何 敏，岳鵬瑩，白寶平

延安大學(xué)西安創(chuàng)新學(xué)院，陜西 西安710100

肝癌是消化系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，具有惡性程度高，手術(shù)效果差，預(yù)后差的特點(diǎn)［1-2］。我國(guó)肝癌發(fā)病率居世界前列［3］。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年肝癌的發(fā)病率為11%，并且有逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)［4］。目前針對(duì)肝癌的治療主要集中于放、化療及手術(shù)和介入治療［5-6］。

中藥具有毒副作用小，療效溫和的特點(diǎn)，對(duì)于身體狀況較差的晚期癌癥患者具有更佳的療效［7-8］?？鄥A是豆科植物苦參的主要成分，對(duì)慢性炎癥、心率失常及肝臟纖維化具有明顯療效，但是對(duì)于肝癌的治療效果不明確［9-11］。本研究探討苦參堿對(duì)肝癌的治療效果及對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2的增殖和凋亡作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與藥物Transwell試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；CCK-8檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD生物試劑有限公司）；AV-PI凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD生物試劑有限公司）；DMEM培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco生物試劑公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco生物試劑公司）；兔抗人Pink1（美國(guó)Abcam生物有限公司）；Parkin抗體（美國(guó)Abcam生物有限公司）；Pink1、Parkin、Bcl-2、Bax、Bad、Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9引物（上海生物化學(xué)有限公司設(shè)計(jì)并提供）；NSC 66389型3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA，上海易匯生物科技有限公司)?？鄥A（北京伊塔生物科技有限公司，規(guī)格：20 mg；純度：HPLC≥98%）。

1.2 方法

1.2.1 肝癌細(xì)胞系HepG2的培養(yǎng)人源性肝癌細(xì)胞系HepG2受贈(zèng)于北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院楊回清博士，培養(yǎng)基選擇DMEM培養(yǎng)基，加入15%胎牛血清和1%鏈霉素，置于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，待細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，傳代穩(wěn)定后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組根據(jù)苦參堿的處理方法將肝癌細(xì)胞分成4組。對(duì)照組：將等量磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）加入肝癌細(xì)胞，培養(yǎng)條件與另外兩組相同；0.5 g/L處理組：將0.5 g/L苦參堿2 mL加入肝癌細(xì)胞，與肝癌細(xì)胞共同培養(yǎng)處理72 h；1.0 g/L處理組：將1.0 g/L苦參堿2 mL加入肝癌細(xì)胞，與肝癌細(xì)胞共同培養(yǎng)處理72 h；抑制劑組：將Pink1/Parkin信號(hào)通路抑制劑3-MA 2 mL加入肝癌細(xì)胞，與肝癌細(xì)胞共同培養(yǎng)處理72 h。

1.2.3 免疫熒光法檢測(cè)Pink1，Parkin表達(dá)水平將上述4組細(xì)胞于24孔板處理72 h后，利用預(yù)熱的PBS溶液清洗3遍，每次5 min，加入25%甲醛溶液，固定細(xì)胞狀態(tài)。加入聚乙二醇辛基苯基醚-100（Triton-100），用于細(xì)胞破膜。加入5%胎牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA），孵育30 min，PBS溶液清洗3遍后加入預(yù)先稀釋好的Pink1、Parkin兔抗人一抗，4℃避光過夜孵育。PBS清洗后加入山羊抗兔GFP標(biāo)記的二抗，避光孵育30 min，PBS清洗后加入Hoechst染色，孵育10 min，PBS清洗后，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 Real time PCR檢測(cè)Pink1、Parkin、Bcl-2、Bad、Bax及Caspase-3和Caspase-9的mRNA表達(dá)將上述4組細(xì)胞處理72 h后加入胰蛋白酶1 mL，混合均勻后提取細(xì)胞。采用Trizol法提取RNA，TaKaRa熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，根據(jù)反應(yīng)體系的不同加入各試劑。采用L9700D型RT-PCR儀器[萊普特科學(xué)儀器（北京）有限公司]進(jìn)行分析，總時(shí)間設(shè)置為2 h?；蛞镄蛄幸姳?。

