曾周杰，于 雯，仇浩謙，陳文娟，張立紅

(中國(guó)石油大學(xué)(華東)理學(xué)院，山東 青島 266580)

光學(xué)顯微技術(shù)對(duì)人類(lèi)探索微觀世界具有重要意義，其在細(xì)胞生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)顯微系統(tǒng)主要由光源，透鏡組及光電傳感器等多個(gè)部件組成，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，價(jià)格昂貴[1]。其中，物鏡是顯微系統(tǒng)中至關(guān)重要的一環(huán)，但因?yàn)槠涔潭臻g帶寬積，往往無(wú)法同時(shí)實(shí)現(xiàn)高分辨率與大視場(chǎng)成像。以對(duì)大面積病理樣本成像為例，需要進(jìn)行染色、冷凍、切片、掃描和拼接[2]。在此過(guò)程中，又需要對(duì)多幅小視場(chǎng)圖片進(jìn)行預(yù)處理，圖像的配準(zhǔn)和融合通常存在準(zhǔn)確性低、耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題[3,4]。

近年來(lái)，隨著優(yōu)良圖像傳感器和高性能計(jì)算機(jī)的出現(xiàn)，無(wú)透鏡成像技術(shù)迅速發(fā)展。該技術(shù)不僅可以克服傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡固定分辨率-視場(chǎng)積的限制，無(wú)像差，且具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，便攜性高和成本低等優(yōu)點(diǎn)[5-8]。目前無(wú)透鏡成像技術(shù)分為無(wú)透鏡陰影成像[9]、無(wú)透鏡熒光成像[10]和無(wú)透鏡全息成像[7]三種。其中，無(wú)透鏡全息成像因其高分辨率和簡(jiǎn)潔的成像流程而具有廣泛應(yīng)用前景。無(wú)透鏡全息顯微成像系統(tǒng)通常由光源、樣品臺(tái)以及光電探測(cè)器組成。成像過(guò)程中，光源中的LED光經(jīng)過(guò)微孔傳播一段距離后照射至樣本，發(fā)生衍射后的衍射圖案最后被下方的光電傳感器所記錄。計(jì)算機(jī)根據(jù)光電傳感器所記錄的圖像，利用圖像恢復(fù)算法進(jìn)行重建，最終得到樣本的再現(xiàn)像。目前常用的重建算法主要有菲涅爾積分法[11]、卷積法[12]、角譜法[13]等。

針對(duì)現(xiàn)有無(wú)透鏡裝置自動(dòng)化程度低的缺點(diǎn)，搭建了一套無(wú)透鏡智能顯微成像裝置，該系統(tǒng)硬件部分由1W高功率藍(lán)光LED光源、直徑為50 μm的精密針孔和單像素尺寸為1.335 μm、2 600萬(wàn)像素、視場(chǎng)為57.1 mm2的CMOS相機(jī)、兩部?jī)上嗨木€精密步進(jìn)電機(jī)、STM32F4VE單片機(jī)、可調(diào)降壓穩(wěn)壓電源模塊和暗箱組成，軟件部分由電腦端上位機(jī)組成。該系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)生物樣品的大視場(chǎng)顯微成像，及對(duì)圖像視野的自適應(yīng)智能調(diào)整，具有自動(dòng)化程度高的優(yōu)點(diǎn)，不僅可用于對(duì)生物樣品的大視場(chǎng)顯微成像，還可應(yīng)用于無(wú)透鏡成像的教學(xué)演示實(shí)驗(yàn)及科普演示實(shí)驗(yàn)。

1 成像原理

全息圖像恢復(fù)的主要算法有菲涅耳積分法、卷積法及角譜法。其中，角譜法恢復(fù)過(guò)程計(jì)算量較小，故選用角譜法進(jìn)行全息圖的恢復(fù)。

無(wú)透鏡智能顯微成像系統(tǒng)原理如圖1所示，微孔與樣品的距離為Z1，樣品與CMOS相機(jī)的距離為Z2。利用微孔提高光源相干性，使光源經(jīng)過(guò)Z1距離的傳播后，照射到樣品上的光為近似相干光。照射至樣品時(shí)，通過(guò)樣品的光可分為兩種，一種是經(jīng)過(guò)樣品的光，其攜帶樣品部分信息，被稱為物光；另一種是透過(guò)玻片，未經(jīng)樣品的光，被稱為參考光。這兩部分光相互干渉，形成的干涉圖案被下方的CMOS相機(jī)記錄，并傳入電腦端上位機(jī)。

圖1 無(wú)透鏡智能顯微成像系統(tǒng)原理圖

(1)

其中，α和β為空間頻譜的方位角。

因此，U與Uo的關(guān)系可表示為：

U=-1{{Uo}Hz}

(2)

對(duì)全息圖U進(jìn)行二維傅立葉變換求出CMOS圖像傳感器平面處的角譜A后，代入波長(zhǎng)等參數(shù)并乘以該傳播函數(shù)Hz，即可得到樣品平面處的角譜Ao，對(duì)求得的角譜做二維傅立葉變換，即可求得樣品平面處的光場(chǎng)分布Uo。圖像重建流程如圖2所示。

