岳寧波 李玉龍 孫一凡 潘鵬程 潘寅濤 鄭 寅 李云洲,* 梁 燕

(1 貴州大學農(nóng)學院，貴州 貴陽 550025；2 西北農(nóng)林科技大學園藝學院，陜西 楊凌 712100；3 西北農(nóng)林科技大學資源與環(huán)境學院，陜西 楊凌 712100；4 貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025)

番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)屬于雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)，嚴重威脅番茄等茄科作物的安全生產(chǎn)[1]。TYLCV主要通過粉虱(Bemisiatabaci)咬食傳播病毒[2-4]。該病毒基因組屬于單鏈DNA(single strand DNA，ssDNA)，易發(fā)生變異。最先報道于1959年以色列約旦河谷，于1964年被正式命名為Tomatoyellowleafcurlvirus，2000年前后傳入我國，2009年在我國番茄主產(chǎn)區(qū)大面積爆發(fā)。

目前栽培番茄中不含有抗TYLCV基因，所有抗TYLCV品種抗性基因均來源于野生番茄材料[5]。已報道的抗TYLCV標記基因包括Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4、Ty-5和Ty-6，其中Ty-2來源于多毛番茄(Solanumhabrochaites),Ty-1、Ty-3、Ty-4和Ty-6來源于智力番茄(Solanumchilense)，Ty-5來源于秘魯番茄(Solanumperuvianum)[6-10]。其中Ty-1和Ty-3是一對等位基因，在番茄抗病育種中應(yīng)用較廣[7-8, 11-14]。Ty-1/Ty-3編碼RNA依賴型RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerases，RDR)，但Ty-1/Ty-3如何抵抗病毒仍有待研究。

植物抗病毒復(fù)制主要通過RNA干擾(RNA interference，RNAi)，參與RNAi機制的蛋白主要有三類，核糖核酸內(nèi)切酶類蛋白(Dicer-like，DCL)、AGO(Argonaute)、RDR。RNAi過程可分為三個階段：1)DCL將雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)剪切加工成21～24 nt的小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)；2)RDR將siRNA重新反轉(zhuǎn)錄成dsRNA，新合成的dsRNA再次經(jīng)過DCL剪切形成更多的次級siRNA；3)AGO與siRNA結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC通過堿基互補配對的方式結(jié)合與siRNA匹配的靶標基因或病毒序列，并將其進行降解，上述三個階段中第一階段至關(guān)重要[15]。目前已有研究表明，擬南芥中的DCL2(AtDCL2)和DCL4(AtDCL4)在抗病毒中發(fā)揮重要作用，在擬南芥DCL2、DCL4突變體dcl2、dcl4中，病毒大量累積[16]，由此可知DCL在RNAi過程的第一階段中發(fā)揮重要作用[17]。

