齊小浪，杜 娟，李尚偉

(貴州大學昆蟲研究所貴州山地農業(yè)病蟲害重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

【研究意義】抗菌肽被認為是一類有望成為抗生素替代品的新型抗生藥物，抗菌肽類抗生素的基礎研究和應用治療研究成為新型抗菌藥物開發(fā)研究的熱點。與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽擁有高度模塊化的合成抗菌系統(tǒng)，其小分子多肽對大量病原體的作用是快速和致命的，抗菌肽必須穿透靶細胞才能發(fā)揮殺死靶細胞的作用，這種作用模式能有效降低微生物的抗性[1-2]。因此，抗菌肽是一種非常有希望解決多重耐藥性的新型替代藥物?！厩叭搜芯窟M展】多細胞生物常遇到病原生物的侵染，昆蟲作為地球上數(shù)量和種類最龐大的生物種群，其擁有強大的抗感染手段，如吞噬細菌和包裹寄生蟲的能力，這些反應包括激活胞外蛋白酶級聯(lián)、黑化和凝固以及誘導抗菌肽基因表達[3-4]。昆蟲免疫反應的一個主要方面是感染后快速產生昆蟲防衛(wèi)素等抗菌肽。昆蟲防衛(wèi)素是昆蟲在受到意外傷害和病原微生物入侵時在昆蟲脂肪體及血淋巴中產生的一種天然免疫多肽[5]，其在昆蟲綱中皆廣泛分布，也存在于其它節(jié)肢動物如蝎子(Buthuseqeus)中，在昆蟲免疫防護的過程中扮演著重要的角色。分離于麻蠅(Sarcophagaperegina)幼蟲和麗蠅(Phormiaterranorae)的2個抗革蘭氏陽性菌(Gram-positive bacteria，G+)抗菌肽是最早分離出來的昆蟲防衛(wèi)素，因與哺乳動物體內由粒性白細胞產生的的一組堿性抗菌肽防衛(wèi)素序列相似而命名[6]。昆蟲防衛(wèi)素主要抗G+,偶爾也有抗革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria,G-)或真菌的報道，但G-通?？衫闷渫饽さ挚估ハx防衛(wèi)素而對其有抗性。麗蠅防衛(wèi)素能打破藤黃微球菌(Micrococcusluteus)質膜滲透性屏障，引起胞質內K+和 ATP 下降，以及質膜部分剝離和細胞呼吸受阻,這些現(xiàn)象與防衛(wèi)素引起質膜脂質體內形成通道有關[7]。病原微生物的浸染誘導昆蟲防衛(wèi)素的表達，昆蟲防衛(wèi)素的構效關系還不清楚，但通常認為6個半胱氨酸殘基組成的3個分子內二硫鍵和富含精氨酸是其生物活性所必需的[8]。九香蟲Coridiuschinensis為半翅目兜蝽科昆蟲，以葫蘆科植物汁液為食在全國大部分地區(qū)均有分布，主要分布于我國的沿海、中部及西南地區(qū)[9]，為藥食兩用昆蟲，具有極大的開發(fā)利用價值[10-11]。九香蟲具有較強的免疫防護手段，其在野外被外源異物侵染死亡的情況較為罕見，具有較為完善的免疫系統(tǒng)。吳瑪莉[12]通過凝膠過濾法從九香蟲血淋巴里分離得到的低分子量蛋白對G+和G-都有抑制作用。李尚偉等[13]通過質譜法從九香蟲血淋巴分離得10條小分子多肽，CcAMP1對G+及G-均具有明顯的抑菌作用。【本研究切入點】關于九香蟲中防衛(wèi)素基因在表達水平的研究較少，因此利用反轉錄PCR(Reverse transcription PCR,RT-PCR)克隆九香蟲防衛(wèi)素CcDef3基因的cDNA序列，并利用生物信息學軟件和方法對其進行特征分析。利用實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)分析其時空表達及細菌對誘導的作用。【擬解決的關鍵問題】檢測克隆的九香蟲防衛(wèi)素CcDef3時空表達模式和九香蟲被細菌誘導后表達水平的變化，揭示九香蟲防衛(wèi)素基因CcDef3的調控規(guī)律，為深入探究九香蟲體內防衛(wèi)素的互作關系提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

