韓浩園，姚麗娟，王惠繪，尹慧茹，王先寧，吳依依，李玉法，趙金艷，賈萬(wàn)里，李 君，王擁慶,權(quán) 凱*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.澠池縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南 三門峽 472400；3.沈丘縣農(nóng)牧科技研發(fā)中心，河南 周口 466300)

【研究意義】線粒體DNA(mtDNA)遵循母系起源，作為研究動(dòng)物起源進(jìn)化的有效手段，近期已被廣泛應(yīng)用于研究遺傳多樣性、親緣關(guān)系和遺傳分化[1-5]。目前基于線粒體序列對(duì)綿羊遺傳關(guān)系和起源進(jìn)化研究較為廣泛，但中國(guó)河南省綿羊品種小尾寒羊、豫西脂尾羊和河南大尾羊之間的遺傳關(guān)系研究很少，特別是河南大尾羊和豫西脂尾羊群體數(shù)量急劇減少，有必要對(duì)其遺傳資源進(jìn)行評(píng)估，并分析河南省3個(gè)綿羊品種間的遺傳關(guān)系，對(duì)于今后3個(gè)品種的保護(hù)和利用提供遺傳學(xué)依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】綿羊線粒體DNA序列為16.616 kb[6]。早期國(guó)外學(xué)者對(duì)線粒體控制區(qū)(D-loop)序列的研究表明綿羊有2個(gè)母系起源，其中歐洲的摩佛倫羊(Ovisorientalis)為家養(yǎng)綿羊的母系起源之一，同時(shí)排除了羱羊(Caprasibirica)和盤羊(Argali sheep)作為家養(yǎng)綿羊祖先的可能[7]，而隨后發(fā)現(xiàn)家養(yǎng)綿羊可能至少存在3個(gè)母系起源[8-10]。中國(guó)新疆、內(nèi)蒙古、西藏、云南、寧夏、山東、甘肅等地區(qū)18個(gè)地方綿羊品種存在3個(gè)獨(dú)立的母系起源，且綿羊的3個(gè)支系可能曾經(jīng)經(jīng)歷過(guò)群體擴(kuò)張[11-15]。對(duì)中國(guó)地方綿羊品種mtDNA控制區(qū)(D-loop)序列遺傳多樣性的研究發(fā)現(xiàn)：新疆、內(nèi)蒙古、西藏、云南、寧夏、山東等地區(qū)7個(gè)地方綿羊品種D-loop區(qū)遺傳變異豐富[13-15]。中國(guó)甘肅綿羊群體mtDNA D-loop遺傳多樣性均較貧乏，應(yīng)該對(duì)其遺傳資源進(jìn)行保護(hù)[14]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】河南省綿羊品種包括小尾寒羊、豫西脂尾羊和河南大尾羊。小尾寒羊和豫西脂尾羊都屬于我國(guó)蒙古羊系統(tǒng)[16]，是我國(guó)綿羊良種。豫西脂尾羊是河南古老的地方綿羊品種，分布在豫西、豫南地區(qū),具有產(chǎn)肉性能好、適應(yīng)性廣、抗病力強(qiáng)、耐粗放飼養(yǎng)等優(yōu)良特性。小尾寒羊?yàn)閲?guó)家級(jí)保護(hù)品種，以體型大、生長(zhǎng)快、繁殖率高而聞名。河南大尾羊目前瀕臨絕種，本研究?jī)H發(fā)現(xiàn)極少數(shù)個(gè)體。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】目前對(duì)河南省綿羊品種間遺傳關(guān)系和母系起源尚無(wú)系統(tǒng)研究，因此本研究以河南省3個(gè)綿羊品種作為研究對(duì)象，通過(guò)分析mtDNA D-loop區(qū)全序列研究其遺傳多樣性、遺傳分化和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，揭示品種間的遺傳分化及其起源進(jìn)化，繼而了解它們的遺傳資源狀況，為今后開(kāi)展河南省綿羊品種的保存、種質(zhì)特性研究和開(kāi)發(fā)利用等工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

本研究采集23只小尾寒羊(XW)、40只豫西脂尾羊(YX)和4只河南大尾羊(DW)共67個(gè)個(gè)體的外周血樣本。小尾寒羊采自河南雨軒農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，豫西脂尾羊采自河南省三門峽市澠池縣豫西脂尾羊保種群，依據(jù)品種特性和羊場(chǎng)記錄采集純種個(gè)體。河南大尾羊采自河南省汝州市汝陽(yáng)縣山區(qū)養(yǎng)殖戶。利用EDTA抗凝管頸靜脈采血5 mL，采集血樣置于-20 ℃保存。