番茄中已經(jīng)鑒定出的DCL基因有7個，分別為SlDCL1、SlDCL2a/b/c/d(SlDCL2)、SlDCL3和SlDCL4[18]，其中SlDCL2、SlDCL4分別與擬南芥AtDCL2和AtDCL4同源，推測其功能相似。為了明確番茄SlDCL2和SlDCL4在Ty-1/Ty-3抗TYLCV中的作用，本研究以攜帶Ty-1/Ty-3抗性基因的Y9番茄為材料，通過病毒誘導(dǎo)基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)技術(shù)，分析番茄RNAi通路關(guān)鍵基因SlDCL2和SlDCL4在Ty-1/Ty-3介導(dǎo)的抗TYLCV中的功能，旨在為番茄應(yīng)用Ty-1/Ty-3抗病育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用番茄材料Y19來自西北農(nóng)林科技大學園藝學院番茄種質(zhì)創(chuàng)新實驗室；TRV1、TRV2載體來自耶魯大學Dr. Dinesh-Kumar實驗室；TRV2∶SlPDS來自西北農(nóng)林科技大學植物保護學院劉同先實驗室；大腸桿菌DH5α及農(nóng)桿菌GV3101來自貴州大學植物病理實驗室；TYLCV侵染性克隆引自中國農(nóng)業(yè)大學植物保護學院周濤實驗室。KpnⅠ、XbaⅠ限制性內(nèi)切酶購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，Taq聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit)、SYBR Master mix(2×)購自南京諾維贊生物科技有限公司，RNA提取試劑(TRIzol)、卡那霉素、利福平、乙酰丁香酮等購自上海生工生物工程(中國)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 VIGS載體構(gòu)建 以Y19生長點幼葉片為材料，利用TRIzol法提取總RNA，去除DNA后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，存于-80℃?zhèn)溆?。從https://solgenomics.net/網(wǎng)站獲取番茄SlDCL2a/b/c/d、SlDCL4的基因序列，利用VIGS-tool在線軟件篩選SlDCL2a/b/c/d、SlDCL4的特異性片段SlDCL2和SlDCL4，用Primer Premier 5.0設(shè)計特異性引物，根據(jù)VIGS載體添加酶切位點(表1)，擴增SlDCL2和SlDCL4基因片段。將擴增的SlDCL2和SlDCL4靶標基因片段膠回收試劑盒回收后，連接于pMD-18T載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(DH5α)感受態(tài)細胞中，涂布于含卡那霉素的LB固體平板進行生長，通過PCR鑒定挑選陽性克隆提取質(zhì)粒，測序成功后，用KpnI 和XbaI雙酶切pMD-18T-SlDCL2、pMD-18T-SlDCL4及pTRV2載體。膠回收SlDCL2片段、SlDCL4片段、TRV2的雙酶切產(chǎn)物，將SlDCL2片段、SlDCL4片段分別與TRV2雙酶切產(chǎn)物用T4連接酶(上海生工)連接，16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(DH5α)后進行菌落PCR，挑選陽性克隆并提取重組質(zhì)粒，酶切驗證重組質(zhì)粒連接正確后，通過凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(GV3101)中，加入30%滅菌甘油儲藏于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 VIGS沉默接種方法 分別將含有TRV1、TRV2-SlDCL2、TRV2-SlDCL4、TRV2∶SlPDS重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，在含利福平(Rif)25 mg·L-1、卡那霉素(Kan)50 mg·L-1、慶大霉素(Gen)50 mg·L-1的LB固體培養(yǎng)基中活化，然后挑取單菌落在液體LB培養(yǎng)基(25 mg·L-1Rif+50 mg·L-1Kan+50 mg·L-1Gen)中培養(yǎng)36～48 h(OD600=0.8～1.0)，低速離心(5 000 r·min-1)5 min，棄上清，誘導(dǎo)培養(yǎng)基[10.5 g·L-1K2HPO4+4.5 g·L-1KH2PO4+10.5 g·L-1(NH4)2SO4+10.5 g·L-1檸檬酸鈉+1.0 mmol·L-1MgSO4+0.2%(w/v)葡萄糖+0.5%(v/v)+10 mmol·L-1嗎啉乙磺酸(4-morpholineethanesulfonic acid，MES)+50 μmol·L-1乙酰丁香酮]重新懸浮，調(diào)制OD600=0.8～1.0，將含有TRV1農(nóng)桿菌分別與含有TRV2-SlDCL2、TRV2-SlDCL4、TRV2-SlPDS農(nóng)桿菌按照1∶1進行混合，室溫放置3 h，通過1.0 mL注射器接種植株葉片，每個植株接種3次，每次接種1 mL[19]，將含有TRV空載體的農(nóng)桿菌接種植株(TRV∶00)和接種農(nóng)桿菌的植株(對照)分別作為對照。

1.2.3 沉默效率檢測 通過實時定量PCR技術(shù)(quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR)分析SlDCL2、SlDCL4沉默效率[20-21]，VIGS接種后采集生長點葉片0.1 g，TRIzol提取總RNA，DNA酶(DNase)祛除DNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，SlDCL2和SlDCL4定量引物qSlDCL2-F/R、qSlDCL4-F/R見表1，將β-Actin作為內(nèi)參基因[21]，使用CFX96TMReal-Time System熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)進行定量檢測。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15s，60℃退火15s，40個循環(huán)；95℃變性10 s，65℃退火10s，95℃延伸5s；反應(yīng)體系20 μL，每個處理15～20株，采集樣品隨機選至少3株。

1.2.4 Y19抗TYLCV標記基因Ty-1/Ty-3檢測 提取Y19番茄幼苗總DNA，Ty-1/Ty-3引物[22]如表1，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min；反應(yīng)體系通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測拍照。

1.2.5 TYLCV病毒接種 VIGS沉默接種14 d后，用TYLCV侵染性克隆接種病毒[23]，接種方法參考Li等[24]，將活化后的農(nóng)桿菌GV3101(TYLCV-SH2)接種于番茄植株的地上部10 cm處的韌皮部，同時以接種GV3101(空載體)的植株作為對照。觀察發(fā)病情況并通過PCR檢測TYLCV是否接種成功[18]，每個處理15～20株，隨機取樣，每個處理至少取3株。

1.2.6 TYLCV病毒含量檢測 TYLCV含量檢測通過定量PCR(quantitative PCR, qPCR)qPCR[25]和ELISA試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司)檢測。qPCR：TYLCV病毒DNA提取采用CTAB法，TYLCV-F/R定量引物見表1，β-Actin作為內(nèi)參基因，采用CFX96TMReal-Time System熒光定量PCR儀進行。qPCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15s，60℃退火15s，40個循環(huán)；95℃變性10s，65℃退火10s，95℃延伸5s；反應(yīng)體系為20 μL，設(shè)3個生物學重復(fù)。ELISA試劑盒檢測按照說明書進行操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 VIGS載體的構(gòu)建與鑒定

