鐵原毓 田 潔,2,*

(1 青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院/青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室，青海 西寧 810016；2 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海 西寧 810016)

植物中果聚糖作為由蔗糖與一個或多個果糖基連接成的寡糖或多糖，不僅是許多高等植物營養(yǎng)器官中重要的水溶性碳水化合物，還是一種滲透調(diào)節(jié)劑。果聚糖的解聚能釋放可溶性果糖，以調(diào)節(jié)細胞滲透壓，從而提高植物細胞抵御逆境的能力[1]。研究表明，果聚糖作為一種新興的抗氧化劑，其代謝過程不僅影響植物的生長發(fā)育，還能夠通過穩(wěn)定膜系統(tǒng)保護植物免受冰凍或干旱脅迫[2-3]。因此，研究果聚糖合成相關(guān)基因，明確基因功能，對揭示植物抗逆機制具有重要意義。

蔗糖:蔗糖1-果糖基轉(zhuǎn)移酶(sucrose: sucrose 1-fructosyltransferase, 1-SST)作為植物果聚糖生物合成過程中的關(guān)鍵酶，通過將一個蔗糖分子上的果糖基轉(zhuǎn)移到另一個蔗糖分子上，催化形成一個果聚三糖(1-蔗果三糖)和一個葡萄糖分子，使果聚糖開始合成[4]。另外，1-SST作為果聚糖合成途徑中關(guān)鍵的第一步，對β(2-1)鍵連接的菊糖型果聚糖新生系列的合成具有重要的催化作用[5]。近年來，關(guān)于果聚糖合成相關(guān)基因功能的研究已經(jīng)取得了一定進展，如小麥[6-7]、洋蔥[8]、華山新麥草[9]、蘆筍[10]、菊芋[11]等植物的1-SST基因已被克隆并進行序列分析。研究表明，1-SST基因在植物合成果聚糖及抵御非生物脅迫中具有重要意義[12-14]，如在冬小麥中過表達1-SST基因可以提高轉(zhuǎn)基因植株的耐寒性[15]；煙草中過表達萵苣1-SST基因，明顯增加了轉(zhuǎn)基因煙草果聚糖的積累，從而提高了植株耐旱性[16]。

大蒜(AlliumsativumL.)又名蒜、胡蒜，百合科蔥屬二年生草本植物，是世界范圍廣泛栽培的藥食兼用蔬菜[17]。大蒜喜好冷涼環(huán)境，但青海高原地區(qū)獨特的低溫、干旱等氣候通常使植物遭受環(huán)境因素的脅迫傷害，導(dǎo)致大蒜幼苗生長發(fā)育受到抑制[18-19]。而果聚糖作為大蒜中干物質(zhì)含量最高的貯存物質(zhì)[20]，能夠在逆境脅迫下通過調(diào)節(jié)細胞滲透壓以提高植物抵御低溫、干旱等逆境的抗性，但關(guān)于1-SST基因參與大蒜響應(yīng)逆境過程的研究卻鮮有報道。目前大蒜基因組已測序完成[21]，但尚未公布1-SST基因相關(guān)注釋信息，其生物學(xué)功能也鮮見相關(guān)文獻報道。本研究以樂都紫皮大蒜為試驗材料，對1-SST基因進行克隆和生物信息學(xué)分析，并研究該基因在不同組織、不同脅迫處理下的表達規(guī)律，旨在為進一步解析大蒜1-SST基因在高原逆境脅迫下的響應(yīng)機理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料樂都紫皮大蒜播種于含栽培基質(zhì)(草炭∶珍珠巖=1∶1)的盆缽中，在青海省農(nóng)林科學(xué)院園藝所植物光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：25℃/15℃(14 h/10 h，白天/黑夜)，相對濕度70%。培養(yǎng)至大蒜植株長出2～3片葉，且苗高10 cm左右時，選取長勢一致、健壯的幼苗，每個處理選取3株。進行如下處理：

