劉 凱，王 躍，聶 甜，郝敬全，黃 蓉，江勁波

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410208

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種惡性漿細(xì)胞腫瘤，占血液腫瘤的10%～15%，死亡率占血液系統(tǒng)惡性疾病的1/5，屬于病死率較高的難治性血液惡性腫瘤［1］。西醫(yī)采用以硼替唑米（bortezomib，BTZ）、來(lái)那度胺為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)/鞏固化療方案能最大程度降低腫瘤負(fù)荷，但復(fù)發(fā)率高［2］，副作用較大［3］。近年來(lái)，本課題組在中醫(yī)辨證中加入龍葵用于骨髓瘤各證型的治療。龍葵總堿是龍葵中的活性生物堿。前期研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)了其具有誘導(dǎo)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226凋亡的作用［4］。本研究通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)龍葵總堿對(duì)荷瘤小鼠骨髓瘤細(xì)胞的抑制作用，進(jìn)一步探究龍葵總堿抗骨髓瘤的相關(guān)機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新型抗骨髓瘤藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株4周齡SPF級(jí)BALB/c裸鼠90只，體質(zhì)量15～20 g，均為雌鼠，購(gòu)自上海寶特生命科學(xué)發(fā)展有限公司［SYXK（湘）2013-0005］。RPMI-8226骨髓瘤細(xì)胞株（武漢興旺生物科技有限公司，批號(hào)：5078）。

1.2 主要藥物與試劑硼替佐米注射劑（西安楊森制藥有限公司，批號(hào)：160823591，規(guī)格：1.0 mg）；龍葵總堿（蕪湖甙爾塔醫(yī)藥科技有限公司）；RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司，批號(hào)：YXQ-511）；胎牛血清（Gibco公司，批號(hào)：SH30070）。

1.3 儀器與設(shè)備DYY-6C型電泳儀和WD-9405B型水平搖床（北京六一儀器廠）；THZ-82A型恒溫?fù)u床（金壇榮華儀器制造有限公司）；MERCK MILLIPORE D24型紫外線超純水表（蘇州賽恩斯儀器有限公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；生物凈化工作臺(tái)（美國(guó)AIRTECH公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（香港HEAL FORCE公司）；萬(wàn)分之一電子天平（上海Ohaus公司）；HT-7800型透射電子顯微鏡（日本日立公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)將RPMI-8226骨髓瘤細(xì)胞株加入含10%胎牛血清，加雙抗（青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L）RPMI 1640培養(yǎng)液內(nèi)，置于37℃、50% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RPMI-8226骨髓瘤細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色拒染率95%以上，用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2次后懸于1∶1混勻無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/mL，收集細(xì)胞前一晚更換新鮮培養(yǎng)基。

1.4.2 荷瘤裸鼠模型的建立與分組

1.4.2.1 建模除空白組外，其余各組裸鼠均采用劉瑜法［5］建立骨髓瘤移植小鼠模型，即SPF環(huán)境下在每只裸鼠右前肢外側(cè)皮下接種細(xì)胞懸液2×106/0.2 mL。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：隨機(jī)取1只模型小鼠處死，取其瘤組織進(jìn)行病理檢測(cè)，包括HE染色和免疫組織化學(xué)染色、血清免疫固定電泳。HE染色后可見(jiàn)大量原始、幼稚漿細(xì)胞聚集分布，免疫組織化學(xué)染色后可見(jiàn)漿細(xì)胞CD38（+）或κ、λ輕鏈（+），血清免疫固定電泳檢測(cè)到M蛋白。

1.4.2.2 分組將造模成功裸鼠隨機(jī)分成5組各15只?？瞻捉M與模型組灌胃生理鹽水10 mL/（kg·d），硼替佐米組皮下注射硼替佐米0.1 mg/（kg·d），龍葵總堿高、中、低劑量組分別灌胃龍葵總堿50、25、12.5 mg/（kg·d）。每日2次，每次0.1 mL，連續(xù)灌胃14天。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 腫瘤組織觀察用15%的中性福爾馬林溶液固定腫瘤組織，梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片（5 μm厚），按順序依次記錄各樣品對(duì)應(yīng)包埋塊編號(hào)，用蘇木精-伊紅（HE）染色后觀察薄膜，放大倍數(shù)為400；眼眶靜脈叢取血行免疫固定電泳及免疫分型檢測(cè)。