通過比較番茄SlDCL基因家族氨基酸序列與核酸序列，選取特異性片段作為DCL2、DCL4基因靶標片段，設(shè)計引物并擴增特異性片段后，將靶標片段分別連接pMD-18T載體，經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)靶標片段與目標基因核酸序列99%相似，確定為目標靶標片段。經(jīng)KpnI和XbaI雙酶切驗證后，將目標靶標片段插入到pTRV2載體中，獲得pTRV2-SlDCL2、 pTRV2-SlDCL4(圖1)，分別將pTRV1、pTRV2-SlDCL2、pTRV2-SlDCL4轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101，經(jīng)菌液PCR驗證后，70%菌液加30%甘油保存于-80℃冰箱備用。

圖1 VIGS沉默載體示意圖Fig.1 Schematic of VIGS-vector

2.2 TRV2∶SlDCL2、TRV∶SlDCL4沉默效率統(tǒng)計

八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase，PDS)是類胡蘿卜素合成途徑中的重要限速酶，VIGS沉默番茄PDS(SlPDS)植株2周開始出現(xiàn)白化現(xiàn)象，且可以持續(xù)到開花結(jié)果(圖2)。VIGS接種4周，對照TRV∶SlPDS全部表現(xiàn)白化，可推測TRV2∶SlDCL2、TRV2∶SlDCL4同樣沉默。通過qRT-PCR檢測SlDCL2、SlDCL4的沉默效率，得到SlDCL2相對表達量小于0.5，此時SlDCL2沉默效率大于50%；同樣，SlDCL4相對表達小于0.5，SlDCL4沉默效率大于50%。因此TRV2∶SlDCL2、TRV2∶SlDCL4可以用于后續(xù)研究。

注：*表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: *indicates significant difference at 0.05 level. The same as following.圖2 TRV2∶SlDCL2、TRV2∶SlDCL4沉默效率Fig.2 Silencing efficiency of TRV2∶SlDCL2、TRV2∶SlDCL4

2.3 Ty-1/Ty-3抗性標記檢測

通過Ty-1/Ty-3特異性引物檢測，本試驗所用材料Y19攜帶有Ty-1/Ty-3抗性標記(圖3)，田間觀察，Y19對TYLCV具有抗性。

注：1和6:陰性對照; 2和3:Ty-3抗性標記鑒定; 4和5: Ty-1抗性標記鑒定。Note: 1 and 6: Negative control. 2 and 3: Ty-3 resistance marker identification. 4 and 5: Ty-1 resistance marker identification.圖3 Y19材料攜帶Ty-1/Ty-3抗性標記Fig.3 Tomato Y19 material carries Ty-1/Ty-3 resistance markers

2.4 SlDCL2和SlDCL4基因沉默對Ty-1/Ty-3抗性的影響

為了探究SlDCL2、SlDCL4在番茄Ty-1/Ty-3抗TYLCV中的作用，本研究通過VIGS技術(shù)分別共沉默SlDCL2或SlDCL4。如圖4所示，4個處理分別為對照、TRV2∶00、TRV2∶SlDCL2、TRV2∶SlDCL4，4個處理中，TRV2∶SlDCL2和TRV2∶SlDCL4在接種TYLCV后2個星期，開始出現(xiàn)典型的TYLCV病毒癥狀，而對植株對照與TRV2∶00空載體植株也未出現(xiàn)TYLCV病毒癥狀。TYLCV接種4星期后，檢測不同處理植株病毒含量，并統(tǒng)計植株發(fā)病嚴重度，結(jié)果顯示TRV2∶SlDCL2和TRV2∶SlDCL4病毒含量、發(fā)病嚴重度顯著高于對照和空載體(TRV2∶00)。結(jié)果表明，沉默SlDCL2或SlDCL4后，攜帶Ty-1/Ty-3抗性基因Y9番茄材料的抗性被破壞。

圖4 VIGS沉默SlDCL2、SlDCL4降低Ty-1/Ty-3對TYLCV的抗性Fig.4 VIGS silencing SlDCL2 and SlDCL4 reduce Ty-1/Ty-3 resistance to TYLCV

3 討論

本研究通過VIGS沉默技術(shù)研究番茄RNAi通路關(guān)鍵基因SlDCL2、SlDCL4在Ty-1/Ty-3抗TYLCV中的功能，結(jié)果顯示，沉默SlDCL2或SlDCL4后，Y19植株表現(xiàn)出感病癥狀，暗示SlDCL2、SlDCL4在番茄Ty-1/Ty-3抗TYLCV中至關(guān)重要。Verlaan等[12]發(fā)現(xiàn)Ty-1和Ty-3是一對等位基因，編碼RDR蛋白，而RDR和DCL、AGO蛋白共同參與RNAi機制。

