研究表明，MSC可通過分泌胰島素樣生長因子1、白細胞介素（interleukin，IL）-6、VEGF-A、肝細胞生長因子和TGF-β，并抑制腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α和Bcl-2等炎癥因子的表達來發(fā)揮抗凋亡作用，降低移植卵巢組織中原始卵泡的凋亡率，減少卵泡損失[42]。

3.5.2 脂肪來源干細胞 由于ADSC具有刺激血管生長的能力，被認為是缺血性疾病細胞治療的有效方案。ADSC可產(chǎn)生多種促血管生成因子和抗凋亡因子，且缺氧處理的ADSC在體內(nèi)可以促進血管生成和新生血管的成熟[43]。有研究表明，卵巢組織聯(lián)合ADSC移植可以促進術(shù)后早期血管形成（高氧分壓和CD34表達），提高卵泡存活率，減少細胞凋亡[44-46]。

3.5.3 外源性內(nèi)皮細胞 外源性內(nèi)皮細胞聯(lián)合移植對人類卵巢組織的卵泡存活和功能恢復(fù)具有重要作用。由于卵巢組織移植沒有進行血管吻合，容易導(dǎo)致缺血損傷和移植物內(nèi)卵泡過早激活。而外源性內(nèi)皮細胞能夠在移植部位和移植物間形成功能性灌注血管，提高移植物中卵泡存活率和卵泡體積，并促進竇性卵泡發(fā)育。且重組表達AMH的外源性內(nèi)皮細胞可抑制原始卵泡的激活，促進其功能保存[28]，還可加快組織的血運重建，并可挽救卵巢移植物中的大量卵泡[24]。

4 結(jié) 語

自體凍存卵巢組織移植作為一種保存生育能力的技術(shù)，造福了越來越多的年輕癌癥患者，世界各地以這種方式出生的嬰兒逐年增多。如何促進自體卵巢組織移植存活仍是目前的研究熱點。改進卵巢凍存液配方、優(yōu)化凍存和復(fù)蘇流程以及聯(lián)合移植可能成為未來的發(fā)展方向。因此需要世界各國專家的共同努力，建立一套自體凍存卵巢組織移植標準方案，推動基于自體凍存卵巢組織移植的輔助生殖技術(shù)的進步。