齊小浪，杜 娟，李尚偉

(貴州大學(xué)昆蟲(chóng)研究所貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

【研究意義】抗菌肽被認(rèn)為是一類有望成為抗生素替代品的新型抗生藥物，抗菌肽類抗生素的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用治療研究成為新型抗菌藥物開(kāi)發(fā)研究的熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽擁有高度模塊化的合成抗菌系統(tǒng)，其小分子多肽對(duì)大量病原體的作用是快速和致命的，抗菌肽必須穿透靶細(xì)胞才能發(fā)揮殺死靶細(xì)胞的作用，這種作用模式能有效降低微生物的抗性[1-2]。因此，抗菌肽是一種非常有希望解決多重耐藥性的新型替代藥物?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】多細(xì)胞生物常遇到病原生物的侵染，昆蟲(chóng)作為地球上數(shù)量和種類最龐大的生物種群，其擁有強(qiáng)大的抗感染手段，如吞噬細(xì)菌和包裹寄生蟲(chóng)的能力，這些反應(yīng)包括激活胞外蛋白酶級(jí)聯(lián)、黑化和凝固以及誘導(dǎo)抗菌肽基因表達(dá)[3-4]。昆蟲(chóng)免疫反應(yīng)的一個(gè)主要方面是感染后快速產(chǎn)生昆蟲(chóng)防衛(wèi)素等抗菌肽。昆蟲(chóng)防衛(wèi)素是昆蟲(chóng)在受到意外傷害和病原微生物入侵時(shí)在昆蟲(chóng)脂肪體及血淋巴中產(chǎn)生的一種天然免疫多肽[5]，其在昆蟲(chóng)綱中皆廣泛分布，也存在于其它節(jié)肢動(dòng)物如蝎子(Buthuseqeus)中，在昆蟲(chóng)免疫防護(hù)的過(guò)程中扮演著重要的角色。分離于麻蠅(Sarcophagaperegina)幼蟲(chóng)和麗蠅(Phormiaterranorae)的2個(gè)抗革蘭氏陽(yáng)性菌(Gram-positive bacteria，G+)抗菌肽是最早分離出來(lái)的昆蟲(chóng)防衛(wèi)素，因與哺乳動(dòng)物體內(nèi)由粒性白細(xì)胞產(chǎn)生的的一組堿性抗菌肽防衛(wèi)素序列相似而命名[6]。昆蟲(chóng)防衛(wèi)素主要抗G+,偶爾也有抗革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria,G-)或真菌的報(bào)道，但G-通常可利用其外膜抵抗昆蟲(chóng)防衛(wèi)素而對(duì)其有抗性。麗蠅防衛(wèi)素能打破藤黃微球菌(Micrococcusluteus)質(zhì)膜滲透性屏障，引起胞質(zhì)內(nèi)K+和 ATP 下降，以及質(zhì)膜部分剝離和細(xì)胞呼吸受阻,這些現(xiàn)象與防衛(wèi)素引起質(zhì)膜脂質(zhì)體內(nèi)形成通道有關(guān)[7]。病原微生物的浸染誘導(dǎo)昆蟲(chóng)防衛(wèi)素的表達(dá)，昆蟲(chóng)防衛(wèi)素的構(gòu)效關(guān)系還不清楚，但通常認(rèn)為6個(gè)半胱氨酸殘基組成的3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵和富含精氨酸是其生物活性所必需的[8]。九香蟲(chóng)Coridiuschinensis為半翅目兜蝽科昆蟲(chóng)，以葫蘆科植物汁液為食在全國(guó)大部分地區(qū)均有分布，主要分布于我國(guó)的沿海、中部及西南地區(qū)[9]，為藥食兩用昆蟲(chóng)，具有極大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[10-11]。九香蟲(chóng)具有較強(qiáng)的免疫防護(hù)手段，其在野外被外源異物侵染死亡的情況較為罕見(jiàn)，具有較為完善的免疫系統(tǒng)。吳瑪莉[12]通過(guò)凝膠過(guò)濾法從九香蟲(chóng)血淋巴里分離得到的低分子量蛋白對(duì)G+和G-都有抑制作用。李尚偉等[13]通過(guò)質(zhì)譜法從九香蟲(chóng)血淋巴分離得10條小分子多肽，CcAMP1對(duì)G+及G-均具有明顯的抑菌作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于九香蟲(chóng)中防衛(wèi)素基因在表達(dá)水平的研究較少，因此利用反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse transcription PCR,RT-PCR)克隆九香蟲(chóng)防衛(wèi)素CcDef3基因的cDNA序列，并利用生物信息學(xué)軟件和方法對(duì)其進(jìn)行特征分析。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)分析其時(shí)空表達(dá)及細(xì)菌對(duì)誘導(dǎo)的作用?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】檢測(cè)克隆的九香蟲(chóng)防衛(wèi)素CcDef3時(shí)空表達(dá)模式和九香蟲(chóng)被細(xì)菌誘導(dǎo)后表達(dá)水平的變化，揭示九香蟲(chóng)防衛(wèi)素基因CcDef3的調(diào)控規(guī)律，為深入探究九香蟲(chóng)體內(nèi)防衛(wèi)素的互作關(guān)系提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

