徐眾華 許炯博 錢文武 闕云端 王秋平 陳建發(fā)

中圖分類號 R285.5 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）24-2975-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.24.06

摘 要 目的：研究桃紅四物湯對兔肩袖損傷的修復(fù)作用及機制。方法：將新西蘭兔隨機分為空白對照組、模型組和桃紅四物湯低、中、高劑量組（2.75、5.5、11 g/kg）以及桃紅四物湯+LY294002組[5.5 g/kg桃紅四物湯+6.4 μg/kg LY294002（通路抑制劑）]，每組11只。除空白對照組外，其余各組兔均行右側(cè)肩胛下肌部分離斷手術(shù)，復(fù)制肩袖損傷模型。造模成功后，空白對照組和模型組兔均灌胃生理鹽水，桃紅四物湯各劑量組兔均灌胃相應(yīng)藥液，桃紅四物湯+LY294002組兔先灌胃桃紅四物湯藥液，再耳緣注射LY294002，每天1次，連續(xù)12周。末次灌胃（注射）后，觀察兔腱骨界面組織的病理形態(tài)學(xué)變化，檢測兔血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素10（IL-10）、IL-6水平，檢測兔腱骨界面組織中磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR） 的mRNA和蛋白表達水平以及自噬相關(guān)蛋白（Beclin1、LC3Ⅱ）的表達水平。結(jié)果：與空白對照組比較，模型組兔腱骨界面組織凹凸不平，內(nèi)膜腫脹;血清中TNF-α、IL-6水平以及腱骨界面組織中PI3K、Akt、mTOR的 mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），IL-10水平以及Beclin1、LC3Ⅱ蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，桃紅四物湯低、中劑量組兔腱骨界面組織仍存在一定的內(nèi)膜破損，高劑量組兔腱骨界面組織光滑平整、內(nèi)膜無明顯撕裂;各劑量組兔血清和腱骨界面組織中大部分指標(biāo)水平均顯著逆轉(zhuǎn)（P<0.05或P<0.01）。桃紅四物湯+LY294002組兔腱骨界面組織仍腫脹膨大，內(nèi)膜撕裂明顯;血清和腱骨界面組織中上述指標(biāo)水平較模型組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：桃紅四物湯可修復(fù)兔的肩袖損傷，其作用機制與抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路、激活自噬、抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 桃紅四物湯;肩袖損傷;PI3K/Akt/mTOR信號通路;自噬;兔

Repair Effect and Mechanism of Taohong Siwu Decoction on Rotator Cuff Injury in Rabbits

XU Zhonghua1，XU Jiongbo2，QIAN Wenwu1，QUE Yunduan1，WANG Qiuping1，CHEN Jianfa3（1. Dept. of Orthopaedics， Nanjing Gaochun People’s Hospital， Nanjing 211302， China; 2. The First Clinical Medical College， Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510405， China; 3. Dept. of Four Orthopedics， the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510405， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the repair effect and mechanism of Taohong siwu decoction on rotator cuff injury in rabbits. METHODS： New Zealand rabbits were randomly divided into blank control group， model group， Taohong siwu decoction low-dose， medium-dose and high-dose groups （2.75， 5.5， 11 g/kg）， and Taohong siwu decoction+LY294002 group [5.5 g/kg Taohong siwu decoction+6.4 μg/kg LY294002 （pathway inhibitor）]， with 11 rabbits in each group. Except for blank control group， other groups underwent right subscapularis muscle detachment to establish rotator cuff injury model. After modeling， blank control group and model group were given normal saline intragastrically; Taohong siwu decoction groups were given relevant medicine intragastrically; Taohong siwu decoction+LY294002 group was given Taohong siwu decoction intragastrically， and then injected with LY294002 at the ear edge， once a day， for 12 weeks. After last intragastric administration （injection）， the pathological changes of tendon-bone interface was observed; the levels of TNF-α， IL-10 and IL-6 in serum were detected; mRNA and protein expressions of PI3K， Akt and mTOR in tendon-bone interface were detected; the expression of autophagy related protein （Beclin1， LC3Ⅱ） were detected. RESULTS： Compared with blank control group， the tendon-bone interface was uneven and the intima was swollen in model group. Serum levels of TNF-α and IL-6， mRNA and protein expressions of PI3K， Akt and mTOR in tendon-bone interface were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）， while the level of IL-10 and protein expression of Beclin1 and LC3Ⅱ were decreased significantly （P<0.01）. Compared with model group， the tendon-bone interface of rabbits in Taohong siwu decoction low-dose and medium-dose groups still had certain intimal damage， while the tendon-bone interface of rabbits in high-dose group was smooth and flat without an obvious intimal tear; the levels of most indexes in serum and tendon-bone interface? of rabbits were significantly reversed in each dose group （P<0.05 or P<0.01）. Swollen tendon-bone interface and obvious intimal tear were observed in Taohong siwu decoction+LY294002 group; compared with model group， there was no significant difference in above indexes of serum and tendon-bone interface （P>0.05）. CONCLUSIONS： Taohong siwu decoction may repair the rotator cuff injury of rabbits， the mechanism of which may be associated with inhibiting PI3K/Akt/mTOR signaling pathway， activating autophagy and inhibiting inflammatory response.

