潘 俊，田 浩，曲 媛，侯朝祥，金鵬程，吳昕怡，李 宏*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明 650223；2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650091)

【研究意義】靈芝具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正培本的功效，有兩千多年的使用歷史[1-3]。靈芝作為藥材收載于2015年版《中國(guó)藥典》，其法定中藥材為赤芝(Ganodermalucidum) 與紫芝(Ganodermasinensis) 的干燥子實(shí)體，而其它品種的靈芝未被收錄。白肉靈芝(Ganodermaleucocontextum)為多孔菌科靈芝屬大型真菌，是中國(guó)西南地區(qū)的一個(gè)重要靈芝種類(lèi)[4]。靈芝的安全性是食品開(kāi)發(fā)中面臨的首要問(wèn)題。赤芝和紫芝的安全性使毋庸置疑的，已被國(guó)家衛(wèi)計(jì)委列入保健食品名單，但白肉靈芝的安全性尚未見(jiàn)報(bào)道，缺乏相關(guān)領(lǐng)域的研究?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】白肉靈芝屬于靈芝屬中的罕見(jiàn)低溫型種類(lèi)，經(jīng)多年選育，已獲得穩(wěn)定性強(qiáng)、代謝能力高、安全性高的白肉靈芝人工栽培品[5]。目前，針對(duì)白肉靈芝的研究主要集中于生物學(xué)鑒定[6]、化學(xué)成分[7]及藥理活性作用[8]等方面，但白肉靈芝安全性研究尚屬空白。而對(duì)重金屬的富集是真菌類(lèi)食品最大的安全隱患，據(jù)報(bào)道，靈芝富集重金屬能力強(qiáng)，且富集于菌蓋、菌柄不同部位，易富集鎘、砷等[9-11]。靈芝中重金屬的污染及其含量與生長(zhǎng)環(huán)境密切相關(guān)，鉛、鎘、汞、砷等重金屬元素的攝入對(duì)人體有毒害作用，甚至引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病[12-13]。目前《中國(guó)藥典》2020版已對(duì)重金屬元素進(jìn)行限量要求，同時(shí)靈芝中重金屬的含量測(cè)定已有文獻(xiàn)報(bào)道[14-15]，靈芝中鎘超標(biāo)率較高[11]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】靈芝對(duì)于重金屬的富集存在很大的安全風(fēng)險(xiǎn)，因此，白肉靈芝中重金屬含量的測(cè)定與評(píng)估對(duì)其安全性評(píng)價(jià)十分重要?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本文以白肉靈芝為研究對(duì)象，測(cè)定白肉靈芝中鉛(Pb)、鎘(Cd)、汞(Hg)、砷(As)4種重金屬含量，依據(jù)國(guó)際通用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模式對(duì)健康風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，并對(duì)其進(jìn)行毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)研究，為白肉靈芝的質(zhì)量安全提供判定依據(jù)，為白肉靈芝的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠40只(18～22 g/只，雌雄各半)，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(滇)K2015—0002。

1.2 試劑與耗材

云南白肉靈芝(Ganodermaleucocontextum)由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所提供(表1)。汞單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 μg/mL，批號(hào)：GBW08617 9041)、鉛單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 μg/mL，批號(hào)：GBW08619 8061)、鎘單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 μg/mL，批號(hào)：GBW08612 7063)均購(gòu)于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；砷單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液 [1000 μg/mL，GSB G 62028—90(3302)，批號(hào)：09051132]購(gòu)于國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心鋼鐵研究總院。

表1 白肉靈芝樣品信息

1.3 儀器

PEAA800原子吸收光譜儀(珀金埃爾默股份有限公司)；AFS-9230原子熒光光度計(jì)(北京吉天儀器有限公司)；Mars6 微波消解儀(美國(guó)培安公司)；BS-280全自動(dòng)血液生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；AUY220電子天平(日本島津公司)；R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi 公司)；ALPHA 1-4 LSC冷凍干燥機(jī)(Christ 公司)。

1.4 方法

1.4.1 對(duì)照品制備 按食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法分別用超純水將汞(Hg)標(biāo)準(zhǔn)液稀釋為0.20、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 ng/mL，鎘(Cd)標(biāo)準(zhǔn)液稀釋為0.50、1.00、1.50、2.00、3.00 ng/mL，鉛(Pb)標(biāo)準(zhǔn)液稀釋為5.00、10.00、20.00、30.00、40.00 ng/mL，砷(As)標(biāo)準(zhǔn)液稀釋為4.00、10.00、20.00、60.00、120.00 ng/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

1.4.2 供試品制備 精密稱取0.2 g白肉靈芝樣品置于微波消解罐中，加入硝酸5.0 mL混勻，在微波消解儀中進(jìn)行消解，然后在電熱板上于140 ℃趕酸至1 mL左右備用。