九香蟲(chóng)成蟲(chóng)采集于貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)，以人工種植的南瓜稈莖飼喂于人工氣候箱內(nèi)，飼養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，濕度(68±5)%，光周期14 L (Light)：10 D (Dark)。不同發(fā)育時(shí)期的樣品取自子1代的卵、1～5齡若蟲(chóng)和雌雄成蟲(chóng)；不同組織樣品取自子1代成蟲(chóng)的頭部、肌肉、體壁、脂肪體、血淋巴、精巢和卵巢。樣本保存在RNAlater(Qiagen,Duesseldorf,Germany)中，貯存于-20 ℃冰箱。

1.2 細(xì)菌誘導(dǎo)

將金黃色葡萄球菌[Staphylocousaureus(ATCC 25923)]和大腸桿菌[Escherichiacoli(ATCC 25923)]等體積混合后，使用微量注射器將10 μL混合菌液注入子1代九香蟲(chóng)成蟲(chóng)體內(nèi)，分別在不同的時(shí)間(6、12、24、36和48 h)取浸染后未死亡的蟲(chóng)體，用無(wú)菌剪刀取其腹部,樣本保存在RNAlater(Qiagen,Duesseldorf,Germany)中，貯存于-20 ℃冰箱。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

根據(jù)HP Total RNA Kit(Omega Bio-Tek,GA,USA)說(shuō)明書(shū)提取總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量，使用NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)(Thermo Fisher,MA,USA)檢測(cè)所提取總RNA的純度和濃度，檢測(cè)合格的RNA于-80 ℃保存?zhèn)溆?。第一鏈cDNA的制備根據(jù)RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher,MA,USA)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 九香蟲(chóng)CcDef3基因克隆

基于九香蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用相關(guān)的生物信息學(xué)方法并根據(jù)昆蟲(chóng)防衛(wèi)素的結(jié)構(gòu)特征篩選到1條九香蟲(chóng)防衛(wèi)素基因。使用NCBI的Primer-BLAST設(shè)計(jì)特異性引物，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成(表1)。在T100 PCR儀(Bio-Rad,CA,USA)上進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL:25 μL 2×TsingKe Master Mix(北京擎科生物公司)，2 μL cDNA模板，上、下游引物(10 μM)各1 μL，補(bǔ)加21 μL滅菌超純水。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，回收純化目的基因，連接到pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取重組子進(jìn)行菌落PCR鑒定，送陽(yáng)性克隆至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將克隆測(cè)出的序列和數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證。

表1 九香蟲(chóng)防衛(wèi)素基因CcDef3克隆與表達(dá)分析的引物信息

1.5 CcDef3基因的生物信息學(xué)分析

CcDef3基因的編碼區(qū)用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/ )進(jìn)行預(yù)測(cè)，采用SignalP 4.1 Server (http:www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信號(hào)肽及前肽，用ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/) 對(duì)編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行分子量和等電點(diǎn)預(yù)測(cè)。用NetOGlyc 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)和NetNGlyc1.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預(yù)測(cè)糖基化位，DiANNA 1.1 web server(http://clavius.bc.edu/～clotelab/DiANNA/)預(yù)測(cè)二硫鍵，用KinasePhos(http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/)預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)。PSORT II Prediction(https://psort.hgc.jp/form2.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，用DNAMAN 9.0(Lynnon Biosoft,CA,USA)將CcDef3氨基酸序列同20種防衛(wèi)素氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)；并使用MEGA-X構(gòu)建CcDef3與20種其它昆蟲(chóng)防衛(wèi)素的進(jìn)化樹(shù)。表2為氨基酸序列比對(duì)和構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的防衛(wèi)素來(lái)源物種和GenBank登錄號(hào)。使用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)的同源建模方法預(yù)測(cè)成熟CcDef3的三維結(jié)構(gòu)，用PyMOL 1.4繪制其分子結(jié)構(gòu)圖。

