謝 甜 孫 琳 范 偉 郭時印 肖 航,2 唐忠海,*

(1 湖南農業(yè)大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410000；2 麻省大學阿莫斯特分校食品科學系，美國 馬薩諸塞州 阿莫斯特 01003)

番石榴(PsidiumguajavaL.)是一種重要的水果作物，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，味甜、質地脆，富含多酚[1-2]、黃酮[3]、甾體激素[4]、維生素C、膳食纖維、胡蘿卜素、脂肪和氨基酸等多種活性物質[5]。近年來，人們對番石榴的營養(yǎng)成分、活性成分及藥理作用進行了深入研究，使番石榴在醫(yī)藥和食品領域得到了廣泛的應用[6-7]。

植物多酚是一類廣泛存在于植物體內的具有多元酚結構的次生代謝物，主要存在于植物的皮、根、葉和果中。多酚有多種分類方式[8]，根據分子結構，可將其分為簡單酚類、酚酸類、單寧類、黃酮類、異黃酮類和萘醌類等類型[9]；根據多酚的結合方式可將其分為游離態(tài)多酚(free polyphenols，F(xiàn)P)和結合態(tài)多酚(bound polyphenols，BP)，F(xiàn)P是指通過簡單的有機溶劑萃取就可以獲得的多酚；BP是需先通過化學或酶處理，破壞多酚物質與細胞壁結合的化學鍵，才能分離得到的多酚[10-11]。多酚具有抗氧化[12]、抗癌[13-14]，誘導基因表達[15]、降低血漿脂質氧化產物濃度[16]等作用。紅心番石榴是番石榴的重要品種之一，其游離多酚、結合態(tài)多酚以及總多酚含量較高，抗氧化活性較強[17-20]。

腸道微生物菌群的結構、功能及其產生的生物活性代謝產物對維持人體腸道健康具有重要意義[21]。它們通過發(fā)酵大腸中不可消化的膳食成分，為宿主提供營養(yǎng)和能量，并促進宿主的代謝和免疫系統(tǒng)保持平衡[22]。研究表明，腸道菌群的結構組成受環(huán)境、年齡、生理狀況、飲食等多種因素的影響，會在一定范圍內波動[23]。而失衡的腸道菌群不但會引起消化道的感染、炎癥等疾病，也會極大地增加人體罹患糖尿病、肥胖癥、消化道癌癥等慢性疾病的風險[24-25]。隨著年齡的增長，腸道菌群平衡被打破，有益菌尤其是以革蘭氏陽性菌如雙歧桿菌為主的某些腸道菌群減少，有害菌增加[26]。

目前，針對番石榴結合態(tài)多酚的研究較少[27]。本研究以CD-1小白鼠為研究對象，采用灌胃的方法給予不同劑量的紅心番石榴結合態(tài)多酚，通過16S rRNA基因擴增子測序技術[28-30]，研究結合態(tài)多酚對小鼠腸道菌群結構及多樣性的影響，以期為番石榴結合態(tài)多酚的研究與應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

30只4周齡健康CD-1雄性小鼠，許可證號SYXK(粵)2019-0136，SPF級，每只體重約20～22 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司；紅心番石榴采自福建省漳州市詔安縣。

Nucleo Spin 96 Soi DNA提取試劑盒，德國Macherey Nagel公司；沒食子酸標準品(純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；無水碳酸鈉(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇(色譜純)、福林酚(分析純)，合肥博美生物科技有限責任公司。

1.2 儀器與設備

5424R型臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；Agilent-8453E型紫外可見分光光度計，德國安捷倫科技公司；MK-3酶標儀，上海Thermo Labsystems公司；LC-10ATVP plus高效液相色譜儀，日本島津公司；9700型PCR儀，美國ABI公司；M2e多功能酶標儀，美國Molecular Devices公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 結合態(tài)多酚的提取 參照駱亞麗等[31]的方法，獲得紅心番石榴果渣，即結合態(tài)多酚。

1.3.2 結合態(tài)多酚不同組分分析 采用高效液相色譜-電離子噴霧質譜聯(lián)用(high performance liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry，HPLC-ESI-MS)法對結合態(tài)多酚不同組分進行檢測，將結合態(tài)多酚樣品溶于甲醇溶液，進樣量10 μL，濃度10 mg·mL-1，檢測前樣品溶液過0.22 μm微孔濾膜，使用乙腈-水體系進行梯度洗脫；質譜條件：電噴霧離子源(ESI)，采用負離子模式檢測，使用YMC C18色譜柱，流動相：甲醇(A)/0.1%三氟乙酸水相(B)，流速：1 mL·min-1，檢測波長：280 nm。