1.4.3 線性關(guān)系考察 將各重金屬元素的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以吸光度C為橫坐標(biāo)，濃度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示各重金屬組分線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)都大于0.99，符合要求，見(jiàn)表2。

表2 重金屬檢測(cè)線性關(guān)系考察

1.4.4 精密度試驗(yàn) 分別取鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液(80 ng/mL)、砷標(biāo)準(zhǔn)溶液(40 ng/mL)、鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液(8.0 ng/mL)、汞標(biāo)準(zhǔn)溶液(18 ng/mL)連續(xù)進(jìn)樣6次，按其吸光度計(jì)算RSD。試驗(yàn)結(jié)果顯示4種重金屬平均吸收度的RSD均不超過(guò)1.00%，精密度良好。

1.4.5 回收率試驗(yàn) 制備已知含量的供試品溶液各6份，分別精密加入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋一定倍數(shù)后按相應(yīng)方法測(cè)定，計(jì)算回收率。試驗(yàn)結(jié)果顯示4種重金屬平均回收率在96%～103%，RSD值在2%～6%，回收率良好。

1.4.6 含量測(cè)定 參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，其中鉛(參照GB 5009.12—2017)、鎘(參照GB 5009.15—2014)采用石墨爐原子吸收光譜法進(jìn)行檢測(cè)，總砷(參照GB 5009.11—2014)、總汞(參照GB 5009.17—2014)采用原子熒光光譜法進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

采用美國(guó)環(huán)保署(USEPA)提出的人體暴露健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)模型，靶標(biāo)危害系數(shù)法 (Target hazard quotients，THQ)，評(píng)估人體每日白肉靈芝攝入的重金屬所帶來(lái)的健康風(fēng)險(xiǎn)[16]。

THQ=(EF×ED×M1×CM/RfD×BW×AT)×10-3

(1)

式中，EF為每年暴露于毒物(白肉靈芝)的天數(shù)(d/a)；ED為暴露于毒物(白肉靈芝)的年數(shù)(a)；M1為白肉靈芝中重金屬含量(mg/kg)；CM為白肉靈芝每日攝入量；RfD為口服參考劑量(mg/kg)；BW為人體平均體重(kg)；AT為平均暴露時(shí)間(d)。

采用危害指數(shù)HI綜合評(píng)估多種重金屬非致癌風(fēng)險(xiǎn)。

HI=THQPb+THQCd+THQHg+THQAs

(2)

式中，THQPb是Pb的靶標(biāo)危害系數(shù)；THQCd是Cd的靶標(biāo)危害系數(shù)；THQHg是Hg的靶標(biāo)危害系數(shù)；THQAs是As的靶標(biāo)危害系數(shù)。

1.6 小鼠急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)

白肉靈芝樣品粉碎后稱取100 g置燒瓶中，加入蒸餾水700 mL，回流1 h，提取2次，濃縮后凍干備用，即為白肉靈芝水提物(GLE)。按照GB 15193.3—2014食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)中最大耐受量法(MTD)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分2組，陰性對(duì)照組、GLE組，每組20只(雌雄各半)，小鼠禁食6 h后，提取物按15.0 g/kg的劑量給藥，將樣品加水制成400 mg/mL的溶液灌胃2次(間隔4 h)，觀察14 d，記錄動(dòng)物中毒表現(xiàn)和死亡情況。

1.7 小鼠亞急性毒性實(shí)驗(yàn)

1.7.1 分組與給藥 將小鼠按體重隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、GLE低、中、高劑量組(1.0、2.0、3.0 g/kg)，共4組，每組共12只，雌雄各半。陰性對(duì)照組灌胃給予相應(yīng)體積的純凈水，GLE低、中、高劑量組灌胃給予相應(yīng)濃度的GLE藥液，連續(xù)給藥30 d。

1.7.2 指標(biāo)測(cè)定 給藥期間，每天觀察記錄動(dòng)物出現(xiàn)的毒性反應(yīng)，分別于給藥當(dāng)天、給藥第7、14、21、28天稱取動(dòng)物體重并記錄；末次給藥2 h后，眼眶采血分離血清，進(jìn)行白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CREA)指標(biāo)測(cè)定。眼眶采血后迅速摘取心臟、肝臟、脾臟、腎臟稱重尿素(UREA)，并計(jì)算臟器系數(shù)。

臟器指數(shù)(%)=臟器質(zhì)量/小鼠體重×100

(3)