1.6 基因表達(dá)模式解析

用C1000 Thermal Cycler(Bio-Rad,CA,USA)進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)CcDef3基因的時(shí)空表達(dá)模式及誘導(dǎo)后的響應(yīng)模式。RT-qPCR反應(yīng)按照2×SYBR Select Master Mix(Thermo Fisher,MA,USA)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反應(yīng)體系為10 μL:1 μL第1鏈 cDNA，上、下游引物(表1)各0.5 μL，5 μL 2×SYBR Select Master Mix,3 μL無(wú)RNA酶的無(wú)菌去離子水。反應(yīng)程序：50 ℃ 120 s；95 ℃預(yù)變性120 s；95 ℃變性15 s,58 ℃退火15 s,72 ℃延伸60 s,40 cycles。以九香蟲(chóng)β-actin基因(注冊(cè)號(hào)：MK370101)作內(nèi)參對(duì)照，每個(gè)樣本重復(fù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用2-ΔΔCt法[14]計(jì)算CcDef3的相對(duì)表達(dá)量，用SPSS 22進(jìn)行方差分析(ANOVA)，用鄧肯氏新復(fù)極差法(Duncan’s test)進(jìn)行多重檢驗(yàn)，顯著性水平為P<0.05，用Sigma Plot 12.5 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CcDef3的cDNA克隆

經(jīng)RT-PCR得CcDef3基因的cDNA序列(GenBank登錄號(hào)：MN563605)長(zhǎng)522 bp(圖1)，5′端非編碼區(qū)為53 個(gè)核苷酸(Nucleotident,nt)，編碼區(qū)為351 nt，3′端非編碼區(qū)為424 nt。

2.2 CcDef3的特征分析

九香蟲(chóng)防衛(wèi)素CcDef3包含1個(gè)信號(hào)肽、2個(gè)前體肽和1個(gè)成熟肽段，N端信號(hào)肽具17個(gè)氨基酸(Amino acid,aa)，前體肽分別由1個(gè)30 aa及1個(gè)26 aa的肽段組成，因此CcDef3具2個(gè)切割位點(diǎn)(R47↓T48，R73↓A74)，其C端成熟肽包含43個(gè)氨基酸殘基(圖2)。

理化性質(zhì)分析表明，CcDef3的分子式為C198H320N61O57S6，分子量為4684.47 Da，理論等電點(diǎn)為9.13，含有1個(gè)酸性氨基酸(D)及6個(gè)堿性氨基酸(4個(gè)K、2個(gè)R)，成熟肽靜電荷數(shù)為+5。脂肪族氨基酸指數(shù)為63.72，親水性平均系數(shù)為-0.095，表明CcDef3親水性氨基酸殘基數(shù)大于疏水性殘基數(shù)，為親水性蛋白。修飾結(jié)構(gòu)分析顯示該肽既沒(méi)N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)，也沒(méi)磷酸化位點(diǎn)。保守結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)構(gòu)域分析顯示，CcDef3屬于昆蟲(chóng)防衛(wèi)素家族，具有蝎子毒素及無(wú)脊椎動(dòng)物防衛(wèi)素相同的功能結(jié)構(gòu)域，參與免疫防御反應(yīng)。

表2 用于多序列對(duì)齊和聚類分析的防衛(wèi)素物種

A:九香蟲(chóng)總RNA；B:CcDef3基因擴(kuò)增。M:DL2000 DNA marker;1:CcDef3 基因A:Total RNA；B:CcDef3 gene amplification;M:DL2000 DNA marker;1：CcDef3 gene圖1 九香蟲(chóng)防衛(wèi)素CcDef3基因的電泳圖Fig.1 Electropherogram of CcDef3 gene

通過(guò)同源建模方式構(gòu)建的CcDef3三維分子(圖3)顯示，1個(gè)α-螺旋，2個(gè)β-折疊片以及4個(gè)無(wú)規(guī)卷曲形成其高級(jí)結(jié)構(gòu)，并用3個(gè)二硫鍵(C76-C107,C93-C112和C97-C114)穩(wěn)定其構(gòu)象。