對于神話、傳說，咱老百姓就說：“我給你說說這個某某神(鬼)的事兒吧，我給你說說那個某某神(鬼)的事吧?！毕裆裨?、傳說、故事都是書面意義，老百姓們不那么說。耿村一開始還沒被發(fā)現(xiàn)的時候，周邊人說耿村是“笑話村”，后來專家們證實后就改叫“故事村”。再后來大家總是聽過來采訪的人、專家、學者們說講個故事、傳說之類，他們才把“笑話”改成“故事”或者“傳說”。

1.3.3 動物飼養(yǎng) 小鼠飼養(yǎng)于華南農業(yè)大學實驗動物中心，保持溫度26±1℃，晝夜節(jié)律12 h/12 h，正壓通風。小鼠可以自由飲食、飲水，動物房所用的飼料、墊料、鼠籠、飲用水、飲水瓶均經過高溫高壓消毒(121℃，60 min)。

1.3.4 動物試驗 將小鼠分為空白組、高濃度組(500 mg·kg-1)、低濃度組(100 mg·kg-1)，每組10只，共飼養(yǎng)5周，適應期為1周，并按照5只1籠的原則分籠飼養(yǎng)，每5只小鼠將隔天輪轉至不同的籠子里以適應環(huán)境，適應期結束后，將小鼠隨機分組，以最大程度地消除可能存在的母體效應。3組小鼠均食用AIN93G飼料，灌胃期間，分別于灌胃第1、第5、第9、第13、第17、第21、第25、第29天早晨空腹稱重，計算小鼠各生長階段的平均日增重(average daily gain，ADG)[28]。

每天下午4點對小鼠進行灌胃，每只小鼠灌胃4 mL，空白組為無菌水，試驗組為不同濃度的番石榴渣(結合態(tài)多酚)，灌胃2 h之后各組正常飲水，結合態(tài)多酚以無菌水溶解，振蕩搖勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.5 糞便收集 灌胃前一天、灌胃后第2周和灌胃結束當天(第29天)收集新鮮糞便，分裝于無菌離心管內，密封，-80℃凍存。在第5周試驗結束時，將小鼠用濃度為1%(40 mg·kg-1)的戊巴比妥鈉麻醉，每組各收集小鼠糞便30 g以上(每只老鼠不少于3 g)，置于干燥滅菌試管中，于-80℃冰箱保存待測。

1.3.6 樣品處理 取出小鼠糞便樣品解凍，首先用糞便組基因DNA提取試劑盒提取DNA，電泳檢測合格后，選擇基因高變域V3-V4進行PCR擴增。使用酶標儀對PCR產物進行定量，并進行混合。構建文庫后通過Illumina Miseq PE 300平臺進行測序[32]。

1.3.7 生物信息學分析 在0.97相似度下對序列聚類，每個操作分類單元(operational taxonomic units, OTU)代表一個物種，將OTU代表序列進行物種注釋，并與相應的微生物數據庫比對，統(tǒng)計樣本的群落結構，獲得分類信息及相對豐度[33-34]，并通過統(tǒng)計ACE、Shannon等指數對樣本進行α多樣性分析[35-36]，運用主坐標分析法進行β多樣性分析[37]。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 結合態(tài)多酚各組分鑒定

如圖1所示，結合態(tài)多酚中有大量的多酚類物質。通過HPLC-ESI-MS負離子掃描，根據色譜峰的相對分子量、化學式、碎片離子峰，以及文獻中報道的多酚碎片峰信息[38-39]，推測各峰代表的化合物： 1沒食子酸、2鞣花酸、3阿魏酸、4綠原酸、5對香豆酸、6番石榴苷。

圖1 結合態(tài)多酚的反相柱-液相色譜圖譜Fig.1 RP-HPLC spectrum of bound polyphenols

2.2 小鼠體重變化

由表1可知，灌胃組與空白組小鼠的體重差異不顯著(P>0.05)，表明結合番石榴態(tài)多酚不會對正常小鼠的體重造成顯著影響。

表1 結合態(tài)多酚灌胃期間小鼠體重變化(n=10)Table 1 Changes on body weight in mice during administration of bound polyphenols(n=10) /g

2.3 菌群α多樣性分析

反映物種數量即豐富度的指數包括Observed、Chao1和ACE指數。反映物種均勻性的指數包括Shannon和Simpson指數[40-41]。Observed指數越大說明物種越豐富，Chao1和ACE指數的數值大小含義同理。

Shannon與Simpson指數的高低與群落多樣性的高低呈正向關系[42]。Coverage指每個樣本的覆蓋率，代表能檢測到序列的概率，數值越大說明結果越貼近實際情況[43-44]，經分析，3個試驗組的Coverage都在99.9%以上，說明測量結果能準確反映真實情況。