(1)對照：培養(yǎng)條件不變，25℃/15℃ (14 h/10 h，白天/黑夜)，相對濕度70%，期間正常澆水；

(2)低溫脅迫處理：4℃/4℃ (14 h/10 h，白天/黑夜)，相對濕度70%，期間正常澆水；

(3)干旱脅迫處理：25℃/15℃ (14 h/10 h，白天/黑夜)，參照前期研究[22]通過停止?jié)菜M行人工控水，保持空氣相對濕度30%，通過烘干稱重法[23]控制土壤相對濕度在45%～55%。

低溫和干旱脅迫處理時間分別為0、4、12、24 h和0、1、3、9 d，每個處理3次重復(fù)。分別取大蒜根、假莖、葉片和鱗芽各0.5 g，立即用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆?，用于RNA的提取以及cDNA的合成。

總RNA提取試劑 (TRNzol Universal, DP424)、大腸桿菌菌種DH5α，北京天根生化科技有限公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒及引物，上海生工生物工程有限公司；質(zhì)粒載體pMD19-T Vector Cloning Kit，大連TaKaRa公司；高保真酶 (Unique HiQTMPfu DNA Polymerase)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (HonorTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR)和熒光定量試劑盒 (Unique AptamerTMQpcr SYBR?Green Master Mix)，北京諾禾致源科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 將經(jīng)過低溫和干旱脅迫處理的不同時期大蒜根、假莖、葉片和鱗芽材料利用TRNzol Universal總RNA提取試劑提取總RNA，通過HonorTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒將大蒜根、假莖、葉片及鱗芽總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.2 大蒜As-1-SST基因的克隆 根據(jù)課題組建立的大蒜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(未公布)，檢索得到蔗糖：蔗糖1-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列。設(shè)計一對克隆引物As-1-SST-F (5′-A T G T C T T C C G A T G A C C T A G A A T C A C C-3′)和As-1-SST-R (5′-T C A C A T C A T G C T G G T A G C A G G A T-3′)，以樂都紫皮大蒜鱗莖cDNA為模板進行擴增。PCR反應(yīng)體系：2×Unique HiQTM PCR Buffer 25 μL，模板cDNA 1 μL，PfuDNA聚合酶1 μL，上下游引物各2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸150 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳回收，與pMD19-T載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，陽性克隆送至北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.2.3 序列分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得洋蔥等其他植物的1-SST序列。利用DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對和蛋白質(zhì)疏水性/親水性分析；采用ExPaSy(https://web.expasy.org/protparam/)軟件分析氨基酸基本成分、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量和等電點；采用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和Softberry (http://linux1.softber-ry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)在線軟件分別預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域和亞細胞定位。利用SOPMA軟件分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu) (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)；通過Phyre 2軟件預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu) (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)。使用NCBI中的BLASTP (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線比對，預(yù)測As-1-SST蛋白質(zhì)保守區(qū)。使用MEGA6.0對系統(tǒng)進化樹進行測試和編輯，生成報告圖形。

1.2.4 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)按照試劑盒操作說明在Roche LightCycler?480 Ⅱ(Roche，美國)上進行。以大蒜CYP基因為內(nèi)參基因，其引物為CYP-F: 5′-A A G G A C G A G A A C T T C A T C-3′，CYP-R: 5′-T C A A T A T C T C T C A C C A C T T C-3′。根據(jù)克隆得到的果聚糖合成酶基因序列設(shè)計表達檢測引物1-SST-F: 5′-T C G G G T A T G T G G G A A T G T-3′和1-SST-R: 5′-T G G T C G C T C A A A G T A T C G-3′，目的基因與內(nèi)參基因一起擴增。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以大蒜CYP基因作為定量表達分析的內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜果聚糖合成酶基因As-1-SST的克隆

以樂都紫皮大蒜的鱗莖cDNA為模板，分別以As-1-SST-F和As-1-SST-R作為上游和下游引物，PCR擴增后得到1條長度約為2 000 bp的片段(圖1)。測序結(jié)果表明，As-1-SST基因編碼序列(coding sequences, CDS)全長為1 872 bp，編碼623個氨基酸(圖2)。將該基因序列上傳至GenBank，獲得登錄號為MW767832。

注：M: DNA分子量標準(2 000 bp)。Note: M: DNA marker(2 000 bp).圖1 大蒜As-1-SST基因的RT-PCR擴增Fig.1 As-1-SST gene amplified by RT-PCR from garlic