2.3 同源性和聚類分析

將CcDef3的氨基酸序列在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)里進(jìn)行在線比對(duì)結(jié)果顯示，該防衛(wèi)素與來(lái)自紅尾碧蝽(P.prasina)的防衛(wèi)素氨基酸序列相似性高達(dá)74.42%。將CcDef3同21個(gè)源于昆蟲(chóng)的防衛(wèi)素氨基酸序列比對(duì)結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，其都具有保守的6個(gè)半胱氨酸(Cysteine，C)位點(diǎn)及連續(xù)的甘氨酸(Glycine，G)位點(diǎn)，此2種保守位點(diǎn)是維持昆蟲(chóng)防衛(wèi)素活性所必需的結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖5)顯示，CcDef3與紅尾碧蝽及茶翅蝽防衛(wèi)素聚為一支，再與同屬半翅目的10種蝽類防衛(wèi)素聚為一支；3種螞蟻防衛(wèi)素與同屬膜翅目的蜜蜂防衛(wèi)素聚為一支；再與2種虱目防衛(wèi)素聚為一支。同源性與聚類分析表明，九香蟲(chóng)防衛(wèi)素與紅尾碧蝽防衛(wèi)素的親緣關(guān)系最近。

2.4 CcDef3基因表達(dá)模式

RT-qPCR分析結(jié)果表明，CcDef3基因在各個(gè)發(fā)育時(shí)期皆有不同程度的表達(dá)，其中在5齡若蟲(chóng)中的表達(dá)水平最高且顯著高于其他齡期，分別為卵及3齡若蟲(chóng)的76.44和4.47倍(圖6)。CcDef3在各個(gè)檢測(cè)組織內(nèi)都有不同水平的表達(dá)，但表達(dá)水平最高的組織為脂肪體，血淋巴次之，其它組織內(nèi)的表達(dá)水平都相對(duì)較低，脂肪體內(nèi)的表達(dá)水平是血淋巴及肌肉中的8.89和219.90倍之多(圖7 )。用細(xì)菌注射誘導(dǎo)九香蟲(chóng)成蟲(chóng)，CcDef3的表達(dá)水平上調(diào)至12 h時(shí)達(dá)到最高水平，而后下調(diào)至48 h時(shí)趨向于誘導(dǎo)前的水平，在12 h時(shí)表達(dá)水平分別是感染前和6 h時(shí)的153.24和11.91倍(圖8)。

成熟肽序列用黑色下劃線表示，“*”表示終止密碼子，↓表示切割位點(diǎn)The mature peptide sequence is marked by a black underline,the asterisk shows stop codon,↓ indicates cleavage site圖2 九香蟲(chóng)防衛(wèi)素基因CcDef3的核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of CcDef3 from C.chinensis

圖根據(jù)CcDef3.pdb數(shù)據(jù)用PyMOL 1.4產(chǎn)生，C76-C107,C93-C112和C97-C114表示二硫鍵This figure is generated with PyMOL 1.4 based on CcDef3.pdb data,C76-C107,C93-C112 and C97-C114 indicates disulfide bonds圖3 成熟CcDef3的三維分子結(jié)構(gòu)Fig.3 Three-dimensional molecular structure of mature CcDef3