表1 目的基因的引物序列

1.2.5 Western Blot檢 測(cè)Pink1、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)將上述4組細(xì)胞處理72 h后，收集細(xì)胞，RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，95℃金屬浴煮沸后備用，同時(shí)按照Western Blot制膠說明配置分離膠和濃縮膠，查詢Pink1和Parkin分子量，根據(jù)分子量大小選擇配置10%分離膠和20%濃縮膠。加入20 μL上樣蛋白，直流電電泳100 min，交流電電泳10 min。待蛋白電泳分離，等離子轉(zhuǎn)膜后加入Pink1、Caspase-3和Caspase-9兔抗人一抗（Abcom公司，1∶1000稀釋），4℃避光孵育過夜（＞12 h）。12 h后PBST洗膜，每次20 min，加入山羊抗兔IgG二抗（艾美捷科技有限公司，1∶5000稀釋），避光孵育1.5 h，PBST洗膜，每次20 min，重復(fù)3次，DAB顯影液處理。Image J軟件分析蛋白條帶。

1.2.6 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移按照Transwell 6孔板試劑盒說明書要求，配置基質(zhì)膠，鋪在Transwell侵襲上室，4組細(xì)胞處理72 h后收集細(xì)胞，Transwell侵襲上室，孵育30 min，下室加入DMEM培養(yǎng)基，含15%FBS，1%鏈霉素，37℃的孵育箱孵育24 h，加入結(jié)晶紫染色試劑，孵育15 min后用倒置光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.2.7 細(xì)胞增殖檢測(cè)4組細(xì)胞處理72 h后收集細(xì)胞。按照CCK-8試劑盒說明書加入10 μL CCK-8溶液。酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.8 細(xì)胞凋亡檢測(cè)4組細(xì)胞處理72 h后收集細(xì)胞。按照AV-PI試劑盒說明書檢測(cè)4組細(xì)胞凋亡率。流式細(xì)胞儀檢測(cè)上樣4組細(xì)胞量，分析4組細(xì)胞早期和晚期凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 18.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，各組間比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果Pink1、Parkin蛋白表達(dá)量對(duì)照組較多，0.5和1.0 g/L苦參堿處理組較少，抑制劑組多于0.5和1.0 g/L苦參堿處理組。見圖1—2。

圖1 各組Pink1表達(dá)

2.2 細(xì)胞的PCR檢測(cè)結(jié)果0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Pink1 mRNA的含量低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；1.0 g/L苦參堿處理組Pink1 mRNA含量低于0.5 g/L苦參堿處理組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Pink1 mRNA含量低于抑制劑組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組Pink1 mRNA含量與抑制劑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3A）。Parkin和Bcl-2的mRNA表達(dá)特點(diǎn)與Pink1相同（圖3B-C）；0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Bad mRNA含量高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；1.0 g/L苦參堿處理組Bad mRNA含量高于0.5 g/L處理組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Bad mRNA含量高于抑制劑組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組Bad mRNA含量與抑制劑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3D）；Bax、Caspase-6、Caspase-9和Caspase-3的mRNA表達(dá)特點(diǎn)與Bad相同（圖3E-H）。

圖3 各組Pink1、Parkin、Bcl-2、Bad、Bax、Caspase-6、Caspase-9及Caspase-3的mRNA表達(dá)

2.3 細(xì)胞的Western Blot檢測(cè)結(jié)果0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Pink1蛋白含量低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；1.0 g/L苦參堿處理組Pink1蛋白含量低于0.5 g/L苦參堿處理組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；0.5和1.0 g/L苦參堿處理組Pink1蛋白含量低于抑制劑組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組Pink1蛋白含量與抑制劑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Parkin蛋白表達(dá)特點(diǎn)與Pink1相同。見圖4。

圖4 各組細(xì)胞的Western Blot檢測(cè)結(jié)果

2.4 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)0.5和1.0 g/L處理組細(xì)胞的增殖能力低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；1.0 g/L處理組細(xì)胞增殖能力低于0.5 g/L處理組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；0.5和1.0 g/L處理組細(xì)胞的增殖能力低于抑制劑組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組細(xì)胞的增殖能力與抑制劑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 各組細(xì)胞的增殖能力

2.5 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)0.5和1.0 g/L處理組細(xì)胞的侵襲能力低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；1.0 g/L處理組細(xì)胞的侵襲能力低于0.5 g/L處理組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；0.5和1.0 g/L處理組細(xì)胞的侵襲能力低于抑制劑組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組細(xì)胞的侵襲能力與抑制劑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖6。