1.2 DNA提取和D-loop序列擴(kuò)增及測(cè)序

采用小量全血基因組DNA快速提取試劑盒(艾德萊生物)提取3個(gè)綿羊品種全血DNA，并利用Nanodrop(Thermo Fisher)測(cè)量提取DNA濃度和OD260/280值。將合格DNA稀釋到20 ng/μL。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成綿羊D-loop全序列上游引物F：5′- TCCCTAAGACTCAAGGAAGAAGC-3′和下游引物R：5′- AAGAGTGTGTGCTTGATACCTGC -3′序列[17]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，包括DNA模板(20 ng/μL)1 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL，Taq PCR Master Mix 12.5 μL(1 U Taq Polymerase、5 μmol/L dNTP、0.2 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L KCl、0.03 mmol/L MgCl2)和ddH2O 10.5 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸9 min，4 ℃保存。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)產(chǎn)物大小與目的片段一致，送往生工生物工程(上海)股份有限公司雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

從NCBI上下載五條綿羊序列作為對(duì)照：摩佛倫羊(Ovismusimon)，登錄號(hào)為AY091487；羱羊(Ovisammon),登錄號(hào)為AJ238300；盤羊(Ovisvignei)，登錄號(hào)為AY091490；亞洲型A型和歐洲型B型，登錄號(hào)為AF039578和AF039577。

利用Lasergene軟件包SeqMan軟件拼接雙向序列。利用MEGA6.0軟件比對(duì)67只綿羊的D-loop序列(Align by ClustalW)并截齊序列[18]，基于Kimura 2-parameter模型構(gòu)建ML系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，計(jì)算3個(gè)品種間的遺傳距離[19]。利用DnaSP V5軟件[20]分析3個(gè)綿羊品種D-loop序列的DNA多態(tài)性(單倍型多樣度Hd、核苷酸多樣度Pi等)、基因流和遺傳分化(種群間核苷酸平均差異數(shù)Kxy、核苷酸歧義度Dxy、固定系數(shù)Fst等遺傳學(xué)參數(shù))、Tajima’s檢驗(yàn)和單倍型鑒定?；趩伪缎蛿?shù)據(jù)，利用NETWORK 10.2.0.0軟件(Fluxus Technology Ltd.,Kiel,Germany)構(gòu)建67只小尾寒羊、豫西脂尾羊和河南大尾羊D-loop單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 河南3個(gè)綿羊品種的D-loop序列變異及遺傳多樣性分析

本研究發(fā)現(xiàn)61只綿羊D-loop序列為1376 bp，而2個(gè)小尾寒羊(XW15和XW21)存在75 bp插入，長(zhǎng)度為1451 bp；4個(gè)豫西脂尾羊(YX1、YX14、YX15和YX31)存在75 bp缺失，長(zhǎng)度為1301 bp。小尾寒羊多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為132個(gè)，核苷酸多樣度為0.0230，共定義23個(gè)單倍型，單倍型多樣度為0.975。豫西脂尾羊多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為129，核苷酸多樣度為0.0129，共定義25個(gè)單倍型，單倍型多樣度為0.936。河南大尾羊多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為55個(gè)，核苷酸多樣度為0.0270，共定義3個(gè)單倍型，單倍型多樣度為0.667(表1)。小尾寒羊和豫西脂尾羊單倍型多樣度較高，河南大尾羊單倍型多樣度最低，可能與河南大尾羊數(shù)量稀少有關(guān)。3個(gè)品種無(wú)共享單倍型。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)與遺傳距離分析

基于3個(gè)綿羊品種D-loop序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，ML樹(shù)結(jié)果表明，小尾寒羊、豫西脂尾羊和河南大尾羊聚為三大支(lineage A～C)，lineage A大部分為豫西脂尾羊，為亞洲A型；lineage B大部分為小尾寒羊，為歐洲B型，與摩弗倫羊聚為1支；lineage C大部分為小尾寒羊，為中國(guó)綿羊特有分支(圖1)。羱羊和盤羊?yàn)橥馊?。河南大尾羊穿插于小尾寒羊和豫西脂尾羊中，說(shuō)明河南大尾羊血統(tǒng)不純。遺傳距離分析表明3個(gè)品種間遺傳距離均大于0.02(表2)，達(dá)到亞種間遺傳距離，其中，小尾寒羊和豫西脂尾羊間遺傳距離最遠(yuǎn)，河南大尾羊與小尾寒羊遺傳距離最近。