3 討 論

昆蟲(chóng)防衛(wèi)素是昆蟲(chóng)抗菌肽中數(shù)量較為龐大的一個(gè)家族，具有較好的抗G+活性，但而抗G-及真菌的活性較低，迄今為止大多數(shù)從昆蟲(chóng)中分離和鑒定的防衛(wèi)素都是陽(yáng)離子多肽。目前關(guān)于半翅目昆蟲(chóng)防衛(wèi)素的研究較少。研究克隆了九香蟲(chóng)防衛(wèi)素CcDef3的cDNA序列并測(cè)序驗(yàn)證，其成熟肽具有同昆蟲(chóng)防衛(wèi)素的序列特征和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。防衛(wèi)素的分子結(jié)構(gòu)特征與其功能以及活性有著密切的聯(lián)系，如帶正電荷的防衛(wèi)素與帶負(fù)電荷的微生物膜成分通過(guò)正負(fù)電荷間的結(jié)合從而發(fā)揮其抗菌作用[15]；6個(gè)半胱氨酸保守位點(diǎn)形成的3個(gè)二硫鍵和防衛(wèi)素典型的半胱氨酸穩(wěn)定的αβ-基序(cysteine-stabilized α β motif,CS α β motif)是其重要的空間結(jié)構(gòu)，對(duì)發(fā)揮防衛(wèi)素抗菌活性具有極其重要的作用[16-17]。從九香蟲(chóng)中克隆得到的防衛(wèi)素CcDef3具有同樣的序列特征及分子結(jié)構(gòu)，成熟的CcDef3為陽(yáng)離子多肽，含5個(gè)凈正電荷，具有6個(gè)半胱氨酸殘基形成的3個(gè)二硫鍵，CcDef3包含了一個(gè)基序：C-X16-C-X3-C-X9-C-X4-C-X1-C，與昆蟲(chóng)防衛(wèi)素的基序(C-X5-16-C-X3-C-X9-11-C-X4-7-C-X1-C)一致[18]。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及同源建模結(jié)果顯示其具有1個(gè)α螺旋及2個(gè)β折疊及4個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲，2個(gè)β-sheets，α螺旋與C端loop之間由3個(gè)二硫鍵連接并維持其立體上的穩(wěn)定性，一般認(rèn)為α螺旋及β折疊是防衛(wèi)素發(fā)揮其抗菌活性的功能結(jié)構(gòu)[19]。這些序列及結(jié)構(gòu)特征上的相似性揭示了九香蟲(chóng)防衛(wèi)素CcDef3具有同其它昆蟲(chóng)防衛(wèi)素一樣的生物功能。昆蟲(chóng)防衛(wèi)素的半胱氨酸穩(wěn)定CSαβ基序由基因復(fù)制進(jìn)化而來(lái)，隨后由于選擇性進(jìn)化壓力而發(fā)散，從而產(chǎn)生一系列不同的副類似物[20]。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，CcDef3與其它半翅目防衛(wèi)素形成一個(gè)獨(dú)特的進(jìn)化支，膜翅目防衛(wèi)素與虱目防衛(wèi)素形成一個(gè)分支。

共有的殘基用星號(hào)和黑框表示，強(qiáng)相似的殘基用“：”表示，弱相似殘基用“.”表示Identical residues are indicated by asterisks and black boxes,strongly similar residues are indicated by ‘:’,and weakly similar residues are indicated by ‘.’圖4 CcDef3與其它20種昆蟲(chóng)防衛(wèi)素氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Alignment of amino acid sequences of CcDef3 and 20 other insect defensins

用MEGA-X構(gòu)建昆蟲(chóng)防衛(wèi)素的鄰接樹(shù)，重復(fù)運(yùn)行1 000次，節(jié)點(diǎn)上的數(shù)值表示自舉檢驗(yàn)值。九香蟲(chóng)防衛(wèi)素用黑三角形標(biāo)記MEGA-X was used to construct the phylogenetic tree based on amino acid sequences of known insect defensins with Neighbor-Joining method (NJ).One thousand replications were performed and bootstrap confidence values are shown at the nodes.Defensin from C.chinensis is marked with a back triangle圖5 根據(jù)已知的昆蟲(chóng)防衛(wèi)素構(gòu)建的聚類進(jìn)化樹(shù)Fig.5 The phylogenetic tree based on known insect defensins

E為卵，N1～N5為1～5齡若蟲(chóng)，F(xiàn)為雌成蟲(chóng)，M為雄成蟲(chóng)；不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P < 0.05)，下同E:Egg;N1-N5:1st-5th-instar nymphs;F:female;M:male.Different letters above the bars indicate significant differences (P < 0.05).The same as below圖6 九香蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期CcDef3的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression level of CcDef3 at various developmental stages of C.chinensis

FB、Ha、Ov、BW、Te、He與Mu分別表示脂肪體、血淋巴、卵巢、體壁、精巢、頭部及肌肉FB,Ha,Ov,BW,Te,He and Mu represent fat body,hemolymph,ovary,body wall,testis,head and muscle,respectively圖7 九香蟲(chóng)CcDef3在不同組織部位的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression levels of CcDef3 in different tissues of C.chinensis

圖8 九香蟲(chóng)成蟲(chóng)在不同誘導(dǎo)時(shí)間下CcDef3的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression level of CcDef3 in adult at various time post-induction