注：*: 終止密碼子。Note: *: Stop codon.圖2 大蒜As-1-SST基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequences and predicted amino acid sequences of As-1-SST gene from garlic

2.2 大蒜As-1-SST蛋白的理化性質(zhì)分析

ExPaSy-ProtParam預(yù)測結(jié)果表明As-1-SST蛋白分子式為C3168H4790N812O929S20，分子量為69 756.97 Da，理論等電點為5.19，親水性平均系數(shù)為-0.195，是一個穩(wěn)定性蛋白(不穩(wěn)定系數(shù)為36.64)；SignaIP 3.0 Server預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白無信號肽，不屬于分泌型蛋白；TMHMM預(yù)測該蛋白有一個跨膜螺旋區(qū)，其位置在39～40(圖3)；As-1-SST蛋白的亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表明，該蛋白定位于液泡的可能性較大。

圖3 大蒜As-1-SST蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測Fig.3 Prediction of the transmembrane domain of As-1-SST protein

2.3 大蒜As-1-SST的氨基酸親水性和疏水性預(yù)測

通過DNAMAN 7.0對大蒜As-1-SST基因推導(dǎo)的氨基酸序列進行親水性/疏水性分析。結(jié)果表明(圖4)，該蛋白的第366位賴氨酸(Lys)親水性最強；疏水性最強的位點為第41位的亮氨酸(Leu)，其次為第32位的亮氨酸(Leu)。

圖4 大蒜As-1-SST氨基酸序列的親水性和疏水性分析Fig.4 Analysis of hydrophilcity and hydrophobicity of amino acid sequences of As-1-SST from garlic

2.4 大蒜As-1-SST的蛋白結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA對As-1-SST蛋白進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果如圖5-A所示。As-1-SST的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(15.27%)、延伸結(jié)構(gòu)(23.63%)、β-轉(zhuǎn)角(4.66%)和無規(guī)則卷曲(56.43%)構(gòu)成。利用Phyre 2軟件進行同源建模，并通過PyMOL軟件分析蛋白三級結(jié)構(gòu)(圖5-B)，結(jié)果顯示As-1-SST蛋白模型構(gòu)建基于模板c3ugfB(富貴草6-SST/6-SFT)，可信度100%，覆蓋率85%，且大蒜As-1-SST蛋白的三維結(jié)構(gòu)由6個α-螺旋和34個β-折疊所構(gòu)成。

圖5 As-1-SST蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Secondary and tertiary structure prediction of As-1-SST protein

2.5 大蒜As-1-SST的保守域分析與同源性序列比對

在NCBI保守域數(shù)據(jù)庫中將大蒜As-1-SST的氨基酸序列進行BLAST比對(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，由圖6可知，As-1-SST包含2個糖苷水解酶32(GH32)家族的特異位點，且其N-端Pfam攜帶糖苷水解酶的5個葉片β-螺旋結(jié)構(gòu)域，表明As-1-SST屬于糖苷水解酶32(GH32)家族。

圖6 大蒜As-1-SST氨基酸序列保守域預(yù)測Fig.6 Prediction of conserved domain and amino acid sequences of As-1-SST from garlic