如圖2和表2所示，與空白組相比，低濃度組中菌群的Observed(OTU)指數、Chao1指數、ACE指數、Shannon指數以及Simpson指數均顯著提高(P<0.05)；但在高濃度組中菌群的這五類指數均顯著降低(P<0.05)，說明低濃度組番石榴結合多酚能顯著提高小鼠腸道菌群的豐富度和均勻性，促進α多樣性，相反高濃度組會抑制α多樣性。

表2 α多樣性指數比較Table 2 Comparison of Alpha diversity indexs

注：“0”表示灌胃前期，“1”表示灌胃中期，“2”表示灌胃結束，“Blank”表示空白組，“Low”表示低濃度組，“High”表示高濃度組。下同。Note: ‘0’ means pre-gavage, ‘1’ means mid-gavage, ‘2’ means end of gavage, ‘Blank’ means blank group, ‘Low’ means low concentration group, and ‘High’ means high concentration group. The same as following.圖2 結合態(tài)多酚對小鼠腸道菌群α多樣性的影響Fig.2 The effect of bound polyphenols on Alpha diversity in mice

2.4 菌群β多樣性分析

主坐標分析法(principal coordinates analysis，PCoA)是評估β多樣性的常用方式之一，根據不同的距離算法實現(xiàn)定性數據的定量轉換[36]。因此群落結構相似度高的樣品傾向于聚集在一起，反之則會遠遠分開[37]。

由圖3可知，灌胃組與空白組樣本點分布的區(qū)域在整個試驗過程中(包括適應期)基本都有交集，即灌胃組腸道細菌菌落與空白組無顯著差異，說明結合態(tài)多酚對小鼠腸道菌群群落結構無顯著影響。

注：兩點之間距離越近表明二者的群落構成差異越小。Note: The closer the distance between the two points, the smaller the difference in community composition between the two points.圖3 小鼠糞便微生物菌群主坐標分析Fig.3 The principal coordinates analysis of microbial flora in mice feces

2.5 番石榴結合態(tài)多酚對腸道菌群物種組成的影響

2.5.1 基于門水平上的影響 由圖4可知，各組樣本腸道菌群以厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)5種菌門為主，相對豐度之和在95%以上，其中厚壁菌門、擬桿菌門和疣微菌門3個菌門的相對豐度值最大。另外，由圖5、6可知，比例較高的還有脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、埃普西隆桿菌門(Epsilonbacteraeota)、藍藻門(Cyanobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)及1種未分類擬桿菌門(Patescibacteria)[45]。

圖4 小鼠腸道菌群門水平相對豐度的變化Fig.4 Relative abundance of mice intestinal flora at the phylum level

注:橫坐標的第一個數字1，2，3分別代表灌胃前、中、結束期，第二個數字中的1～6、7～12、13～18分別代表空白組、低濃度組以及高濃度組。Note:The first number 1,2,3 on the abscissa represents the early, middle and end of gavaged administration respectively, and the 1 to 6, 7 to 12, 13 to 18 in the second number represents the blank group, low concentration group and high concentration group namely.圖5 所有樣品腸道菌群門水平的物種相對豐度Fig.5 Species relative abundance of all sample gut microbiota at the phylum level

注：圖中每一列表示一個樣本，每一行表示一個OTU，顏色深度表示OTU中包含的讀取數值，越接近紅色相對豐度越高。Note:Each column in the figure represents a sample, and each row represents an OTU. The colorrepresents the read value containedin the OTU. The closer is to the red, the higher the relative abundance is.圖6 腸道菌群門水平物種豐度聚類圖Fig.6 Species abundance cluster graph of intestinal flora at the phylum level

灌胃結束時，相對于空白組，高濃度組的厚壁菌門的相對豐度下降了19.23%，而低濃度組上升了7.30%。低濃度組和高濃度組擬桿菌門的相對豐度分別下降了1.27%和21.31%。疣微菌門的相對豐度則表現(xiàn)為低濃度組下降了7.66%，高濃度組上升了38.41%，疣微菌門在腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)中起著重要作用，其一些成員具有多糖水解酶活性[46]。低濃度組與高濃度組放線菌門的相對豐度分別上升了1.10%和0.30%；高低濃度組變形菌門的相對豐度分別上升了1.25%和0.20%。綜上所述，番石榴結合態(tài)多酚會導致腸道菌群結構發(fā)生變化，影響門水平菌群的相對豐度。