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地白肉靈芝的重金屬含量

云南3個(gè)不同產(chǎn)地(昆明、楚雄、怒江3個(gè)地區(qū))白肉靈芝中的砷、鎘、鉛的含量分別為0.16～0.22、0.15～0.50、0.07～0.18 mg/kg(表3)，均符合食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2762—2017關(guān)于食用菌及其制品的規(guī)定以及國(guó)際食品法典委員會(huì)關(guān)于罐裝的蘑菇的規(guī)定(表4)。歐盟對(duì)食用菌(鮮品)中鎘含量的規(guī)定為≤0.2 mg/kg，對(duì)比檢測(cè)的9批次白肉靈芝中鎘含量超標(biāo)的有60%，僅有楚雄地區(qū)的白肉靈芝符合歐盟標(biāo)準(zhǔn)。此外，汞在白肉靈芝中的含量均小于檢測(cè)最小值(0.01 mg/kg)，未檢出，與文獻(xiàn)報(bào)道的靈芝中汞的含量一致[14]。

2.2 不同產(chǎn)地白肉靈芝的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

基于云南白肉靈芝中的鉛、鎘、汞、砷4種重金屬的含量，采用靶標(biāo)危害系數(shù)法(Target hazard quotients，THQ)對(duì)經(jīng)白肉靈芝途徑攝入重金屬對(duì)人體健康產(chǎn)生的危害風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行分析，依據(jù)參考文獻(xiàn)對(duì)各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行取值，見(jiàn)表5。其中，白肉靈芝攝入率(CM)以最大攝入量(12 g/d)計(jì)算。以此為依據(jù)，計(jì)算通過(guò)食用菌途徑進(jìn)入人體重金屬Pb、Cd、As和Hg的THQ和綜合危險(xiǎn)指數(shù)(HI)值，見(jiàn)表6。4種重金屬的THQ大小為：As>Cd>Pb>Hg，各樣品值均<1。從HI平均值來(lái)看，不同地區(qū)白肉靈芝的HI值，昆明>楚雄>怒江，各樣品值均<1。以上數(shù)據(jù)表明，經(jīng)白肉靈芝途徑的重金屬攝入水平在安全限值之內(nèi)，通過(guò)云南白肉靈芝攝入的重金屬對(duì)人體沒(méi)有安全風(fēng)險(xiǎn)。

表3 云南不同產(chǎn)地白肉靈芝中重金屬含量

表4 不同國(guó)家或組織中草藥的重金屬限量規(guī)定

2.3 白肉靈芝的急性毒性

小鼠灌胃給予白肉靈芝提取物(GLE)后，觀察14 d，各組動(dòng)物飲食活動(dòng)正常，生長(zhǎng)良好，未見(jiàn)任何中毒表現(xiàn)，無(wú)死亡，見(jiàn)表7。解剖檢查，肝臟、脾臟、腎臟、心臟、肺、胃、腸等主要器官，均未見(jiàn)明顯異常改變。急性毒性試驗(yàn)中，白肉靈芝水提物對(duì)2種性別小鼠的經(jīng)口最大耐受劑量(MTD)均大于15.00 g/kg。根據(jù)急性毒性分級(jí)，白肉靈芝提取物屬無(wú)毒級(jí)。按體重60 kg，推薦服用劑量(6 g/d)計(jì)，相當(dāng)于0.1 g/kg的服用量，而生藥量MTD遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于推薦服用量的100倍。

2.4 白肉靈芝的亞急性毒性

2.4.1 體重 以1.00、2.00、3.00 g/kg劑量的白肉靈芝提取物(GLE)分別喂養(yǎng)小鼠，連續(xù)30 d，見(jiàn)表8。與陰性對(duì)照組相比，給藥各劑量組小鼠體重增長(zhǎng)無(wú)明顯變化，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，說(shuō)明白肉靈芝水提物對(duì)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)影響。

2.4.2 臟器系數(shù) 臟器系數(shù)是毒理實(shí)驗(yàn)中的常用指標(biāo)，可反映毒物對(duì)機(jī)體的損傷程度。白肉靈芝提取物對(duì)小鼠臟器的影響，見(jiàn)表9。白肉靈芝提取物給藥組與陰性對(duì)照組相比，心、肝、脾、腎的臟器系數(shù)無(wú)明顯變化，與陰性對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)，表明小鼠經(jīng)給藥后，臟器未受影響。

2.4.3 血液學(xué)指標(biāo) 白肉靈芝提取物對(duì)小鼠血細(xì)胞的影響，見(jiàn)表10。白肉靈芝提取物GLE低劑量組對(duì)小鼠的紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)及血紅蛋白含量均未產(chǎn)生不良影響；GLE中、高劑量組小鼠的白細(xì)胞、紅細(xì)胞數(shù)量略有降低，血紅蛋白略有上升，但與陰性對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表5 白肉靈芝中重金屬對(duì)人體健康風(fēng)險(xiǎn)計(jì)算參數(shù)取值