將大蒜As-1-SST氨基酸序列分別與洋蔥(AlliumcepaL., CAA06838.1)、太匱龍舌蘭(AgavetequilanaL., ABG00265.1)、蘆筍(AsparagusofficinalisL., BAM66575.1)、菊芋(HelianthustuberosusL., CAA08812.1)、菊苣(CichoriumintybusL., AAB58909.1)、高粱(SorghumbicolorL. Moench, XP_021314410.1)、洋薊(Cynaracardunculusvar. scolymus, CAA70855.1)、高羊茅(Loliumarundinaceum, CAC05261.1)、掃帚黍(Dichantheliumoligosanthes, OEL25428.1)、糜子(PanicummiliaceumL., RLN09014.1)、藥用蒲公英(Taraxacumofficinale, CAB60153.1)、小米(SetariaitalicaL. Beauv., XP_004951208.1)、黑麥草(LoliumperenneL., AAO86693.1)、大麥(HordeumvulgareL., AFP72238.1)、黑麥(SecalecerealeL., AFK29572.1)、普通小麥(TriticumaestivumL., BAB82470.1)和硬粒小麥(Triticumturgidumsubsp. Durum, ACH73196.1)等植物的1-SST氨基酸序列進行多重比較分析(圖7)，序列比對的一致性達到64.80%，大蒜As-1-SST氨基酸序列與這17個物種具有較高的同源性，表明不同物種的1-SST氨基酸序列的保守性較高，但在長度和氨基酸組成上存在差異性。結(jié)果表明，不同物種1-SST蛋白都具有糖基水解酶32家族的保守結(jié)構(gòu)域，其中大蒜As-1-SST蛋白β-果糖苷酶基序(NDPNG)中N和G存在變異，RDP、EC結(jié)構(gòu)域與其他已報道物種1-SST蛋白結(jié)構(gòu)域完全一致。

注：加紅色邊框部分表示3個保守區(qū)域。Note: The red boxes indicate the three conserved regions.圖7 大蒜As-1-SST與其他植物1-SST氨基酸序列的多重比對Fig.7 The alignment of amino acid sequences of 1-SST from garlic and other plant species

對大蒜和其他植物的1-SST氨基酸序列進行理化性質(zhì)分析。由表1可知，這些植物中的1-SST氨基酸殘基數(shù)為621～677個，相對分子質(zhì)量為69.55～73.42 kDa，理論等電點在4.87～5.92之間，酸性氨基酸比例(包括天冬氨酸和谷氨酸)總體略高于堿性氨基酸(包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸)，脂肪族氨基酸比例相對較高，而芳香族氨基酸比例較低，不同氨基酸序列理化性質(zhì)存在差異。

表1 不同植物的1-SST氨基酸組成及理化性質(zhì)分析Table 1 Analysis of amino acid composition and physicochemical properities of 1-SST from different plants

2.6 大蒜As-1-SST的進化樹分析

利用MEGA6.0軟件中的Neighbor-Joining法將大蒜與其他17種不同植物的1-SST構(gòu)建同源進化樹(圖8)。結(jié)果顯示，大蒜As-1-SST與百合科的洋蔥、石蒜科的太匱龍舌蘭和天門冬科的蘆筍1-SST在進化上屬于同一個分支，且與同科同屬的洋蔥在進化關(guān)系上最為接近。而禾本科中普通小麥、硬粒小麥、黑麥、大麥、高羊茅、黑麥草、高粱、掃帚黍、糜子、小米的1-SST屬于同一個分支，洋薊、菊芋、菊苣和藥用蒲公英的1-SST同屬于菊科分支。

圖8 As-1-SST氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.8 Phylogenetic tree of As-1-SST amino acid sequence

2.7 大蒜As-1-SST基因在不同組織和逆境條件下的表達分析

通過qRT-PCR對As-1-SST基因在樂都紫皮大蒜不同組織中的表達模式進行分析。結(jié)果表明(圖9)，在正常條件下As-1-SST基因在大蒜根、假莖、葉片和鱗芽中均有表達，其中，在根中表達水平最高，其次是假莖，在鱗芽和葉片中表達水平較低。

注：不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level. The same as following.圖9 As-1-SST基因在大蒜不同組織中的相對表達水平Fig.9 Relative expression levels of As-1-SST gene in different garlic tissues

為了進一步研究As-1-SST基因?qū)Ω咴婢趁{迫的響應(yīng)，對低溫和干旱脅迫下的大蒜根、假莖、葉片及鱗芽進行qRT-PCR分析。由圖10可知，低溫和干旱脅迫均可以顯著誘導(dǎo)或抑制As-1-SST基因的表達。

注：A, E:根; B, F:假莖; C, G:葉片; D, H:鱗芽。Note: A, E: Root. B, F: Pseudostem. C, G: Leaf. D, H: Scale bud.圖10 低溫和干旱脅迫下As-1-SST基因的相對表達水平Fig.10 Relative expression levels of As-1-SST gene under low temperature and drought stress in garlic