圖6 各組細(xì)胞的侵襲能力

2.6 細(xì)胞總凋亡率檢測(cè)0.5和1.0 g/L處理組細(xì)胞的總凋亡率高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；1.0 g/L處理組細(xì)胞的總凋亡率高于0.5 g/L處理組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；0.5和1.0 g/L處理組細(xì)胞的總凋亡率高于抑制劑組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組細(xì)胞的總凋亡率與抑制劑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖7。

圖7 各組細(xì)胞的凋亡率

圖2 各組Parkin表達(dá)

3 討論

肝癌的惡性增殖與易復(fù)發(fā)特性是臨床比較棘手的問題，所以如何控制肝癌的增殖問題是治療肝癌的難點(diǎn)問題［12］。既往治療方法主要集中于手術(shù)切除，動(dòng)脈介入栓塞和放化療相結(jié)合，但是也存在術(shù)后效果差，復(fù)發(fā)率高，生存期短的問題［13-15］。隨著祖國(guó)醫(yī)學(xué)的繁榮，越來越多的學(xué)者將研究焦點(diǎn)集中于中醫(yī)藥對(duì)腫瘤的治療效果方面［16］，本研究觀察苦參堿對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡以及遷移作用，此為本研究的創(chuàng)新點(diǎn)。

3.1 苦參堿對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用既往研究證明，苦參堿可以參與炎癥調(diào)節(jié)、心肌細(xì)胞的自噬以及肝臟的纖維化［17］，對(duì)于腫瘤的療效方面報(bào)道較少。本研究利用CCK-8試劑盒檢測(cè)苦參堿對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果表明，苦參堿可以抑制肝癌細(xì)胞增殖。利用Transwell試劑盒檢測(cè)苦參堿對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果表明，苦參堿可以抑制肝癌細(xì)胞遷移。利用AV-PI凋亡試劑盒檢測(cè)苦參堿對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明苦參堿可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

3.2 苦參堿可能通過Pink1/Parkin信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡線粒體功能失衡與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其中線粒體內(nèi)膜和外膜電位的翻轉(zhuǎn)和線粒體功能的紊亂是細(xì)胞內(nèi)線粒體功能失衡的標(biāo)志之一［18］。多種信號(hào)通路參與線粒體功能失衡，Pink1/Parkin信號(hào)通路是其中比較經(jīng)典的通路之一，既往研究表明，Pink1/Parkin信號(hào)通路參與帕金森神經(jīng)系統(tǒng)退變過程［19］。另外也有學(xué)者證明，Pink1/Parkin信號(hào)通路可以通過激活線粒體融合蛋白2的過度表達(dá)進(jìn)一步調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的再灌注損傷過程［20］。本研究以Pink1/Parkin信號(hào)通路為切入點(diǎn)，利用免疫熒光、RT-PCR和Western Blot檢測(cè)Pink1和Parkin的表達(dá)，從基因和蛋白層面證明了苦參堿可以抑制Pink1和Parkin表達(dá)。結(jié)合AV-PI檢測(cè)結(jié)果，我們推論苦參堿可能通過抑制Pink1/Parkin信號(hào)通路表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

B淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白分子，其作用機(jī)制是促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）開放，抑制原癌前體蛋白激活，抑制細(xì)胞凋亡［21］。Bad和Bax蛋白是Bcl-2的下游蛋白，Bcl-2的激活通過AKT通路，抑制Bad和Bax蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。反之，Bcl-2的抑制會(huì)促進(jìn)Bad和Bax蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［22］。本研究以Bcl-2，Bad和Bax為切入點(diǎn)，利用RT-PCR方法從基因?qū)用嫣骄靠鄥A對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡作用。結(jié)果表明，苦參堿可以抑制Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)Bad和Bax表達(dá)，達(dá)到促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的目的。

3.3 苦參堿對(duì)肝癌細(xì)胞的促凋亡作用具有劑量依賴性本研究結(jié)果表明，相較于0.5 g/L苦參堿組，1.0 g/L苦參堿組可以明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡；抑制Pink1/Parkin蛋白及Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)Bax和Bad表達(dá)。表明苦參堿對(duì)肝癌細(xì)胞的促凋亡作用具有劑量依賴性。

總之，苦參堿可抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，并且具有劑量依賴性。