2.5.2 基于屬水平上的影響 由圖7可知，從小鼠糞便中鑒別出10個門96個屬，主要包括疣微菌門的艾克曼菌屬(Akkermansia)，厚壁菌門的乳桿菌屬(Lactobacillus)，瘤胃菌科(Ruminococcaceae)的未知屬Ruminiclostridium_9，擬桿菌門的擬桿菌屬(Bacteroides)、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、狄氏副擬桿菌(Parabacteroides)，理研菌科(Rikenellaceae)的未知屬Rikenellaceae_RC9_gut_group及另枝菌屬(Alistipes)。其中艾克曼菌屬、乳桿菌屬和擬桿菌屬3個菌屬的相對豐度最高。

圖7 小鼠腸道菌群屬水平相對豐度的變化Fig.7 Relative abundance of mice intestinal flora at thegenus level

與空白組相比，低濃度結合態(tài)多酚處理艾克曼菌屬的相對豐度降低了7.66%，而高濃度組提高了38.41%，艾克曼菌屬屬于新抗癌明星細菌，在增加癌癥免疫治療效果上有非常顯著的作用，其豐度與幾種疾病狀態(tài)呈負相關，如炎癥性腸病、急性闌尾炎、2型糖尿病等[47-51]，有成為下一代益生菌的潛力[52]。大量研究表明，乳桿菌能促進動物生長，調節(jié)胃腸道正常菌群、維持微生態(tài)平衡，具有改善胃腸道功能等多種有益功效[53]，其相對豐度在低濃度組中升高了1.85%，相反在高濃度組降低了2.15%；Tannock[54]和Hughes等[55]研究證明擬桿菌在腸道內的增多會有致癌作用。高、低濃度組擬桿菌屬的相對豐度分別降低了13.69%和7.71%，說明番石榴結合態(tài)多酚能夠調整腸道菌群結構，促進有益菌增長，抑制有害菌增長，且其作用效果與濃度密切相關，高低2種濃度的作用不完全相同。

3 討論

影響腸道菌群構成和平衡的重要外在因素包括分娩方式[56]、膳食類型[57-58]和藥物治療[59]。大量研究表明，番石榴中的總多酚與游離態(tài)多酚[60-62]、番石榴葉提取物[63-64]、番石榴皮及其提取物[65-66]等均對人或小鼠的腸道菌群結構具有調節(jié)作用。除番石榴多酚外，綠茶多酚也會對小鼠腸道菌群結構產生一定的調節(jié)作用[67]。

多酚類物質作為功能性物質[68]，可通過為腸道內微生物提供代謝底物及自身特性的發(fā)揮抑制腸道內有害菌群的生長，減少致病菌帶來的毒性[69-70]；同時，多酚類物質可以抑制部分酶的活性，進而影響腸道內的一系列酶化反應[71]。本研究在已有對番石榴總多酚與游離態(tài)多酚對腸道菌群的影響的研究基礎上，對結合態(tài)多酚的作用進行了研究。采用16S rRNA基因擴增子測序技術，統(tǒng)計小鼠腸道菌群菌落結構的分類信息及相對豐度，證明番石榴結合態(tài)多酚雖對小鼠腸道菌群的群落結構無顯著影響，但能顯著提高小鼠腸道菌群的豐富度和均勻性，促進α多樣性，調整腸道菌群結構，如改變厚壁菌門、擬桿菌門、疣微菌門、變形菌門、放線菌門5種優(yōu)勢菌門的相對豐度，提高有益菌艾克曼菌屬、乳桿菌屬的相對豐度，降低有害菌擬桿菌屬的相對豐度，改善腸道健康。游離態(tài)多酚作用已有文獻記載[72-73]，可見番石榴總多酚中的兩大成分均對小鼠腸道菌群結構具有調節(jié)作用。同時不同濃度的番石榴結合態(tài)多酚的作用不完全相同，如低濃度能顯著提高小鼠腸道菌群豐富度，高濃度卻無顯著作用；低濃度會降低有益菌艾克曼菌屬的相對豐度，高濃度則提高該菌屬相對豐度。該結果顯示，番石榴結合態(tài)多酚的濃度與其實際調節(jié)作用有著密切關系，過高過低都可能會造成不利的影響，后期研究應擴大番石榴結合態(tài)多酚濃度范圍及給藥樣本量，進一步考察不同濃度的作用。

4 結論

本研究通過16S rRNA基因測序技術，分析番石榴結合態(tài)多酚對小鼠腸道菌群結構及多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)番石榴結合態(tài)多酚對小鼠腸道菌群的豐富度和均勻性有明顯促進作用，且對菌群結構具有調節(jié)作用，既能提高益生菌比例，也能降低有害菌比例。另外，不同濃度番石榴結合態(tài)多酚對同一菌種造成的影響可能相同也可能相反，過高過低都可能會造成不利的影響。后期研究需進一步考察更大范圍濃度對小鼠腸道菌群的調節(jié)作用，并探討其在降低血糖、血脂等方面的作用。