圖2 圖像重建流程圖

2 裝置組成

圖3為無(wú)透鏡智能顯微成像裝置示意圖。

圖3 無(wú)透鏡智能顯微成像裝置示意圖

該裝置從上到下依次為無(wú)透鏡成像模塊、自適應(yīng)位移臺(tái)及可調(diào)降壓穩(wěn)壓電源模塊。

其中，無(wú)透鏡成像模塊包括：1 W高功率藍(lán)光LED光源、直徑為50 μm的精密針孔和單像素尺寸為1.335 μm、2600萬(wàn)像素、視場(chǎng)為57.1 mm2的CMOS相機(jī)；自適應(yīng)位移臺(tái)包括：兩部垂直放置的兩相四線精密步進(jìn)電機(jī)、兩部低熱量步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器和STM32F4VE單片機(jī)；可調(diào)降壓穩(wěn)壓電源模塊包括：LM2596S DC-DC直流可調(diào)降壓穩(wěn)壓模塊及1800 mAh3S航模電池。另外，為滿足無(wú)透鏡成像需要，本裝置還設(shè)計(jì)了配套暗箱。無(wú)透鏡智能顯微成像裝置實(shí)物圖如圖4所示。

裝置工作時(shí)，無(wú)透鏡成像模塊中的LED作為光源向下照射樣品，其干涉圖像被樣品下方的CMOS所記錄并傳至電腦端上位機(jī)(其界面如圖4所示)，電腦端上位機(jī)實(shí)時(shí)顯示CMOS所記錄圖像。當(dāng)電腦端上位機(jī)執(zhí)行成像視野自適應(yīng)調(diào)整操作時(shí)，其根據(jù)CMOS所成圖像計(jì)算并向STM32F4VE單片機(jī)發(fā)送指令。單片機(jī)根據(jù)指令控制步進(jìn)電機(jī)運(yùn)動(dòng)，從而完成對(duì)成像視野的自適應(yīng)調(diào)整。調(diào)整至合適視野后，電腦端上位機(jī)可實(shí)現(xiàn)當(dāng)前圖像的實(shí)時(shí)重建與保存。

圖4 無(wú)透鏡智能顯微成像裝置實(shí)物圖

圖5 電腦端上位機(jī)界面

3 自適應(yīng)位移臺(tái)及其算法設(shè)計(jì)

3.1 自適應(yīng)位移臺(tái)設(shè)計(jì)

自適應(yīng)位移臺(tái)包括兩部運(yùn)動(dòng)方向垂直放置的步進(jìn)電機(jī)、下方的STM32F4VE單片機(jī)、兩部低熱量步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器以及可調(diào)降壓穩(wěn)壓模塊，圖6為自適應(yīng)位移臺(tái)部分示意圖，圖7為位移臺(tái)控制圖。通過(guò)兩部運(yùn)動(dòng)方向垂直放置的步進(jìn)電機(jī)，CMOS能夠?qū)崿F(xiàn)x-y方向的水平位移。其中，兩部步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器設(shè)置為800細(xì)分，精度為1.25 μm每步。

在單片機(jī)收到電腦端上位機(jī)的指令后，根據(jù)指令中的步數(shù)標(biāo)志向步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器的脈沖正接口輸出相應(yīng)數(shù)目的脈沖精確控制步進(jìn)電機(jī)的運(yùn)動(dòng)步數(shù)；根據(jù)指令中的方向標(biāo)志向步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器的方向負(fù)接口輸出對(duì)應(yīng)的高低電平控制步進(jìn)電機(jī)運(yùn)動(dòng)的方向。步進(jìn)電機(jī)滑塊與CMOS相機(jī)固定，從而帶動(dòng)CMOS相機(jī)進(jìn)行水平位移，實(shí)現(xiàn)成像視野的自適應(yīng)智能調(diào)整。

圖6 自適應(yīng)位移臺(tái)部分示意圖

圖7 位移臺(tái)控制圖

3.2 自適應(yīng)視野調(diào)整算法設(shè)計(jì)

在自適應(yīng)調(diào)整時(shí)，首先進(jìn)行圖像處理。圖像處理過(guò)程中，將CMOS相機(jī)采集到的圖像轉(zhuǎn)化為灰度圖像，得到灰度圖像后對(duì)灰度圖像進(jìn)行邊緣識(shí)別。邊緣識(shí)別使用Prewitt算子，該算子是一種一階微分算子。對(duì)于離散的二維圖像，其水平和垂直方向的梯度為：

(3)

因?yàn)閳D像的離散性，上式可化簡(jiǎn)為：

(4)

其中，f(x,y) 代表(x,y)處的灰度值。

根據(jù)上述原理，Prewitt算子利用3×3的梯度模板，對(duì)整幅圖像進(jìn)行梯度運(yùn)算，在邊緣處，其灰度值變化大，梯度大，從而提取出圖像中的邊緣信息。