2.3 遺傳分化和中性檢驗(yàn)

應(yīng)用DnaSP 5.0軟件計(jì)算反映小尾寒羊和豫西脂尾羊種群間基因差異程度的遺傳學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示，3個(gè)品種間固定系數(shù)(Fst)范圍為0.0253～0.4465，遺傳分化系數(shù)(Gst)范圍為0.0226～0.0706(表3)。3個(gè)品種間核苷酸差異數(shù)(Kxy)范圍為30.239～42.934，核苷酸歧義度(Dxy)范圍為0.0241～0.0342(表3)。河南大尾羊和豫西脂尾羊間Kxy和Dxy最高，小尾寒羊和河南大尾羊間最低，說(shuō)明3個(gè)品種間小尾寒羊和豫西脂尾羊、豫西脂尾羊和河南大尾羊間極度分化，核苷酸差異大；小尾寒羊和河南大尾羊間分化很弱，核苷酸差異最小，與遺傳距離結(jié)果一致。采用Tajima’s D方法進(jìn)行中性檢驗(yàn)，小尾寒羊和豫西脂尾羊Tajima’s D中性檢測(cè)為不顯著(P> 0.10)。河南大尾羊顯著偏離中性(P< 0.05)，且Tajima’s D 值為正(表1)，說(shuō)明河南大尾羊近年來(lái)經(jīng)歷過(guò)瓶頸效應(yīng)。

2.4 構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

基于線粒體D-loop序列，對(duì)小尾寒羊和豫西脂尾羊進(jìn)行單倍型網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建，共發(fā)現(xiàn)50個(gè)單倍型和3個(gè)單倍群(A、B、C)，對(duì)應(yīng)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)lineage A～C，Network圖結(jié)果表明河南省綿羊存在3個(gè)母系起源(圖2)。

表1 河南綿羊品種遺傳多樣度

表2 3個(gè)河南省綿羊品種間遺傳距離

圖1 河南省綿羊品種ML系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 The ML phylogenetic tree of Henan sheep breeds

3 討 論

3.1 河南省綿羊品種遺傳多樣性

本研究以3個(gè)河南省綿羊品種小尾寒羊、豫西脂尾羊和河南大尾羊?yàn)檠芯繉?duì)象，研究了河南省3個(gè)綿羊品種遺傳多態(tài)性和遺傳關(guān)系。遺傳多態(tài)性結(jié)果顯示綿羊線粒體D-loop區(qū)的變異除少量的插入/缺失外，6個(gè)個(gè)體出現(xiàn)了75 bp串聯(lián)重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)不同，與之前的研究一致[21]。小尾寒羊群體變異位點(diǎn)132個(gè)，占9.59%；豫西脂尾羊群體變異位點(diǎn)129個(gè)，占9.38%。且2個(gè)綿羊品種單倍型較多，分別存在23和25個(gè)單倍型，單倍型多樣性豐富，核苷酸多樣性豐富，屬于高單倍型多樣性和高核苷酸多樣性的遺傳多樣性模式。這與牛華鋒等[22]的研究結(jié)果一致。小尾寒羊和豫西脂尾羊的遺傳變異必定受到養(yǎng)殖和選育的影響，在群體連續(xù)繁殖過(guò)程中，群體內(nèi)積累了較多的遺傳變異，說(shuō)明選育過(guò)程中的基礎(chǔ)群體種質(zhì)較優(yōu)，遺傳多樣性較高，遺傳改良育種保留了具有優(yōu)良性狀的個(gè)體，發(fā)揮種質(zhì)優(yōu)勢(shì)[23]，證明小尾寒羊和豫西脂尾羊具有較高的進(jìn)化潛力和環(huán)境適應(yīng)力，是優(yōu)質(zhì)的河南省綿羊品種，且沒(méi)有出現(xiàn)種質(zhì)衰退的現(xiàn)象[24-25]。河南大尾羊多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為55個(gè)，較小尾寒羊與豫西脂尾羊少，河南大尾羊單倍型多樣度及定義單倍型數(shù)目(n=2)為3個(gè)品種中最低的，可能與河南大尾羊樣品數(shù)量少有關(guān)。目前河南大尾羊和豫西脂尾羊個(gè)體數(shù)很少，因此開(kāi)展河南大尾羊及豫西脂尾羊的遺傳多樣性研究及品種種質(zhì)資源保護(hù)是非常必要的。

