何 敏,岳鵬瑩,白寶平
延安大學(xué)西安創(chuàng)新學(xué)院,陜西 西安710100
肝癌是消化系統(tǒng)最常見的腫瘤之一,具有惡性程度高,手術(shù)效果差,預(yù)后差的特點(diǎn)[1-2]。我國(guó)肝癌發(fā)病率居世界前列[3]。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì),我國(guó)每年肝癌的發(fā)病率為11%,并且有逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)[4]。目前針對(duì)肝癌的治療主要集中于放、化療及手術(shù)和介入治療[5-6]。
中藥具有毒副作用小,療效溫和的特點(diǎn),對(duì)于身體狀況較差的晚期癌癥患者具有更佳的療效[7-8]??鄥A是豆科植物苦參的主要成分,對(duì)慢性炎癥、心率失常及肝臟纖維化具有明顯療效,但是對(duì)于肝癌的治療效果不明確[9-11]。本研究探討苦參堿對(duì)肝癌的治療效果及對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2的增殖和凋亡作用機(jī)制。
1.1 主要試劑與藥物Transwell試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);CCK-8檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD生物試劑有限公司);AV-PI凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD生物試劑有限公司);DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco生物試劑公司);胎牛血清(美國(guó)Gibco生物試劑公司);兔抗人Pink1(美國(guó)Abcam生物有限公司);Parkin抗體(美國(guó)Abcam生物有限公司);Pink1、Parkin、Bcl-2、Bax、Bad、Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9引物(上海生物化學(xué)有限公司設(shè)計(jì)并提供);NSC 66389型3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA,上海易匯生物科技有限公司)??鄥A(北京伊塔生物科技有限公司,規(guī)格:20 mg;純度:HPLC≥98%)。
1.2 方法
1.2.1 肝癌細(xì)胞系HepG2的培養(yǎng)人源性肝癌細(xì)胞系HepG2受贈(zèng)于北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院楊回清博士,培養(yǎng)基選擇DMEM培養(yǎng)基,加入15%胎牛血清和1%鏈霉素,置于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱,待細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,傳代穩(wěn)定后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.2.2 細(xì)胞分組根據(jù)苦參堿的處理方法將肝癌細(xì)胞分成4組。對(duì)照組:將等量磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)加入肝癌細(xì)胞,培養(yǎng)條件與另外兩組相同;0.5 g/L處理組:將0.5 g/L苦參堿2 mL加入肝癌細(xì)胞,與肝癌細(xì)胞共同培養(yǎng)處理72 h;1.0 g/L處理組:將1.0 g/L苦參堿2 mL加入肝癌細(xì)胞,與肝癌細(xì)胞共同培養(yǎng)處理72 h;抑制劑組:將Pink1/Parkin信號(hào)通路抑制劑3-MA 2 mL加入肝癌細(xì)胞,與肝癌細(xì)胞共同培養(yǎng)處理72 h。
1.2.3 免疫熒光法檢測(cè)Pink1,Parkin表達(dá)水平將上述4組細(xì)胞于24孔板處理72 h后,利用預(yù)熱的PBS溶液清洗3遍,每次5 min,加入25%甲醛溶液,固定細(xì)胞狀態(tài)。加入聚乙二醇辛基苯基醚-100(Triton-100),用于細(xì)胞破膜。加入5%胎牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA),孵育30 min,PBS溶液清洗3遍后加入預(yù)先稀釋好的Pink1、Parkin兔抗人一抗,4℃避光過夜孵育。PBS清洗后加入山羊抗兔GFP標(biāo)記的二抗,避光孵育30 min,PBS清洗后加入Hoechst染色,孵育10 min,PBS清洗后,倒置熒光顯微鏡下觀察。
1.2.4 Real time PCR檢測(cè)Pink1、Parkin、Bcl-2、Bad、Bax及Caspase-3和Caspase-9的mRNA表達(dá)將上述4組細(xì)胞處理72 h后加入胰蛋白酶1 mL,混合均勻后提取細(xì)胞。采用Trizol法提取RNA,TaKaRa熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行熒光定量檢測(cè),根據(jù)反應(yīng)體系的不同加入各試劑。采用L9700D型RT-PCR儀器[萊普特科學(xué)儀器(北京)有限公司]進(jìn)行分析,總時(shí)間設(shè)置為2 h?;蛞镄蛄幸姳?。
表1 目的基因的引物序列
1.2.5 Western Blot檢 測(cè)Pink1、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)將上述4組細(xì)胞處理72 h后,收集細(xì)胞,RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,提取總蛋白,95℃金屬浴煮沸后備用,同時(shí)按照Western Blot制膠說明配置分離膠和濃縮膠,查詢Pink1和Parkin分子量,根據(jù)分子量大小選擇配置10%分離膠和20%濃縮膠。加入20 μL上樣蛋白,直流電電泳100 min,交流電電泳10 min。待蛋白電泳分離,等離子轉(zhuǎn)膜后加入Pink1、Caspase-3和Caspase-9兔抗人一抗(Abcom公司,1∶1000稀釋),4℃避光孵育過夜(>12 h)。12 h后PBST洗膜,每次20 min,加入山羊抗兔IgG二抗(艾美捷科技有限公司,1∶5000稀釋),避光孵育1.5 h,PBST洗膜,每次20 min,重復(fù)3次,DAB顯影液處理。Image J軟件分析蛋白條帶。