低溫脅迫處理下，大蒜As-1-SST基因在根中的表達水平與處理0 d相比顯著降低，且處理4 h時的表達量僅為對照的19.30%；相反，As-1-SST在假莖、葉片和鱗芽中的表達量均顯著高于對照條件下該基因的表達量。低溫培養(yǎng)過程中，假莖的As-1-SST表達量隨低溫處理時間延長呈“升-降-升”的變化趨勢，且低溫處理4、12和24 h時的表達量顯著高于對照，分別為對照的5.75、7.20和1.79倍；葉片中As-1-SST的表達隨低溫處理時間延長呈先升后降的變化趨勢，表達量在低溫處理4、12和24 h時均顯著高于對照，且在12 h達峰值，為對照的6.77倍；As-1-SST在鱗芽中的表達量在低溫處理4 h迅速升高，并保持在較高水平，至24 h時升至最高，為對照的17.37倍。可知低溫脅迫顯著提高了大蒜假莖、葉片及鱗芽中As-1-SST的表達水平，從低溫處理4 h開始，脅迫能夠誘導(dǎo)大蒜假莖、葉片、鱗芽進行果聚糖的合成。

與低溫處理相比，大蒜各組織As-1-SST對干旱脅迫的響應(yīng)差別明顯。整個處理過程中，除了大蒜鱗芽，其他組織的As-1-SST表達量從未顯著高于對照。隨著干旱脅迫處理時間的延長，大蒜As-1-SST基因在根和假莖中的表達量呈先升后降的趨勢但整體均顯著低于0 d。干旱脅迫1 d時，As-1-SST在根中的表達量最低，為對照的16.74%；干旱脅迫3 d時As-1-SST在假莖中的表達量最低，為對照的14.45%。在葉片中，As-1-SST的表達雖然隨干旱脅迫處理時間延長呈先升后降的變化趨勢，但其表達量除在1 d時與對照無顯著差異外，其余均顯著低于對照。與以上大蒜組織不同，干旱能夠提高鱗芽的As-1-SST表達水平。As-1-SST在鱗芽中的表達隨干旱脅迫處理時間延長呈“降-升-降”的變化趨勢，干旱脅迫3 d時表達量最高，為對照的5.52倍；而干旱脅迫1和9 d時表達量與對照無顯著差異。可知As-1-SST對于干旱脅迫的響應(yīng)具有明顯的組織特異性，干旱處理對大蒜鱗芽中As-1-SST的誘導(dǎo)更加明顯。

3 討論

生長在青藏高原的園藝作物，經(jīng)常會遭受低溫、干旱等多種不利環(huán)境因素的脅迫，引起植物組織脫水、細胞膜功能異常、電解質(zhì)滲漏等現(xiàn)象，逆境最終導(dǎo)致植物減產(chǎn)、局部傷害或全株死亡[24-25]。青海地處青藏高原，氣候冷涼，具有大蒜生長及干物質(zhì)積累的良好氣候優(yōu)勢[18]。然而青海春季干旱和凍害的頻繁發(fā)生，導(dǎo)致淺根作物大蒜的生長發(fā)育受到嚴重影響。果聚糖作為大蒜中干物質(zhì)含量最高的貯存物質(zhì)，是大蒜產(chǎn)量形成的關(guān)鍵因素，同時作為一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，果聚糖的積累有利于增強植物的抗旱及抗寒能力[26-27]。1-SST作為果聚糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，在植物果聚糖合成中起重要調(diào)控作用。因此，研究1-SST不僅有利于闡明植物果聚糖合成相關(guān)基因表達水平及其抵御逆境脅迫的分子機制，也對改善高原逆境下大蒜植株的生存能力具有實際生產(chǎn)意義。

