何 敏，岳鵬瑩，白寶平

延安大學(xué)西安創(chuàng)新學(xué)院，陜西 西安710100

肝癌是消化系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，具有惡性程度高，手術(shù)效果差，預(yù)后差的特點［1-2］。我國肝癌發(fā)病率居世界前列［3］。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計，我國每年肝癌的發(fā)病率為11%，并且有逐年增長趨勢［4］。目前針對肝癌的治療主要集中于放、化療及手術(shù)和介入治療［5-6］。

中藥具有毒副作用小，療效溫和的特點，對于身體狀況較差的晚期癌癥患者具有更佳的療效［7-8］?？鄥A是豆科植物苦參的主要成分，對慢性炎癥、心率失常及肝臟纖維化具有明顯療效，但是對于肝癌的治療效果不明確［9-11］。本研究探討苦參堿對肝癌的治療效果及對肝癌細胞系HepG2的增殖和凋亡作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與藥物Transwell試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；CCK-8檢測試劑盒（美國BD生物試劑有限公司）；AV-PI凋亡檢測試劑盒（美國BD生物試劑有限公司）；DMEM培養(yǎng)液（美國Gibco生物試劑公司）；胎牛血清（美國Gibco生物試劑公司）；兔抗人Pink1（美國Abcam生物有限公司）；Parkin抗體（美國Abcam生物有限公司）；Pink1、Parkin、Bcl-2、Bax、Bad、Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9引物（上海生物化學(xué)有限公司設(shè)計并提供）；NSC 66389型3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA，上海易匯生物科技有限公司)?？鄥A（北京伊塔生物科技有限公司，規(guī)格：20 mg；純度：HPLC≥98%）。

1.2 方法

1.2.1 肝癌細胞系HepG2的培養(yǎng)人源性肝癌細胞系HepG2受贈于北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院楊回清博士，培養(yǎng)基選擇DMEM培養(yǎng)基，加入15%胎牛血清和1%鏈霉素，置于5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱，待細胞形態(tài)規(guī)則，傳代穩(wěn)定后進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞分組根據(jù)苦參堿的處理方法將肝癌細胞分成4組。對照組：將等量磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）加入肝癌細胞，培養(yǎng)條件與另外兩組相同；0.5 g/L處理組：將0.5 g/L苦參堿2 mL加入肝癌細胞，與肝癌細胞共同培養(yǎng)處理72 h；1.0 g/L處理組：將1.0 g/L苦參堿2 mL加入肝癌細胞，與肝癌細胞共同培養(yǎng)處理72 h；抑制劑組：將Pink1/Parkin信號通路抑制劑3-MA 2 mL加入肝癌細胞，與肝癌細胞共同培養(yǎng)處理72 h。

1.2.3 免疫熒光法檢測Pink1，Parkin表達水平將上述4組細胞于24孔板處理72 h后，利用預(yù)熱的PBS溶液清洗3遍，每次5 min，加入25%甲醛溶液，固定細胞狀態(tài)。加入聚乙二醇辛基苯基醚-100（Triton-100），用于細胞破膜。加入5%胎牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA），孵育30 min，PBS溶液清洗3遍后加入預(yù)先稀釋好的Pink1、Parkin兔抗人一抗，4℃避光過夜孵育。PBS清洗后加入山羊抗兔GFP標記的二抗，避光孵育30 min，PBS清洗后加入Hoechst染色，孵育10 min，PBS清洗后，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 Real time PCR檢測Pink1、Parkin、Bcl-2、Bad、Bax及Caspase-3和Caspase-9的mRNA表達將上述4組細胞處理72 h后加入胰蛋白酶1 mL，混合均勻后提取細胞。采用Trizol法提取RNA，TaKaRa熒光定量PCR試劑盒進行熒光定量檢測，根據(jù)反應(yīng)體系的不同加入各試劑。采用L9700D型RT-PCR儀器[萊普特科學(xué)儀器（北京）有限公司]進行分析，總時間設(shè)置為2 h?；蛞镄蛄幸姳?。