3.2 河南省綿羊品種間的遺傳關(guān)系

本研究基于ML法構(gòu)建小尾寒羊、豫西脂尾羊和河南大尾羊D-loop序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，可見(jiàn)河南大尾羊穿插在小尾寒羊與豫西脂尾羊之間。本次采樣僅采到4只河南大尾羊樣本，證明該品種數(shù)量少，且血統(tǒng)摻雜了小尾寒羊和豫西脂尾羊血統(tǒng)，純種河南大尾羊幾乎絕種。

遺傳距離遺傳距離分析表明3個(gè)品種間達(dá)到亞種間遺傳距離，其中，小尾寒羊和豫西脂尾羊間遺傳距離最遠(yuǎn)，河南大尾羊與小尾寒羊遺傳距離最近，與遺傳分化系數(shù)、核苷酸歧異度、核苷酸差異度及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果一致。該結(jié)果揭示了小尾寒羊、豫西脂尾羊和河南大尾羊間的遺傳距離遠(yuǎn)近。

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)及Network結(jié)果表明豫西脂尾羊和小尾寒羊有少數(shù)個(gè)體互相摻雜，說(shuō)明3個(gè)品種間存在一定的基因交流。20世紀(jì)90年代，河南省多地利用小尾寒羊體型大、生長(zhǎng)速度快、繁殖率高的品種優(yōu)勢(shì)，對(duì)當(dāng)?shù)氐脑ノ髦惭蜻M(jìn)行改良，以提高豫西脂尾羊綜合生產(chǎn)性能[26-27]，因此造成小尾寒羊和豫西脂尾羊間的基因交流，與本研究的基因流結(jié)果一致。

3.3 種群進(jìn)化與種群擴(kuò)張歷史

關(guān)于綿羊的野生祖先，目前還沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的看法。本研究所測(cè)定的河南省家養(yǎng)綿羊3個(gè)品種分為3大支系：支系A(chǔ)占所有個(gè)體的55.23%，支系B占31.34%，支系C占13.43%，并且亞洲A型和歐洲B型分別與支系A(chǔ)和B聚為一類，有研究表明中國(guó)綿羊至少存在三個(gè)母系起源[8,14]。且認(rèn)為第三個(gè)分支C數(shù)量不多[28]，本研究驗(yàn)證了中國(guó)綿羊存在有3個(gè)獨(dú)立的母系起源。聚類圖顯示，摩佛倫羊與其中分支B聚為一類，而羱羊和盤羊單獨(dú)聚為一類這說(shuō)明摩佛倫羊?qū)χ袊?guó)家養(yǎng)綿羊的貢獻(xiàn)較大，而沒(méi)有發(fā)現(xiàn)羱羊和盤羊?qū)χ袊?guó)綿羊的起源有貢獻(xiàn)，這與國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)果一致[6]。

本研究中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，小尾寒羊和豫西脂尾羊的Tajima’s D檢驗(yàn)結(jié)果不顯著，表明該序列在進(jìn)化上遵循中性模型，這2個(gè)綿羊品種在較近的歷史上未經(jīng)歷群體擴(kuò)張及瓶頸效應(yīng)[29]，保持相對(duì)穩(wěn)定的群體規(guī)模。但河南大尾羊Tajima’s D檢驗(yàn)結(jié)果顯著，說(shuō)明河南大尾羊近期經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)，與近期河南大尾羊數(shù)量急劇減少現(xiàn)狀一致，因此有必要加速對(duì)河南大尾羊遺傳資源的研究及保護(hù)。

4 結(jié) 論

本研究基于線粒體D-loop序列，對(duì)小尾寒羊、豫西脂尾羊和河南大尾羊遺傳多樣性及起源進(jìn)化進(jìn)行了研究，得出以下結(jié)論：河南省小尾寒羊、豫西脂尾羊品種遺傳多樣性較豐富；小尾寒羊與河南大尾羊遺傳關(guān)系最近，與豫西脂尾羊關(guān)系最遠(yuǎn)；河南省綿羊品種有3個(gè)母系起源，且摩佛倫羊?qū)幽鲜【d羊起源與進(jìn)化有更大的貢獻(xiàn)。