KEYWORDS? ?Taohong siwu decoction; Rotator cuff injury; PI3K/Akt/mTOR signaling pathway; Autophagy; Rabbit

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目（No.81774339）;廣東省中醫(yī)藥局科研課題（No.20191101）

副主任醫(yī)師。研究方向：骨科學(xué)。電話：025-57311232。E- mail：Xzhws936@163.com

肩袖損傷又稱肩撞擊綜合征，是造成肩關(guān)節(jié)疼痛和肩關(guān)節(jié)活動受限的主要疾病，常表現(xiàn)為肌腱撕裂，并伴有肌肉萎縮以及炎癥細胞浸潤等現(xiàn)象[1]。肌腱損傷以及肌肉萎縮的本質(zhì)是蛋白質(zhì)過度降解，其中自噬-溶酶體系統(tǒng)是重要的蛋白質(zhì)水解途徑，可在受損的肩袖中被激活，從而引起自噬反應(yīng)的發(fā)生[2]。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是調(diào)控自噬的重要信號通路[3]。由此筆者推測，PI3K/Akt/mTOR通路可能是肩袖損傷修復(fù)的重要通路。

中醫(yī)認(rèn)為，瘀血內(nèi)阻、氣虛血瘀而成痹，是導(dǎo)致肩袖損傷發(fā)生的重要原因，因此臨床上常以活血化瘀療法治療肩袖損傷[4]。桃紅四物湯由桃仁、紅花、生地、當(dāng)歸、赤芍、川芎等6味藥材組成，具有活血祛瘀、養(yǎng)血補血的功效[5]。臨床研究表明，桃紅四物湯能有效修復(fù)受損肩袖，減輕患者疼痛并改善肩關(guān)節(jié)功能[6]。但桃紅四物湯修復(fù)肩袖損傷的具體作用機制尚不明確。

基于此，本研究首先構(gòu)建兔肩袖損傷模型，然后檢測桃紅四物湯對模型兔腱骨界面組織形態(tài)，血清中炎癥相關(guān)因子[腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素10（IL-10）、IL-6]、PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白和mRNA以及自噬相關(guān)蛋白（Beclin1和LC3Ⅱ）表達的影響，并應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002驗證桃紅四物湯對PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活作用，從而探討該方對肩袖損傷的修復(fù)作用及機制，以期為肩袖損傷的臨床治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所使用的主要儀器包括Ⅸ81型透射電子顯微鏡（德國Leica公司），JS-Power300型電泳儀（上海培清科技有限公司），AllegraX-15R型離心機、MK3型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），Centrifuge 5424R型低溫高速離心機（德國Eppendorf公司），BioDoc-IT型凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP公司），ABI 7500 型實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（q-PCR）儀（美國Bio-Rad公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