表1 目的基因的引物序列

1.2.5 Western Blot檢 測Pink1、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達將上述4組細胞處理72 h后，收集細胞，RIPA細胞裂解液裂解細胞，提取總蛋白，95℃金屬浴煮沸后備用，同時按照Western Blot制膠說明配置分離膠和濃縮膠，查詢Pink1和Parkin分子量，根據(jù)分子量大小選擇配置10%分離膠和20%濃縮膠。加入20 μL上樣蛋白，直流電電泳100 min，交流電電泳10 min。待蛋白電泳分離，等離子轉(zhuǎn)膜后加入Pink1、Caspase-3和Caspase-9兔抗人一抗（Abcom公司，1∶1000稀釋），4℃避光孵育過夜（＞12 h）。12 h后PBST洗膜，每次20 min，加入山羊抗兔IgG二抗（艾美捷科技有限公司，1∶5000稀釋），避光孵育1.5 h，PBST洗膜，每次20 min，重復(fù)3次，DAB顯影液處理。Image J軟件分析蛋白條帶。

1.2.6 Transwell小室實驗檢測細胞遷移按照Transwell 6孔板試劑盒說明書要求，配置基質(zhì)膠，鋪在Transwell侵襲上室，4組細胞處理72 h后收集細胞，Transwell侵襲上室，孵育30 min，下室加入DMEM培養(yǎng)基，含15%FBS，1%鏈霉素，37℃的孵育箱孵育24 h，加入結(jié)晶紫染色試劑，孵育15 min后用倒置光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.2.7 細胞增殖檢測4組細胞處理72 h后收集細胞。按照CCK-8試劑盒說明書加入10 μL CCK-8溶液。酶標儀在450 nm處測定吸光度。

1.2.8 細胞凋亡檢測4組細胞處理72 h后收集細胞。按照AV-PI試劑盒說明書檢測4組細胞凋亡率。流式細胞儀檢測上樣4組細胞量，分析4組細胞早期和晚期凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 18.0分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，各組間比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光檢測結(jié)果Pink1、Parkin蛋白表達量對照組較多，0.5和1.0 g/L苦參堿處理組較少，抑制劑組多于0.5和1.0 g/L苦參堿處理組。見圖1—2。

圖1 各組Pink1表達

2.2 細胞的PCR檢測結(jié)果0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Pink1 mRNA的含量低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；1.0 g/L苦參堿處理組Pink1 mRNA含量低于0.5 g/L苦參堿處理組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Pink1 mRNA含量低于抑制劑組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組Pink1 mRNA含量與抑制劑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖3A）。Parkin和Bcl-2的mRNA表達特點與Pink1相同（圖3B-C）；0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Bad mRNA含量高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；1.0 g/L苦參堿處理組Bad mRNA含量高于0.5 g/L處理組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Bad mRNA含量高于抑制劑組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組Bad mRNA含量與抑制劑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖3D）；Bax、Caspase-6、Caspase-9和Caspase-3的mRNA表達特點與Bad相同（圖3E-H）。

圖3 各組Pink1、Parkin、Bcl-2、Bad、Bax、Caspase-6、Caspase-9及Caspase-3的mRNA表達

2.3 細胞的Western Blot檢測結(jié)果0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Pink1蛋白含量低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；1.0 g/L苦參堿處理組Pink1蛋白含量低于0.5 g/L苦參堿處理組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Pink1蛋白含量低于抑制劑組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組Pink1蛋白含量與抑制劑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；Parkin蛋白表達特點與Pink1相同。見圖4。

圖4 各組細胞的Western Blot檢測結(jié)果

2.4 細胞增殖能力檢測0.5和1.0 g/L處理組細胞的增殖能力低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；1.0 g/L處理組細胞增殖能力低于0.5 g/L處理組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；0.5和1.0 g/L處理組細胞的增殖能力低于抑制劑組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組細胞的增殖能力與抑制劑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 各組細胞的增殖能力

2.5 細胞侵襲能力檢測0.5和1.0 g/L處理組細胞的侵襲能力低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；1.0 g/L處理組細胞的侵襲能力低于0.5 g/L處理組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；0.5和1.0 g/L處理組細胞的侵襲能力低于抑制劑組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組細胞的侵襲能力與抑制劑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖6。

圖6 各組細胞的侵襲能力

2.6 細胞總凋亡率檢測0.5和1.0 g/L處理組細胞的總凋亡率高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；1.0 g/L處理組細胞的總凋亡率高于0.5 g/L處理組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；0.5和1.0 g/L處理組細胞的總凋亡率高于抑制劑組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組細胞的總凋亡率與抑制劑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖7。