前人研究表明，抗菌肽基因的表達(dá)模式受發(fā)育調(diào)控，如來(lái)源于遲眼蕈蚊(Bradysiahygida)的抗菌肽BhSGAMP-1具有廣譜抗菌活性，由幼蟲(chóng)在準(zhǔn)備蛻皮時(shí)由唾液腺特定表達(dá)以幫助預(yù)防微生物侵染[21]。岡比亞按蚊3種防衛(wèi)素(AgDef2,AgDef3及AgDef4)在卵、蛹及成蟲(chóng)中的表達(dá)水平極低，而在幼蟲(chóng)中表達(dá)量卻遠(yuǎn)高于其他發(fā)育時(shí)期[22]。Mittapalli[23]等通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，麥廮蠅(Hessianfly)防衛(wèi)素MdesDEF-1在3齡幼蟲(chóng)的表達(dá)水平最高。從CcDef3基因在九香蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況看，CcDef3基因在5齡若蟲(chóng)的表達(dá)水平最高，而5齡若蟲(chóng)是九香蟲(chóng)發(fā)育為成蟲(chóng)的最后一個(gè)若蟲(chóng)階段，蛻皮時(shí)期的蟲(chóng)體比較脆弱，易受到外源異物的感染。推測(cè)CcDef3基因有可能受發(fā)育調(diào)節(jié)高水平表達(dá)以抵抗病原菌的感染。

免疫攻擊觸發(fā)了模式識(shí)別受體與病原體相關(guān)分子結(jié)合，激活免疫信號(hào)通路，從而使得昆蟲(chóng)體內(nèi)免疫細(xì)胞表達(dá)抗菌物質(zhì)作用于病原菌，這個(gè)過(guò)程是昆蟲(chóng)先天性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵[24-25]。在受到感染或濃毒性損傷后，昆蟲(chóng)抗菌肽在脂肪體中表達(dá)，并分泌到血淋巴中，保護(hù)昆蟲(chóng)免受微生物的侵害[26-27]。與之前的研究相似，CcDef3基因在九香蟲(chóng)不同組織中皆有表達(dá)，但在脂肪體中表達(dá)水平卻遠(yuǎn)高于其它組織，這表明CcDef3基因主要在九香蟲(chóng)的脂肪體中表達(dá)，脂肪體是九香蟲(chóng)抗感染過(guò)程中非常重要的免疫組織。

九香蟲(chóng)成蟲(chóng)被細(xì)菌誘導(dǎo)之后，CcDef3基因的表達(dá)水平上調(diào)至12 h時(shí)達(dá)到峰值，在48 h時(shí)趨向于未誘導(dǎo)前的表達(dá)水平。這種受外源病菌誘導(dǎo)后隨時(shí)間先上調(diào)至峰值然后下調(diào)的表達(dá)模式也出現(xiàn)在其它昆蟲(chóng)防衛(wèi)素基因中，如棉貪夜蛾(Spodopteralittoralis)防衛(wèi)素基因SpliDef在被細(xì)菌誘導(dǎo)后的48 h上調(diào)到峰值后開(kāi)始下調(diào)[28]，而家蠶(Bombyxmori)防衛(wèi)素基因BmDefensinB僅在被大腸桿菌誘導(dǎo)后8 h就已經(jīng)上調(diào)到峰值[29]。推測(cè)在九香蟲(chóng)成蟲(chóng)受到細(xì)菌誘導(dǎo)后，蟲(chóng)體內(nèi)快速合成了防衛(wèi)素CcDef3來(lái)抵御細(xì)菌，隨后由于CcDef3等抗菌物質(zhì)發(fā)揮了抗菌作用，清除了體內(nèi)的大量細(xì)菌，在免疫反饋機(jī)制的作用下抑制了CcDef3基因的表達(dá)。但防衛(wèi)素在機(jī)體內(nèi)的互作關(guān)系是復(fù)雜的，九香蟲(chóng)防衛(wèi)素CcDef3在免疫和發(fā)育調(diào)控中的影響因素及其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

研究克隆了九香蟲(chóng)防衛(wèi)素基因CcDef3，并分析其氨基酸序列和結(jié)構(gòu)特征，CcDef3具有同其它昆蟲(chóng)防衛(wèi)素一樣保守的功能結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，CcDef3同其它半翅目昆蟲(chóng)防衛(wèi)素具有高度的同源性；革蘭氏菌液感染成蟲(chóng)后CcDef3基因在表達(dá)水平上的明顯上調(diào)，表明其參與九香蟲(chóng)的體液免疫反應(yīng)；CcDef3基因不僅受到自身發(fā)育的調(diào)控，同時(shí)還能被誘導(dǎo)表達(dá)而參與免疫應(yīng)答，表明CcDef3在九香蟲(chóng)抵御病原菌的侵染過(guò)程中扮演著重要角色。