桃仁、紅花、生地、當(dāng)歸、赤芍、川芎藥材均購自康美藥業(yè)有限公司（批號分別為3567、3789、3899、3421、3456、4421），經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院四骨科陳建發(fā)教授鑒定為真品。青霉素注射液（批號2019103241315，規(guī)格0.48 g）購自中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司;戊巴比妥鈉（批號20190112）購自天津市大茂化學(xué)試劑廠;TNF-α、IL-10、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（批號分別為ab224503、ab234503、ab224565）均購自英國Abcam公司;山羊抗兔PI3K多克隆抗體、山羊抗兔Akt多克隆抗體、山羊抗兔mTOR多克隆抗體、山羊抗兔Beclin1多克隆抗體、山羊抗兔LC3Ⅱ單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、山羊抗兔GAPDH單克隆抗體、山羊抗兔β-actin單克隆抗體、LY294002（純度99.87%）、ECL顯影液、q-PCR試劑盒（批號分別為4678、4352、5421、6542、7895、4126、5367、5912、9901s、IPVH00012、IPVH05013）均購自美國Millipore公司;BCA蛋白測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒、脫脂奶粉、PVDF膜（批號分別為ST567、ST669、ST467、ST562）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司; PCR引物由廣州捷瑞生物科技有限公司設(shè)計合成（PCR引物序列及產(chǎn)物長度信息見表1）;其余試劑均為實驗室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 動物

本研究所用清潔級新西蘭兔共66只，雄性，體質(zhì)量約1.5 kg，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2019-0035。

2 方法

2.1 桃紅四物湯藥液的制備

取桃仁10 g、紅花5 g、生地12 g、當(dāng)歸12 g、赤芍10 g、川芎10 g，加水200 mL煎煮45 min，過濾;取續(xù)濾液進行濃縮，制得質(zhì)量濃度為1 g/mL（以生藥量計，下同）的藥液。

2.2 分組、造模與給藥

將66只兔隨機分為空白對照組、模型組和桃紅四物湯低、中、高劑量組（2.75、5.5、11 g/kg，劑量分別為臨床等效劑量的1、2、4倍）以及桃紅四物湯+LY294002組（5.5 g/kg桃紅四物湯+6.4 μg/kg LY294002，劑量參考文獻[7]設(shè)置），每組11只。模型組和各藥物組兔參考文獻[8]方法行右側(cè)肩胛下肌部分離斷手術(shù)，以構(gòu)建肩袖損傷模型，具體方法如下：對兔腹腔注射3%戊巴比妥鈉進行麻醉，再固定于動物手術(shù)臺，經(jīng)常規(guī)備皮、消毒后，對兔右肩關(guān)節(jié)外側(cè)的三角肌進行鈍性分離，然后內(nèi)收、外旋肱骨并將岡上肌肌腹提起，顯露肩胛下肌肌腱，進行離斷;縫合傷口，用無菌紗布覆蓋，繃帶固定?？瞻讓φ战M兔同法操作，但不進行離斷。各組兔縫合傷口后，于后肢肌內(nèi)注射青霉素（4×105 u）以預(yù)防感染，連續(xù)3 d[9]。每組各取1只兔進行腱骨界面組織的病理形態(tài)學(xué)觀察，當(dāng)該組織出現(xiàn)凹凸不平、內(nèi)膜腫脹時，則表明造模成功。造模成功后，空白對照組和模型組兔均灌胃生理鹽水;桃紅四物湯各劑量組兔均灌胃相應(yīng)藥液;桃紅四物湯+LY294002組兔先灌胃桃紅四物湯藥液，再耳緣注射LY294002，均每天1次，連續(xù)12周。

2.3 樣品采集

末次灌胃（注射）24 h后，對各組兔進行心臟取血。血樣靜置1 h后，以3 000 r/min離心10 min，取上層血清保存，備用。取血完成后，剖取兔腱骨界面組織，經(jīng)pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后，部分以2.5%戊二醛溶液固定，備用;部分于-80℃條件下保存，備用。