九香蟲成蟲采集于貴州省貴陽市花溪區(qū)，以人工種植的南瓜稈莖飼喂于人工氣候箱內，飼養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，濕度(68±5)%，光周期14 L (Light)：10 D (Dark)。不同發(fā)育時期的樣品取自子1代的卵、1～5齡若蟲和雌雄成蟲；不同組織樣品取自子1代成蟲的頭部、肌肉、體壁、脂肪體、血淋巴、精巢和卵巢。樣本保存在RNAlater(Qiagen,Duesseldorf,Germany)中，貯存于-20 ℃冰箱。

1.2 細菌誘導

將金黃色葡萄球菌[Staphylocousaureus(ATCC 25923)]和大腸桿菌[Escherichiacoli(ATCC 25923)]等體積混合后，使用微量注射器將10 μL混合菌液注入子1代九香蟲成蟲體內，分別在不同的時間(6、12、24、36和48 h)取浸染后未死亡的蟲體，用無菌剪刀取其腹部,樣本保存在RNAlater(Qiagen,Duesseldorf,Germany)中，貯存于-20 ℃冰箱。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

根據(jù)HP Total RNA Kit(Omega Bio-Tek,GA,USA)說明書提取總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量，使用NanoDrop 2000紫外分光光度計(Thermo Fisher,MA,USA)檢測所提取總RNA的純度和濃度，檢測合格的RNA于-80 ℃保存?zhèn)溆?。第一鏈cDNA的制備根據(jù)RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher,MA,USA)說明書進行，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 九香蟲CcDef3基因克隆

基于九香蟲轉錄組數(shù)據(jù)，利用相關的生物信息學方法并根據(jù)昆蟲防衛(wèi)素的結構特征篩選到1條九香蟲防衛(wèi)素基因。使用NCBI的Primer-BLAST設計特異性引物，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成(表1)。在T100 PCR儀(Bio-Rad,CA,USA)上進行目的基因的擴增。反應體系為50 μL:25 μL 2×TsingKe Master Mix(北京擎科生物公司)，2 μL cDNA模板，上、下游引物(10 μM)各1 μL，補加21 μL滅菌超純水。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產物經電泳檢測后，回收純化目的基因，連接到pMD18-T載體并轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取重組子進行菌落PCR鑒定，送陽性克隆至生工生物工程(上海)有限公司進行測序，將克隆測出的序列和數(shù)據(jù)庫中序列進行比對驗證。

表1 九香蟲防衛(wèi)素基因CcDef3克隆與表達分析的引物信息

1.5 CcDef3基因的生物信息學分析

CcDef3基因的編碼區(qū)用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/ )進行預測，采用SignalP 4.1 Server (http:www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信號肽及前肽，用ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/) 對編碼的蛋白質進行分子量和等電點預測。用NetOGlyc 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)和NetNGlyc1.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預測糖基化位，DiANNA 1.1 web server(http://clavius.bc.edu/～clotelab/DiANNA/)預測二硫鍵，用KinasePhos(http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/)預測磷酸化位點。PSORT II Prediction(https://psort.hgc.jp/form2.html)進行亞細胞定位預測，用DNAMAN 9.0(Lynnon Biosoft,CA,USA)將CcDef3氨基酸序列同20種防衛(wèi)素氨基酸序列進行比對；并使用MEGA-X構建CcDef3與20種其它昆蟲防衛(wèi)素的進化樹。表2為氨基酸序列比對和構建進化樹的防衛(wèi)素來源物種和GenBank登錄號。使用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)的同源建模方法預測成熟CcDef3的三維結構，用PyMOL 1.4繪制其分子結構圖。

1.6 基因表達模式解析

用C1000 Thermal Cycler(Bio-Rad,CA,USA)進行RT-qPCR檢測CcDef3基因的時空表達模式及誘導后的響應模式。RT-qPCR反應按照2×SYBR Select Master Mix(Thermo Fisher,MA,USA)說明書進行，反應體系為10 μL:1 μL第1鏈 cDNA，上、下游引物(表1)各0.5 μL，5 μL 2×SYBR Select Master Mix,3 μL無RNA酶的無菌去離子水。反應程序：50 ℃ 120 s；95 ℃預變性120 s；95 ℃變性15 s,58 ℃退火15 s,72 ℃延伸60 s,40 cycles。以九香蟲β-actin基因(注冊號：MK370101)作內參對照，每個樣本重復進行3次實驗。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用2-ΔΔCt法[14]計算CcDef3的相對表達量，用SPSS 22進行方差分析(ANOVA)，用鄧肯氏新復極差法(Duncan’s test)進行多重檢驗，顯著性水平為P<0.05，用Sigma Plot 12.5 繪圖。