1.2.6 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移按照Transwell 6孔板試劑盒說明書要求,配置基質(zhì)膠,鋪在Transwell侵襲上室,4組細(xì)胞處理72 h后收集細(xì)胞,Transwell侵襲上室,孵育30 min,下室加入DMEM培養(yǎng)基,含15%FBS,1%鏈霉素,37℃的孵育箱孵育24 h,加入結(jié)晶紫染色試劑,孵育15 min后用倒置光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。
1.2.7 細(xì)胞增殖檢測(cè)4組細(xì)胞處理72 h后收集細(xì)胞。按照CCK-8試劑盒說明書加入10 μL CCK-8溶液。酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度。
1.2.8 細(xì)胞凋亡檢測(cè)4組細(xì)胞處理72 h后收集細(xì)胞。按照AV-PI試劑盒說明書檢測(cè)4組細(xì)胞凋亡率。流式細(xì)胞儀檢測(cè)上樣4組細(xì)胞量,分析4組細(xì)胞早期和晚期凋亡率。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 18.0分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料以±s表示,采用單因素方差分析,各組間比較采用q檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果Pink1、Parkin蛋白表達(dá)量對(duì)照組較多,0.5和1.0 g/L苦參堿處理組較少,抑制劑組多于0.5和1.0 g/L苦參堿處理組。見圖1—2。
圖1 各組Pink1表達(dá)
2.2 細(xì)胞的PCR檢測(cè)結(jié)果0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Pink1 mRNA的含量低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);1.0 g/L苦參堿處理組Pink1 mRNA含量低于0.5 g/L苦參堿處理組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Pink1 mRNA含量低于抑制劑組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);對(duì)照組Pink1 mRNA含量與抑制劑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3A)。Parkin和Bcl-2的mRNA表達(dá)特點(diǎn)與Pink1相同(圖3B-C);0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Bad mRNA含量高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);1.0 g/L苦參堿處理組Bad mRNA含量高于0.5 g/L處理組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Bad mRNA含量高于抑制劑組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);對(duì)照組Bad mRNA含量與抑制劑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3D);Bax、Caspase-6、Caspase-9和Caspase-3的mRNA表達(dá)特點(diǎn)與Bad相同(圖3E-H)。
圖3 各組Pink1、Parkin、Bcl-2、Bad、Bax、Caspase-6、Caspase-9及Caspase-3的mRNA表達(dá)
2.3 細(xì)胞的Western Blot檢測(cè)結(jié)果0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Pink1蛋白含量低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);1.0 g/L苦參堿處理組Pink1蛋白含量低于0.5 g/L苦參堿處理組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Pink1蛋白含量低于抑制劑組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);對(duì)照組Pink1蛋白含量與抑制劑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);Parkin蛋白表達(dá)特點(diǎn)與Pink1相同。見圖4。
圖4 各組細(xì)胞的Western Blot檢測(cè)結(jié)果
2.4 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)0.5和1.0 g/L處理組細(xì)胞的增殖能力低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);1.0 g/L處理組細(xì)胞增殖能力低于0.5 g/L處理組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);0.5和1.0 g/L處理組細(xì)胞的增殖能力低于抑制劑組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);對(duì)照組細(xì)胞的增殖能力與抑制劑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。
圖5 各組細(xì)胞的增殖能力
2.5 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)0.5和1.0 g/L處理組細(xì)胞的侵襲能力低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);1.0 g/L處理組細(xì)胞的侵襲能力低于0.5 g/L處理組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);0.5和1.0 g/L處理組細(xì)胞的侵襲能力低于抑制劑組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);對(duì)照組細(xì)胞的侵襲能力與抑制劑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖6。