1.5.2 龍葵總堿體內(nèi)抑瘤作用最后1次灌胃后絕對(duì)禁食6 h，第2日斷頸處死裸鼠，解剖荷瘤裸鼠取腫瘤稱質(zhì)量，根據(jù)瘤質(zhì)量計(jì)算抑瘤率：

抑瘤率(%)=（模型對(duì)照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/模型對(duì)照組平均瘤重×100%

另將瘤塊組織切小塊（按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)順序排列），液氮速凍，-80度保存。隔日測(cè)定瘤體積，腫瘤體積（mm3）=（a2×b）/2，公式中a為腫瘤寬度（mm）；b為腫瘤長(zhǎng)度（mm）。

1.5.3 細(xì)胞形態(tài)觀察取出樣本用磷酸鹽沖洗液（PBS）清洗3次，10 min/次，靜置60 min，1%鋨酸后固定液固定1 h，PBS清洗3次，10 min/次；用50%～100%酒精逐級(jí)脫水，37℃條件下嵌入環(huán)氧樹(shù)脂Epon812和丙酮混合物（1∶1）浸泡和包埋1 h，包埋劑與丙酮混合液（3∶1）浸透，過(guò)夜；純包埋劑浸透24 h，然后進(jìn)行包埋，在60℃條件下聚合48 h。Leica EM UC7超薄切片機(jī)切片，日立HT-7800透射電鏡觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 24.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，并且使用ANOVA模塊進(jìn)行多組間比較。

2 結(jié)果

2.1 骨髓瘤小鼠模型建立接種人骨髓瘤細(xì)胞第5天后種植部位即可觸及新生組織，接種第10天后全部小鼠皮下開(kāi)始出現(xiàn)腫塊，解剖出腫瘤組織行石蠟切片染色及血清免疫蛋白電泳、流式分型檢測(cè)，證實(shí)所取組織確為多發(fā)性骨髓瘤組織。見(jiàn)圖1—4。

圖1 成瘤裸鼠

圖2 瘤組織石蠟切片（HE×400）

圖3 免疫蛋白電泳結(jié)果κ輕鏈（+）

圖4 流式細(xì)胞表達(dá)CD38（+）與cKappa

2.2 龍葵總堿對(duì)荷瘤裸鼠瘤體積和瘤重的影響與模型組對(duì)比，龍葵總堿灌胃或硼替佐米注射荷瘤裸鼠，結(jié)果顯示龍葵總堿對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)具有抑制作用。龍葵總堿低、中、高劑量組和硼替佐米組的瘤重及瘤體積較模型組減輕、變小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；龍葵總堿中、高劑量組的抑瘤率分別為42.4%和53.8%，均高于低劑量組的19.2%（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組移植瘤瘤重、瘤體積和抑瘤率的比較

2.3 龍葵總堿對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤細(xì)胞的影響模型組腫瘤細(xì)胞中存在大量原漿和幼漿細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞體積大，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，細(xì)胞核大，染色質(zhì)濃縮在核膜下，深染并濃縮成塊狀，典型的有絲分裂細(xì)胞明顯。龍葵總堿高、中、低劑量組均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞破碎和凋亡，細(xì)胞排列呈不同程度的疏松狀，可見(jiàn)大片細(xì)胞壞死，而硼替佐米組細(xì)胞形態(tài)呈破碎狀，原漿和幼漿細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞染色質(zhì)明顯疏松。見(jiàn)圖5。