2 結果與分析

2.1 CcDef3的cDNA克隆

經RT-PCR得CcDef3基因的cDNA序列(GenBank登錄號：MN563605)長522 bp(圖1)，5′端非編碼區(qū)為53 個核苷酸(Nucleotident,nt)，編碼區(qū)為351 nt，3′端非編碼區(qū)為424 nt。

2.2 CcDef3的特征分析

九香蟲防衛(wèi)素CcDef3包含1個信號肽、2個前體肽和1個成熟肽段，N端信號肽具17個氨基酸(Amino acid,aa)，前體肽分別由1個30 aa及1個26 aa的肽段組成，因此CcDef3具2個切割位點(R47↓T48，R73↓A74)，其C端成熟肽包含43個氨基酸殘基(圖2)。

理化性質分析表明，CcDef3的分子式為C198H320N61O57S6，分子量為4684.47 Da，理論等電點為9.13，含有1個酸性氨基酸(D)及6個堿性氨基酸(4個K、2個R)，成熟肽靜電荷數(shù)為+5。脂肪族氨基酸指數(shù)為63.72，親水性平均系數(shù)為-0.095，表明CcDef3親水性氨基酸殘基數(shù)大于疏水性殘基數(shù)，為親水性蛋白。修飾結構分析顯示該肽既沒N-糖基化位點和O-糖基化位點，也沒磷酸化位點。保守結構域和功能結構域分析顯示，CcDef3屬于昆蟲防衛(wèi)素家族，具有蝎子毒素及無脊椎動物防衛(wèi)素相同的功能結構域，參與免疫防御反應。

表2 用于多序列對齊和聚類分析的防衛(wèi)素物種

A:九香蟲總RNA；B:CcDef3基因擴增。M:DL2000 DNA marker;1:CcDef3 基因A:Total RNA；B:CcDef3 gene amplification;M:DL2000 DNA marker;1：CcDef3 gene圖1 九香蟲防衛(wèi)素CcDef3基因的電泳圖Fig.1 Electropherogram of CcDef3 gene

通過同源建模方式構建的CcDef3三維分子(圖3)顯示，1個α-螺旋，2個β-折疊片以及4個無規(guī)卷曲形成其高級結構，并用3個二硫鍵(C76-C107,C93-C112和C97-C114)穩(wěn)定其構象。

2.3 同源性和聚類分析

將CcDef3的氨基酸序列在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫里進行在線比對結果顯示，該防衛(wèi)素與來自紅尾碧蝽(P.prasina)的防衛(wèi)素氨基酸序列相似性高達74.42%。將CcDef3同21個源于昆蟲的防衛(wèi)素氨基酸序列比對結果(圖4)發(fā)現(xiàn)，其都具有保守的6個半胱氨酸(Cysteine，C)位點及連續(xù)的甘氨酸(Glycine，G)位點，此2種保守位點是維持昆蟲防衛(wèi)素活性所必需的結構。系統(tǒng)進化樹(圖5)顯示，CcDef3與紅尾碧蝽及茶翅蝽防衛(wèi)素聚為一支，再與同屬半翅目的10種蝽類防衛(wèi)素聚為一支；3種螞蟻防衛(wèi)素與同屬膜翅目的蜜蜂防衛(wèi)素聚為一支；再與2種虱目防衛(wèi)素聚為一支。同源性與聚類分析表明，九香蟲防衛(wèi)素與紅尾碧蝽防衛(wèi)素的親緣關系最近。

2.4 CcDef3基因表達模式

RT-qPCR分析結果表明，CcDef3基因在各個發(fā)育時期皆有不同程度的表達，其中在5齡若蟲中的表達水平最高且顯著高于其他齡期，分別為卵及3齡若蟲的76.44和4.47倍(圖6)。CcDef3在各個檢測組織內都有不同水平的表達，但表達水平最高的組織為脂肪體，血淋巴次之，其它組織內的表達水平都相對較低，脂肪體內的表達水平是血淋巴及肌肉中的8.89和219.90倍之多(圖7 )。用細菌注射誘導九香蟲成蟲，CcDef3的表達水平上調至12 h時達到最高水平，而后下調至48 h時趨向于誘導前的水平，在12 h時表達水平分別是感染前和6 h時的153.24和11.91倍(圖8)。

成熟肽序列用黑色下劃線表示，“*”表示終止密碼子，↓表示切割位點The mature peptide sequence is marked by a black underline,the asterisk shows stop codon,↓ indicates cleavage site圖2 九香蟲防衛(wèi)素基因CcDef3的核苷酸及推導的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of CcDef3 from C.chinensis