邊緣識(shí)別后，圖像相當(dāng)于經(jīng)過(guò)二值化處理，數(shù)據(jù)量大大減小，此時(shí)顯示的便是樣品的邊緣。對(duì)此時(shí)圖像邊緣的所有像素點(diǎn)的坐標(biāo)進(jìn)行加權(quán)平均：

(5)

其中，fi代表第i個(gè)點(diǎn)的灰度值，xi代表第i個(gè)點(diǎn)的x坐標(biāo)，yi代表第i個(gè)點(diǎn)的y坐標(biāo)。

每一個(gè)像素點(diǎn)的權(quán)數(shù)為該點(diǎn)的灰度值，最后除以邊緣像素點(diǎn)的個(gè)數(shù)，從而得到樣品的幾何中心坐標(biāo)(xc,yc)。圖像處理示意圖如圖8所示。

圖8 圖像處理示意圖

對(duì)本裝置所用的CMOS相機(jī)，其在上位機(jī)顯示畫(huà)面的尺寸為1 920×1 080，因此畫(huà)面中心的坐標(biāo)為(960,540)。將所求得的樣品中心坐標(biāo)(xc,yc)與畫(huà)面中心坐標(biāo)(960,540)作差，可得位移臺(tái)步數(shù)為：

(6)

其中stepx，stepy為兩個(gè)整數(shù)，其絕對(duì)值分別代表x及y方向步進(jìn)電機(jī)移動(dòng)步數(shù)，其正負(fù)代表x及y方向步進(jìn)電機(jī)移動(dòng)方向。

得到上述信息后，進(jìn)行判斷并生成指令，根據(jù)步進(jìn)電機(jī)擺放方式，若stepx>0則x方向位移臺(tái)的方向標(biāo)志為1，反之方向標(biāo)志為2；若stepy>0則y方向位移臺(tái)的方向標(biāo)志為2，反之方向標(biāo)志為1。對(duì)stepx和stepy取絕對(duì)值，若其中有一項(xiàng)大于99 999，則設(shè)置二次位移標(biāo)志為1，大于99 999的那一項(xiàng)設(shè)置為99 999。若二次位移標(biāo)志為1，則位移臺(tái)完成位移動(dòng)作后，上述流程將再次重復(fù)，直至一次位移便能將樣品幾何中心移至視野中心，從而完成視野的自適應(yīng)調(diào)整。自適應(yīng)算法流程圖如圖9所示。

圖9 自適應(yīng)算法流程圖

3.3 指定中心視野調(diào)整算法設(shè)計(jì)

指定中心視野調(diào)整模式下，當(dāng)鼠標(biāo)點(diǎn)擊上位機(jī)界面攝像頭實(shí)時(shí)畫(huà)面視窗某點(diǎn)時(shí)，裝置將自動(dòng)將該點(diǎn)移至視野中央，實(shí)現(xiàn)指定中心視野調(diào)整。指定中心視野調(diào)整算法流程圖如圖10所示。

圖10 指定中心視野調(diào)整算法流程圖

該算法首先獲取點(diǎn)擊像素點(diǎn)的坐標(biāo)(xg,yg)，將其與畫(huà)面中心坐標(biāo)(960,540)作差，可得位移臺(tái)步數(shù)為：

(7)

其中stepx包含x方向步進(jìn)電機(jī)移動(dòng)的方向和步數(shù)，stepy包含y方向步進(jìn)電機(jī)移動(dòng)的方向和步數(shù)。

重復(fù)3.2節(jié)中生成指令流程，并向單片機(jī)發(fā)送指令，控制位移臺(tái)動(dòng)作，從而將鼠標(biāo)點(diǎn)擊像素點(diǎn)移至視野中央，實(shí)現(xiàn)指定中心的視野調(diào)整。

4 裝置測(cè)試

裝置測(cè)試中，選取椴樹(shù)莖及水蚤進(jìn)行成像。椴樹(shù)莖和水蚤成像圖像如圖11、12所示。

(a)椴樹(shù)莖干涉圖樣

(a)水蚤干涉圖樣

由圖11、12可見(jiàn)，本裝置能夠很好分辨椴樹(shù)莖的外形輪廓、內(nèi)部細(xì)節(jié)及水蚤胸肢、殼刺等，具有良好成像能力，能夠滿足教學(xué)及演示實(shí)驗(yàn)需求。

5 結(jié) 語(yǔ)

針對(duì)傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡固定分辨率-視場(chǎng)積的局限，研究人員提出無(wú)透鏡顯微鏡，但現(xiàn)有無(wú)透鏡顯微裝置大多結(jié)構(gòu)固定，自動(dòng)化，智能化程度低。針對(duì)以上問(wèn)題，設(shè)計(jì)了一套無(wú)透鏡智能顯微成像裝置。測(cè)試表明，該裝置不僅可實(shí)現(xiàn)大市場(chǎng)較高分辨率顯微成像，且配合自適應(yīng)位移臺(tái)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)成像視野的自適應(yīng)調(diào)整，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)效益高，自動(dòng)化程度高。