表6 白肉靈芝重金屬攝入健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估值

2.4.4 血液生化指標(biāo) 血液生化指標(biāo)能夠反映機(jī)體的健康狀況，為疾病診斷提供可靠依據(jù)[21]。經(jīng)連續(xù)給藥白肉靈芝提取物30 d后，給藥組與陰性對(duì)照組相比，各劑量組小鼠中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CREA)等6項(xiàng)生化指標(biāo)均無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)表11，表明白肉靈芝提取物對(duì)小鼠機(jī)體無(wú)明顯有害影響。

表7 白肉靈芝提取物對(duì)小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果

表8 白肉靈芝提取物對(duì)小鼠體重的影響

表9 白肉靈芝提取物對(duì)小鼠各臟器系數(shù)的影響

表10 白肉靈芝提取物對(duì)小鼠血細(xì)胞的影響

3 討 論

農(nóng)產(chǎn)品重金屬超標(biāo)問(wèn)題已引起全社會(huì)的廣泛關(guān)注。靈芝具有富集重金屬的能力，易富集Pb、Cd、Hg、As等元素[9-10]。謝寶貴等[22]發(fā)現(xiàn)隨著重金屬元素濃度增加，其在靈芝菌絲體內(nèi)的含量顯著增加，其富集性能力為Pb>Cd >Hg >As。靈芝[23]在菌絲體階段對(duì)Pb表現(xiàn)出明顯的富集作用，而在子實(shí)體階段對(duì)Pb的累積作用卻不明顯。這說(shuō)明靈芝菌絲體和子實(shí)體對(duì)重金屬具有不同的富集特性。王懷豫等[24]檢測(cè)不同產(chǎn)地靈芝子實(shí)體重金屬含量，發(fā)現(xiàn)雖檢出一定量的有害重金屬，但含量較低，未超出國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)，符合《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》的有關(guān)規(guī)定。胡曉等[25]發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地靈芝孢子粉之間的重金屬含量均無(wú)較大差異，且未破壁與破壁孢子粉之間的重金屬含量也無(wú)較大差異。云南白肉靈芝中重金屬含量研究未見(jiàn)報(bào)道。筆者根據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2762—2017關(guān)于食用菌及其制品的規(guī)定要求，本研究連續(xù)3年對(duì)云南省3個(gè)產(chǎn)地白肉靈芝中Pb、Cd、Hg、As含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，均未超標(biāo)。

靈芝在中國(guó)已有2000多年的食用歷史，素有“仙草”之譽(yù)，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中靈芝被列為上品(可久服、無(wú)毒)；明朝時(shí)李時(shí)珍在《本草綱目》中將靈芝移入菜部(可食用)[26]。2019年國(guó)衛(wèi)食品函(2019)311號(hào)文件將靈芝(赤芝和紫芝)列入食藥同源試點(diǎn)名單。中國(guó)有靈芝屬103個(gè)種靈芝資源，藥用的有23種，如赤芝、薄蓋靈芝、菌草靈芝等，但迄今為止未發(fā)現(xiàn)靈芝及其制品安全性的負(fù)面報(bào)道，在日本、韓國(guó)、臺(tái)灣、香港、東南亞等國(guó)家和地區(qū)靈芝也被廣泛用于食品行業(yè)[27-30]。目前白肉靈芝的毒理學(xué)安全性研究尚未有報(bào)道，本研究對(duì)小鼠急性、亞急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，白肉靈芝提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的活動(dòng)、體重、白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量、臟器系數(shù)及肝腎代謝產(chǎn)物均未產(chǎn)生不良影響?？梢?jiàn)，白肉靈芝提取物的安全性高，本研究為白肉靈芝的后續(xù)開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

表11 白肉靈芝提取物對(duì)小鼠生化指標(biāo)的影響

4 結(jié) 論

云南省3個(gè)產(chǎn)地(昆明、楚雄、怒江)的白肉靈芝中的砷、鎘、鉛的含量分別為0.16～0.22、0.15～0.50、0.07～0.18 mg/kg，均未超標(biāo)。而汞在白肉靈芝中的含量低于檢測(cè)限(0.01 mg/kg)，未檢出。采用靶標(biāo)危害系數(shù)法對(duì)重金屬研究結(jié)果進(jìn)行評(píng)估表明，經(jīng)白肉靈芝途徑的重金屬攝入水平在安全限值之內(nèi)，對(duì)人體沒(méi)有安全風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)急性、亞急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，白肉靈芝提取物對(duì)雌雄小鼠經(jīng)口最大耐受劑量均>15 g/kg，屬無(wú)毒級(jí)物質(zhì)。