圖根據(jù)CcDef3.pdb數(shù)據(jù)用PyMOL 1.4產生，C76-C107,C93-C112和C97-C114表示二硫鍵This figure is generated with PyMOL 1.4 based on CcDef3.pdb data,C76-C107,C93-C112 and C97-C114 indicates disulfide bonds圖3 成熟CcDef3的三維分子結構Fig.3 Three-dimensional molecular structure of mature CcDef3

3 討 論

昆蟲防衛(wèi)素是昆蟲抗菌肽中數(shù)量較為龐大的一個家族，具有較好的抗G+活性，但而抗G-及真菌的活性較低，迄今為止大多數(shù)從昆蟲中分離和鑒定的防衛(wèi)素都是陽離子多肽。目前關于半翅目昆蟲防衛(wèi)素的研究較少。研究克隆了九香蟲防衛(wèi)素CcDef3的cDNA序列并測序驗證，其成熟肽具有同昆蟲防衛(wèi)素的序列特征和結構特點。防衛(wèi)素的分子結構特征與其功能以及活性有著密切的聯(lián)系，如帶正電荷的防衛(wèi)素與帶負電荷的微生物膜成分通過正負電荷間的結合從而發(fā)揮其抗菌作用[15]；6個半胱氨酸保守位點形成的3個二硫鍵和防衛(wèi)素典型的半胱氨酸穩(wěn)定的αβ-基序(cysteine-stabilized α β motif,CS α β motif)是其重要的空間結構，對發(fā)揮防衛(wèi)素抗菌活性具有極其重要的作用[16-17]。從九香蟲中克隆得到的防衛(wèi)素CcDef3具有同樣的序列特征及分子結構，成熟的CcDef3為陽離子多肽，含5個凈正電荷，具有6個半胱氨酸殘基形成的3個二硫鍵，CcDef3包含了一個基序：C-X16-C-X3-C-X9-C-X4-C-X1-C，與昆蟲防衛(wèi)素的基序(C-X5-16-C-X3-C-X9-11-C-X4-7-C-X1-C)一致[18]。二級結構預測及同源建模結果顯示其具有1個α螺旋及2個β折疊及4個無規(guī)則卷曲，2個β-sheets，α螺旋與C端loop之間由3個二硫鍵連接并維持其立體上的穩(wěn)定性，一般認為α螺旋及β折疊是防衛(wèi)素發(fā)揮其抗菌活性的功能結構[19]。這些序列及結構特征上的相似性揭示了九香蟲防衛(wèi)素CcDef3具有同其它昆蟲防衛(wèi)素一樣的生物功能。昆蟲防衛(wèi)素的半胱氨酸穩(wěn)定CSαβ基序由基因復制進化而來，隨后由于選擇性進化壓力而發(fā)散，從而產生一系列不同的副類似物[20]。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，CcDef3與其它半翅目防衛(wèi)素形成一個獨特的進化支，膜翅目防衛(wèi)素與虱目防衛(wèi)素形成一個分支。

共有的殘基用星號和黑框表示，強相似的殘基用“：”表示，弱相似殘基用“.”表示Identical residues are indicated by asterisks and black boxes,strongly similar residues are indicated by ‘:’,and weakly similar residues are indicated by ‘.’圖4 CcDef3與其它20種昆蟲防衛(wèi)素氨基酸序列比對Fig.4 Alignment of amino acid sequences of CcDef3 and 20 other insect defensins

用MEGA-X構建昆蟲防衛(wèi)素的鄰接樹，重復運行1 000次，節(jié)點上的數(shù)值表示自舉檢驗值。九香蟲防衛(wèi)素用黑三角形標記MEGA-X was used to construct the phylogenetic tree based on amino acid sequences of known insect defensins with Neighbor-Joining method (NJ).One thousand replications were performed and bootstrap confidence values are shown at the nodes.Defensin from C.chinensis is marked with a back triangle圖5 根據(jù)已知的昆蟲防衛(wèi)素構建的聚類進化樹Fig.5 The phylogenetic tree based on known insect defensins

E為卵，N1～N5為1～5齡若蟲，F(xiàn)為雌成蟲，M為雄成蟲；不同小寫字母表示差異顯著(P < 0.05)，下同E:Egg;N1-N5:1st-5th-instar nymphs;F:female;M:male.Different letters above the bars indicate significant differences (P < 0.05).The same as below圖6 九香蟲不同發(fā)育時期CcDef3的相對表達量Fig.6 Relative expression level of CcDef3 at various developmental stages of C.chinensis