圖7 各組細胞的凋亡率

圖2 各組Parkin表達

3 討論

肝癌的惡性增殖與易復(fù)發(fā)特性是臨床比較棘手的問題，所以如何控制肝癌的增殖問題是治療肝癌的難點問題［12］。既往治療方法主要集中于手術(shù)切除，動脈介入栓塞和放化療相結(jié)合，但是也存在術(shù)后效果差，復(fù)發(fā)率高，生存期短的問題［13-15］。隨著祖國醫(yī)學(xué)的繁榮，越來越多的學(xué)者將研究焦點集中于中醫(yī)藥對腫瘤的治療效果方面［16］，本研究觀察苦參堿對肝癌細胞的增殖和凋亡以及遷移作用，此為本研究的創(chuàng)新點。

3.1 苦參堿對肝癌細胞增殖的抑制作用既往研究證明，苦參堿可以參與炎癥調(diào)節(jié)、心肌細胞的自噬以及肝臟的纖維化［17］，對于腫瘤的療效方面報道較少。本研究利用CCK-8試劑盒檢測苦參堿對肝癌細胞增殖能力的影響，結(jié)果表明，苦參堿可以抑制肝癌細胞增殖。利用Transwell試劑盒檢測苦參堿對肝癌細胞遷移能力的影響，結(jié)果表明，苦參堿可以抑制肝癌細胞遷移。利用AV-PI凋亡試劑盒檢測苦參堿對肝癌細胞凋亡的影響，結(jié)果表明苦參堿可以促進肝癌細胞凋亡。

3.2 苦參堿可能通過Pink1/Parkin信號通路促進肝癌細胞凋亡線粒體功能失衡與細胞凋亡密切相關(guān)，其中線粒體內(nèi)膜和外膜電位的翻轉(zhuǎn)和線粒體功能的紊亂是細胞內(nèi)線粒體功能失衡的標志之一［18］。多種信號通路參與線粒體功能失衡，Pink1/Parkin信號通路是其中比較經(jīng)典的通路之一，既往研究表明，Pink1/Parkin信號通路參與帕金森神經(jīng)系統(tǒng)退變過程［19］。另外也有學(xué)者證明，Pink1/Parkin信號通路可以通過激活線粒體融合蛋白2的過度表達進一步調(diào)節(jié)心肌細胞的再灌注損傷過程［20］。本研究以Pink1/Parkin信號通路為切入點，利用免疫熒光、RT-PCR和Western Blot檢測Pink1和Parkin的表達，從基因和蛋白層面證明了苦參堿可以抑制Pink1和Parkin表達。結(jié)合AV-PI檢測結(jié)果，我們推論苦參堿可能通過抑制Pink1/Parkin信號通路表達促進肝癌細胞凋亡。

B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）是與細胞凋亡密切相關(guān)的蛋白分子，其作用機制是促進線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）開放，抑制原癌前體蛋白激活，抑制細胞凋亡［21］。Bad和Bax蛋白是Bcl-2的下游蛋白，Bcl-2的激活通過AKT通路，抑制Bad和Bax蛋白表達，從而抑制細胞凋亡。反之，Bcl-2的抑制會促進Bad和Bax蛋白表達，促進細胞凋亡［22］。本研究以Bcl-2，Bad和Bax為切入點，利用RT-PCR方法從基因?qū)用嫣骄靠鄥A對肝癌細胞的凋亡作用。結(jié)果表明，苦參堿可以抑制Bcl-2表達，促進Bad和Bax表達，達到促進肝癌細胞凋亡的目的。

3.3 苦參堿對肝癌細胞的促凋亡作用具有劑量依賴性本研究結(jié)果表明，相較于0.5 g/L苦參堿組，1.0 g/L苦參堿組可以明顯抑制肝癌細胞增殖，促進肝癌細胞凋亡；抑制Pink1/Parkin蛋白及Bcl-2的表達，促進Bax和Bad表達。表明苦參堿對肝癌細胞的促凋亡作用具有劑量依賴性。

總之，苦參堿可抑制肝癌細胞的增殖和侵襲能力，促進肝癌細胞凋亡，并且具有劑量依賴性。