圖6 各組細(xì)胞的侵襲能力
2.6 細(xì)胞總凋亡率檢測(cè)0.5和1.0 g/L處理組細(xì)胞的總凋亡率高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);1.0 g/L處理組細(xì)胞的總凋亡率高于0.5 g/L處理組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);0.5和1.0 g/L處理組細(xì)胞的總凋亡率高于抑制劑組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);對(duì)照組細(xì)胞的總凋亡率與抑制劑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖7。
圖7 各組細(xì)胞的凋亡率
圖2 各組Parkin表達(dá)
肝癌的惡性增殖與易復(fù)發(fā)特性是臨床比較棘手的問題,所以如何控制肝癌的增殖問題是治療肝癌的難點(diǎn)問題[12]。既往治療方法主要集中于手術(shù)切除,動(dòng)脈介入栓塞和放化療相結(jié)合,但是也存在術(shù)后效果差,復(fù)發(fā)率高,生存期短的問題[13-15]。隨著祖國(guó)醫(yī)學(xué)的繁榮,越來越多的學(xué)者將研究焦點(diǎn)集中于中醫(yī)藥對(duì)腫瘤的治療效果方面[16],本研究觀察苦參堿對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡以及遷移作用,此為本研究的創(chuàng)新點(diǎn)。
3.1 苦參堿對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用既往研究證明,苦參堿可以參與炎癥調(diào)節(jié)、心肌細(xì)胞的自噬以及肝臟的纖維化[17],對(duì)于腫瘤的療效方面報(bào)道較少。本研究利用CCK-8試劑盒檢測(cè)苦參堿對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響,結(jié)果表明,苦參堿可以抑制肝癌細(xì)胞增殖。利用Transwell試劑盒檢測(cè)苦參堿對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響,結(jié)果表明,苦參堿可以抑制肝癌細(xì)胞遷移。利用AV-PI凋亡試劑盒檢測(cè)苦參堿對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果表明苦參堿可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。
3.2 苦參堿可能通過Pink1/Parkin信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡線粒體功能失衡與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),其中線粒體內(nèi)膜和外膜電位的翻轉(zhuǎn)和線粒體功能的紊亂是細(xì)胞內(nèi)線粒體功能失衡的標(biāo)志之一[18]。多種信號(hào)通路參與線粒體功能失衡,Pink1/Parkin信號(hào)通路是其中比較經(jīng)典的通路之一,既往研究表明,Pink1/Parkin信號(hào)通路參與帕金森神經(jīng)系統(tǒng)退變過程[19]。另外也有學(xué)者證明,Pink1/Parkin信號(hào)通路可以通過激活線粒體融合蛋白2的過度表達(dá)進(jìn)一步調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的再灌注損傷過程[20]。本研究以Pink1/Parkin信號(hào)通路為切入點(diǎn),利用免疫熒光、RT-PCR和Western Blot檢測(cè)Pink1和Parkin的表達(dá),從基因和蛋白層面證明了苦參堿可以抑制Pink1和Parkin表達(dá)。結(jié)合AV-PI檢測(cè)結(jié)果,我們推論苦參堿可能通過抑制Pink1/Parkin信號(hào)通路表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。
B淋巴細(xì)胞瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白分子,其作用機(jī)制是促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)開放,抑制原癌前體蛋白激活,抑制細(xì)胞凋亡[21]。Bad和Bax蛋白是Bcl-2的下游蛋白,Bcl-2的激活通過AKT通路,抑制Bad和Bax蛋白表達(dá),從而抑制細(xì)胞凋亡。反之,Bcl-2的抑制會(huì)促進(jìn)Bad和Bax蛋白表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡[22]。本研究以Bcl-2,Bad和Bax為切入點(diǎn),利用RT-PCR方法從基因?qū)用嫣骄靠鄥A對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡作用。結(jié)果表明,苦參堿可以抑制Bcl-2表達(dá),促進(jìn)Bad和Bax表達(dá),達(dá)到促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的目的。
3.3 苦參堿對(duì)肝癌細(xì)胞的促凋亡作用具有劑量依賴性本研究結(jié)果表明,相較于0.5 g/L苦參堿組,1.0 g/L苦參堿組可以明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡;抑制Pink1/Parkin蛋白及Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)Bax和Bad表達(dá)。表明苦參堿對(duì)肝癌細(xì)胞的促凋亡作用具有劑量依賴性。
總之,苦參堿可抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力,促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡,并且具有劑量依賴性。