FB、Ha、Ov、BW、Te、He與Mu分別表示脂肪體、血淋巴、卵巢、體壁、精巢、頭部及肌肉FB,Ha,Ov,BW,Te,He and Mu represent fat body,hemolymph,ovary,body wall,testis,head and muscle,respectively圖7 九香蟲CcDef3在不同組織部位的相對表達量Fig.7 Relative expression levels of CcDef3 in different tissues of C.chinensis

圖8 九香蟲成蟲在不同誘導時間下CcDef3的相對表達量Fig.8 Relative expression level of CcDef3 in adult at various time post-induction

前人研究表明，抗菌肽基因的表達模式受發(fā)育調控，如來源于遲眼蕈蚊(Bradysiahygida)的抗菌肽BhSGAMP-1具有廣譜抗菌活性，由幼蟲在準備蛻皮時由唾液腺特定表達以幫助預防微生物侵染[21]。岡比亞按蚊3種防衛(wèi)素(AgDef2,AgDef3及AgDef4)在卵、蛹及成蟲中的表達水平極低，而在幼蟲中表達量卻遠高于其他發(fā)育時期[22]。Mittapalli[23]等通過研究發(fā)現(xiàn)，麥廮蠅(Hessianfly)防衛(wèi)素MdesDEF-1在3齡幼蟲的表達水平最高。從CcDef3基因在九香蟲不同發(fā)育時期的表達情況看，CcDef3基因在5齡若蟲的表達水平最高，而5齡若蟲是九香蟲發(fā)育為成蟲的最后一個若蟲階段，蛻皮時期的蟲體比較脆弱，易受到外源異物的感染。推測CcDef3基因有可能受發(fā)育調節(jié)高水平表達以抵抗病原菌的感染。

免疫攻擊觸發(fā)了模式識別受體與病原體相關分子結合，激活免疫信號通路，從而使得昆蟲體內免疫細胞表達抗菌物質作用于病原菌，這個過程是昆蟲先天性免疫系統(tǒng)的關鍵[24-25]。在受到感染或濃毒性損傷后，昆蟲抗菌肽在脂肪體中表達，并分泌到血淋巴中，保護昆蟲免受微生物的侵害[26-27]。與之前的研究相似，CcDef3基因在九香蟲不同組織中皆有表達，但在脂肪體中表達水平卻遠高于其它組織，這表明CcDef3基因主要在九香蟲的脂肪體中表達，脂肪體是九香蟲抗感染過程中非常重要的免疫組織。

九香蟲成蟲被細菌誘導之后，CcDef3基因的表達水平上調至12 h時達到峰值，在48 h時趨向于未誘導前的表達水平。這種受外源病菌誘導后隨時間先上調至峰值然后下調的表達模式也出現(xiàn)在其它昆蟲防衛(wèi)素基因中，如棉貪夜蛾(Spodopteralittoralis)防衛(wèi)素基因SpliDef在被細菌誘導后的48 h上調到峰值后開始下調[28]，而家蠶(Bombyxmori)防衛(wèi)素基因BmDefensinB僅在被大腸桿菌誘導后8 h就已經上調到峰值[29]。推測在九香蟲成蟲受到細菌誘導后，蟲體內快速合成了防衛(wèi)素CcDef3來抵御細菌，隨后由于CcDef3等抗菌物質發(fā)揮了抗菌作用，清除了體內的大量細菌，在免疫反饋機制的作用下抑制了CcDef3基因的表達。但防衛(wèi)素在機體內的互作關系是復雜的，九香蟲防衛(wèi)素CcDef3在免疫和發(fā)育調控中的影響因素及其作用機理有待進一步研究。

4 結 論

研究克隆了九香蟲防衛(wèi)素基因CcDef3，并分析其氨基酸序列和結構特征，CcDef3具有同其它昆蟲防衛(wèi)素一樣保守的功能結構域。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，CcDef3同其它半翅目昆蟲防衛(wèi)素具有高度的同源性；革蘭氏菌液感染成蟲后CcDef3基因在表達水平上的明顯上調，表明其參與九香蟲的體液免疫反應；CcDef3基因不僅受到自身發(fā)育的調控，同時還能被誘導表達而參與免疫應答，表明CcDef3在九香蟲抵御病原菌的侵染過程中扮演著重要角色。