2.4 兔腱骨界面組織的病理形態(tài)學(xué)觀察

取“2.3”項下固定于2.5%戊二醛溶液中的各組兔腱骨界面組織適量，以PBS清洗5 min×3次，然后依次置于70%、80%、90%、100%乙醇中脫水，每次10 min;將脫水后的組織進行干燥處理后，置于真空鍍膜儀中鍍膜，采用透射電子顯微鏡觀察兔腱骨界面組織形態(tài)。

2.5 兔血清中TNF-α、IL-10、IL-6水平的檢測

采用ELISA法進行檢測。取“2.3”項下各組兔血清樣品，根據(jù)相應(yīng)試劑盒說明書方法操作，采用酶標(biāo)儀于510 nm波長下檢測兔血清中TNF-α、IL-10、IL-6的水平。

2.6 兔腱骨界面組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA表達水平的檢測

采用q-PCR法進行檢測。取“2.3”項下凍存的各組兔腱骨界面組織適量（每組取3只），使用Trizol試劑進行裂解后，提取總RNA，再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板2 μL，上、下游引物各2 μL，SYBR熒光染料10 μL，無核酸酶水4 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)40次。以GAPDH作為內(nèi)參，生成擴增曲線和溶解曲線，采用2-ΔΔCt法計算PI3K、Akt、mTOR mRNA的表達水平。

2.7 兔腱骨界面組織中PI3K、Akt、mTOR、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達水平的檢測

采用Western blot法進行檢測。取“2.3”項下凍存的各組兔腱骨界面組織適量（每組取3只），經(jīng)剪碎、RIPA裂解液裂解后，以10 000 r/min離心10 min，取上清液，提取總蛋白并采用BCA法測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)變性后進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂牛奶室溫條件下封閉2 h;以TBST緩沖液洗膜5 min×3次，加入PI3K、Akt、mTOR、Beclin1、LC3Ⅱ、GAPDH、β-actin一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4℃條件下孵育過夜;以TBST緩沖液洗膜5 min×3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 2 000），室溫條件下孵育1 h;以TBST緩沖液洗膜5 min×3次，滴加ECL顯影液，置于凝膠成像儀中成像。采用Image J v1.8.0軟件進行分析，以PI3K、Akt、mTOR蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值，Beclin1、LC3Ⅱ蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度值比值表示相應(yīng)蛋白的表達水平。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 桃紅四物湯對肩袖損傷模型兔腱骨界面組織形態(tài)的影響

空白對照組兔腱骨界面組織光滑平整，內(nèi)膜排列整齊。模型組兔腱骨界面組織凹凸不平，內(nèi)膜腫脹。桃紅四物湯低、中劑量組兔腱骨界面組織仍存在一定的內(nèi)膜破損，但高劑量組兔腱骨界面組織光滑平整，內(nèi)膜無明顯撕裂。桃紅四物湯+LY294002組兔腱骨界面組織腫脹膨大，內(nèi)膜撕裂明顯，損傷情況類似模型組。結(jié)果見圖1。

3.2 桃紅四物湯對肩袖損傷模型兔血清中TNF-α、IL-10、IL-6水平的影響

與空白對照組比較，模型組兔血清中TNF-α、IL-6水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），IL-10水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，桃紅四物湯各劑量組兔血清中TNF-α、IL-6水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），IL-10水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;桃紅四物湯+LY294002組兔血清中上述指標(biāo)水平較模型組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與桃紅四物湯低劑量組比較，相應(yīng)中、高劑量組兔血清中上述指標(biāo)（中劑量組IL-6水平除外）的改善更顯著（P<0.05）;與桃紅四物湯中劑量組比較，相應(yīng)高劑量組兔血清中上述指標(biāo)的改善更顯著（P<0.05）。結(jié)果見表2。

3.3 桃紅四物湯對肩袖損傷模型兔腱骨界面組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA表達的影響