DCL蛋白可以將dsRNA剪切成siRNA，在RNAi通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。擬南芥中含有4個DCL，分別是AtDCL1、AtDCL2、AtDCL3和AtDCL4, AtDCL1參與剪切形成miRNA，而AtDCL2和AtDCL4在擬南芥抗病毒中發(fā)揮重要作用，Deleris等[16]發(fā)現(xiàn)擬南芥AtDCL2和AtDCL4突變加重植株的病毒癥狀。目前番茄中鑒定了7個SlDCL蛋白，其中SlDCL2含有4個亞型，SlDCL2a、SlDCL2b、SlDCL2c和SlDCL2d, 其氨基酸序列同源性高達81%，推斷其可能是同一個基因在染色體上的不同拷貝[18]。本研究所用技術(shù)為VIGS沉默技術(shù)，所選靶標片段大小一般要求200～400 bp，由于通過VIGS技術(shù)不能分別單獨沉默4個SlDCL2亞型，因此本試驗沉默靶標片段為4個SlDCL2亞型的保守區(qū)域，結(jié)果顯示為SlDCL2基因4個亞型共沉默表型。但基因編輯技術(shù)所用的靶標片段一般僅為21～22 bp，因此可以將高同源性基因家族進行單獨敲除，如Wang等[26]通過基因編輯技術(shù)突變SlDCL2a/b，發(fā)現(xiàn)SlDCL2a/b在番茄抗煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus,TMV)和土豆X病毒(potato virus X, PVX)中發(fā)揮重要作用。因為RNAi技術(shù)選擇靶標基因片段也是200～400 bp，本研究不能將4個SlDCL2亞型分別進行單獨沉默，如Suzuki等[27]同樣是通過RNAi技術(shù)干擾SlDCL2/4表達，結(jié)果使該材料對馬鈴薯紡錘纖塊莖類病毒(Potatospindletuberviroid)的抗性由耐性轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏』蛉韷乃馈?/p>

Wang等[26]通過基因編輯技術(shù)同時敲除SlDCL2a/b，發(fā)現(xiàn)SlDCL2a/b在番茄抗PVX和TMV抗性途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，本研究發(fā)現(xiàn)SlDCL2在番茄抗DNA病毒-TYLCV中同樣發(fā)揮重要作用，這也說明不同植物抵抗RNA病毒或DNA病毒可能存在相似的機制。

另外，SlDCL2對于內(nèi)源性小RNA micro RNA, miRNA至關(guān)重要，包括其他非典型miRNAs，如miR6026[26]。Wang等[26]報道m(xù)iR6026的產(chǎn)生需要SlDCL2，更重要的是miR6026可以將SlDCL2基因mRNA作為靶標，調(diào)控SlDCL2基因的表達，在將來的研究中，可以通過過表達miR6026來調(diào)控SlDCL2的含量。

SlDCL2a/b不僅影響病毒siRNA的合成，而且會影響miRNA的合成[26]。先前研究認為DCL2蛋白主要參與病毒siRNA合成[16]，近幾年，Wang等[26]和Suzuki等[27]研究表明DCL蛋白同樣參與調(diào)控內(nèi)源miRNA合成，依賴于SlDCL2的miRNA通路會影響番茄植株對RNA病毒的抗性。根據(jù)本研究結(jié)果沉默SlDCL2和SlDCL4降低Ty-1/Ty-3抗病性，推測該通路同樣參與調(diào)控植株對DNA病毒的抗性，有待進一步證明。

植物DCL除了參與抗病毒，還參與植物發(fā)育。Teng等[28]發(fā)現(xiàn)玉米Dicer-like5(DCL5)缺失造成溫敏型雄性不育的現(xiàn)象。關(guān)于DCL的研究不僅局限于植物，而且逐漸開始在致病微生物中進行，Yin等[29]通過RNAi技術(shù)干擾柑橘青霉菌DCL2，結(jié)果顯示柑橘青霉菌DCL2表達降低，其致病性隨之降低，但DCL的功能還有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過VIGS技術(shù)沉默RNAi通路關(guān)鍵基因SlDCL2、SlDCL4，番茄Y19材料中Ty-1/Ty-3對TYLCV抗性降低，表明RNAi通路關(guān)鍵基因SlDCL2、SlDCL4對于Ty-1/Ty-3抗性至關(guān)重要，同樣可推測RNAi通路參與了番茄Ty-1/Ty-3抗TYLCV的過程。