本研究從大蒜中克隆獲得一個果聚糖合成關(guān)鍵酶基因As-1-SST，其CDS全長為1 872 bp，編碼623個氨基酸，分子量為69.76 kDa，理論等電點為5.19。亞細胞定位預(yù)測As-1-SST蛋白定位于液泡的可能性較大，其在細胞中具體位置需進一步試驗證明。與其他物種氨基酸序列比對后發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的As-1-SST蛋白N端差異比較明顯，但C端保守性較高，說明不同植物的1-SST蛋白功能存在一定的相似性和專一性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)大蒜As-1-SST蛋白的NDPNG發(fā)生了2次變異，由GDPNA組成，這與Tita等[28]的研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)洋蔥的1-SST由ADPNA組成，說明β-果糖苷酶基序(NDPNG)在果糖基轉(zhuǎn)移酶中通常是可變的。保守域分析顯示As-1-SST基因所推導(dǎo)的氨基酸屬于糖苷水解酶32(GH32)家族。系統(tǒng)進化分析表明，大蒜As-1-SST氨基酸序列與百合科同屬的洋蔥親緣關(guān)系最近，同源性高達90.69%；其次是石蒜科的龍舌蘭和天門冬科的蘆筍，說明同起源于百合目的物種之間遺傳距離較近。此外，大蒜As-1-SST氨基酸序列與禾本科、菊科等物種的1-SST氨基酸序列處于不同分支，說明不同物種1-SST基因功能可能存在一定的再分化。因此，克隆大蒜As-1-SST基因為后續(xù)基因功能驗證研究提供了理論基礎(chǔ)。

目前，已經(jīng)從多種植物中克隆了與果聚糖合成相關(guān)的1-SST等基因，并發(fā)現(xiàn)這些基因在植物抗逆過程中的功能。低溫脅迫下，積累了更多果聚糖的黑麥草植物在細胞水平上具有更高的耐凍性[29]。干旱脅迫下，高產(chǎn)果聚糖甜菜株系中1-SST基因表達水平顯著上調(diào)，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量上升，顯著提高了植株抗旱性[30]。此外，研究表明同一基因在不同組織中的響應(yīng)逆境的表達量差異顯著[31]。張園等[10]研究蘆筍(AsparagusofficinalisL.)成株花期不同器官的1-SST基因表達結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在果聚糖積累和合成運輸部位，Ao1-SST基因的表達量最高。在龍舌蘭植物中，低聚果糖主要積累于葉組織，而高聚果糖主要在莖中積累[32]。上述研究表明，1-SST基因可能在不同植物抗逆過程中均發(fā)揮重要作用，然而有關(guān)大蒜中1-SST基因響應(yīng)逆境脅迫的研究鮮見報道。本研究為了進一步研究大蒜各組織以果聚糖為主要貯藏物質(zhì)的分子機制，對高原逆境脅迫下As-1-SST基因在不同組織的響應(yīng)情況進行qRT-PCR分析，結(jié)果表明在低溫脅迫和干旱脅迫下該基因在根、假莖、葉片、鱗芽等不同組織中的響應(yīng)存在差異；低溫脅迫4 h時，能夠誘導(dǎo)大蒜除根部以外的大部分組織進行果聚糖的合成，其中該基因在葉片中的表達量是對照的9.17倍，這可能與大蒜在低溫脅迫下，葉片最先做出響應(yīng)有關(guān)；然而，干旱脅迫只顯著提高了大蒜鱗芽中As-1-SST的基因表達量，在脅迫3 d時達到最高，為對照的5.52倍，說明As-1-SST對于干旱脅迫的響應(yīng)具有明顯的組織特異性。綜上可知，As-1-SST基因在大蒜抵御高原逆境脅迫過程中發(fā)揮較大作用，本研究為進一步探討該基因如何具體調(diào)控大蒜抗寒和抗旱機制提供了參考。

4 結(jié)論

大蒜As-1-SST基因全長1 872 bp，編碼623個氨基酸，屬于糖苷水解酶32(GH32)家族，與百合科洋蔥親緣關(guān)系最接近。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，As-1-SST在根中表達最高，其次是假莖，在鱗芽和葉片中表達水平較低，具有明顯的組織特異性；且在低溫脅迫和干旱脅迫下該基因在不同組織中響應(yīng)存在差異，低溫處理4 h時顯著提高了假莖、葉、鱗芽中As-1-SST的表達，干旱處理對大蒜鱗芽中As-1-SST的誘導(dǎo)則更加明顯，說明As-1-SST基因可能在大蒜抵御低溫干旱脅迫的過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但其具體抗逆作用機制還有待進一步研究。