與空白對照組比較，模型組兔腱骨界面組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA的表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，桃紅四物湯中、高劑量組兔該組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA的表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），桃紅四物湯低劑量組兔該組織中PI3K mRNA的表達水平顯著降低（P<0.05）;桃紅四物湯+LY294002組兔該組織中上述指標(biāo)水平較模型組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與桃紅四物湯低劑量組比較，相應(yīng)中、高劑量組兔該組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA的表達水平均顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見表3。

3.4 桃紅四物湯對肩袖損傷模型兔腱骨界面組織中PI3K、Akt、mTOR、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型組兔腱骨界面組織中PI3K、Akt、mTOR蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），Beclin1、LC3Ⅱ蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，桃紅四物湯中、高劑量組兔該組織中PI3K、Akt、mTOR蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），桃紅四物湯低劑量組兔該組織中mTOR蛋白的表達水平顯著降低（P<0.05）;桃紅四物湯各劑量組兔該組織中Beclin1、LC3Ⅱ蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;桃紅四物湯+LY294002組兔該組織中上述指標(biāo)水平較模型組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與桃紅四物湯低劑量組比較，桃紅四物湯中、高劑量組兔該組織中PI3K、Akt（中劑量組除外）、mTOR蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.05），Beclin1、LC3Ⅱ蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05）。與桃紅四物湯中劑量組比較，相應(yīng)高劑量組兔該組織中PI3K、mTOR蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.05），Beclin1、LC3Ⅱ蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05）。結(jié)果見表4、圖2。

4 討論

肩袖損傷是肩關(guān)節(jié)常見的病變之一，常表現(xiàn)為肌腱撕裂，并伴有肌肉萎縮、脂肪浸潤以及炎癥細胞浸潤等現(xiàn)象[10]。本研究病理檢查結(jié)果顯示，經(jīng)高劑量桃紅四物湯干預(yù)后，兔腱骨界面組織光滑平整，內(nèi)膜無明顯撕裂，表明桃紅四物湯對肩袖損傷具有一定的修復(fù)作用。

TNF-α是由巨噬細胞生成的一種對細胞生長分化和功能具有多重效應(yīng)的多肽細胞因子，可誘發(fā)炎癥反應(yīng)[11];IL-6是促炎細胞因子，可通過體液和細胞免疫功能影響炎癥程度[12];IL-10是一種重要的抗炎細胞因子，可抑制炎癥因子對細胞的刺激作用，從而抑制機體組織產(chǎn)生過度的病理改變[13]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)不同劑量桃紅四物湯干預(yù)后，兔血清中TNF-α、IL-6水平均顯著降低，IL-10水平均顯著升高，表明桃紅四物湯可通過抑制炎癥反應(yīng)來修復(fù)肩袖損傷。

肌腱損傷以及肌肉萎縮本質(zhì)上是蛋白質(zhì)過度降解，而自噬-溶酶體系統(tǒng)是重要的蛋白水解途徑，其在受損的肩袖組織中被激活，從而引起自噬反應(yīng)的發(fā)生[2]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，PI3K、Akt及其下游信號mTOR的快速激活可促進蛋白質(zhì)的合成，抑制自噬體的形成[8]。Beclin1、LC3Ⅱ基因在自噬溶酶體降解途徑中具有抑制作用，對自噬體的形成至關(guān)重要[14]。LY294002是一種能夠阻斷PI3K信號通路的蛋白激酶抑制劑，目前已被廣泛用于該通路的相關(guān)研究[15]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)中、高劑量桃紅四物湯干預(yù)后，兔腱骨界面組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA和蛋白的表達水平均顯著降低，Beclin1、LC3Ⅱ蛋白的表達水平均顯著升高，且高劑量組上述指標(biāo)的改善程度較低、中劑量組更顯著;桃紅四物湯+LY294002組上述指標(biāo)相較于模型組均無顯著改善。這表明桃紅四物湯修復(fù)兔肩袖損傷的作用可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路、激活自噬有關(guān)。

綜上所述，桃紅四物湯可修復(fù)兔的肩袖損傷，其作用機制與抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路、激活自噬、抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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（收稿日期：2021-06-10 修回日期：2021-10-22）