圖5 各組荷瘤裸鼠腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)（×400）

2.4龍葵總堿對(duì)荷瘤裸鼠超微結(jié)構(gòu)的影響模型組瘤細(xì)胞外形多數(shù)規(guī)則，細(xì)胞核多呈圓形或橢圓形，核內(nèi)常染色質(zhì)占優(yōu)勢(shì)，核仁明顯而大，胞漿多少不定，并出現(xiàn)自噬小體，細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)極豐富。部分板層狀排列，且有不同程度的擴(kuò)張，電子密度高低不等，線粒體及包涵體多少不一（圖6A）；龍葵總堿低劑量組瘤細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)濃縮，電子密度中度，線粒體數(shù)量減少，核內(nèi)異染色質(zhì)在周邊及異質(zhì)中部分凝集成塊（圖6B）；龍葵總堿中劑量組瘤細(xì)胞體積進(jìn)一步縮小，細(xì)胞染色質(zhì)固縮，核邊集，細(xì)胞漿濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)疏松形成空泡，并開(kāi)始出現(xiàn)自噬細(xì)胞（圖6C黑色箭頭所指）。龍葵總堿高劑量組細(xì)胞呈晚期凋亡形態(tài)，已無(wú)完整的細(xì)胞膜，骨髓瘤細(xì)胞周圍出現(xiàn)大量的自噬細(xì)胞（圖6D）。

圖6 TEM下各組瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（×10000）

3 討論

龍葵味苦、微甘，《藥性論》載其有清熱解毒、活血散瘀之功，龍葵總堿是龍葵中分離出來(lái)的甾體生物堿［6］，廣泛存在于馬鈴薯、番茄及茄子等茄科植物組織和器官中。AKSHATHA等［7］通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，龍葵堿具有誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌的凋亡作用。另有研究證明，對(duì)胃癌［8］、白血?。?］等具有廣泛抗腫瘤活性。劉新民等［10］研究表明：龍葵堿能夠改變腫瘤細(xì)胞ATP酶的活性、阻斷NF-κB信號(hào)通路的介導(dǎo)等諸多媒介來(lái)改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與作用，最終實(shí)現(xiàn)抗瘤目的。顧錦華等［11］觀察復(fù)方龍葵膠囊對(duì)荷瘤小鼠的作用，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)藥物可促進(jìn)S180肉瘤細(xì)胞凋亡。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)龍葵總堿在誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤凋亡方面的報(bào)道相對(duì)較少。本課題組將龍葵廣泛用于漿細(xì)胞骨髓瘤的各階段治療，結(jié)果表明能減少M(fèi)M患者的腫瘤負(fù)荷，降低血清M蛋白含量，提高抗骨髓瘤療效［12］。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明龍葵總堿可以抑制骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞NF-κB表達(dá)，呈藥物濃度與時(shí)間依賴性，促骨髓瘤細(xì)胞凋亡作用明顯［4］。

本研究結(jié)果顯示龍葵總堿對(duì)荷瘤裸鼠的骨髓瘤細(xì)胞具有明顯抑制作用，呈劑量依賴性。近年來(lái)，隨著細(xì)胞遺傳學(xué)與分子遺傳學(xué)的不斷深入，臨床將誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡視為骨髓瘤治療有效的重要途徑。在觀察龍葵總堿對(duì)骨髓瘤荷瘤小鼠細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，透射電鏡下不同劑量龍葵堿組腫瘤細(xì)胞圖中均出現(xiàn)胞質(zhì)空泡樣變，核固縮以及明顯的凋亡小體，隨著龍葵總堿劑量的提高，自噬小體數(shù)量升高，自噬活性可能被上調(diào)，故引起骨髓瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能為龍葵總堿引起的強(qiáng)烈自噬減弱了骨髓瘤細(xì)胞的生存力。自噬在骨髓瘤細(xì)胞凋亡中起雙刃劍作用［13］。一為抑制自噬誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡，硼替佐米作為一種重要的抗骨髓瘤藥物，目前認(rèn)為其誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一在于抑制未折疊或者錯(cuò)誤折疊蛋白的降解，引起持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而促使細(xì)胞調(diào)亡。二為促進(jìn)細(xì)胞自噬，當(dāng)過(guò)度自噬時(shí)則有可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡，即自噬性死亡。ZISMANOV等［14］團(tuán)隊(duì)證實(shí)細(xì)胞膜蛋白CD81和CD82在被重新轉(zhuǎn)染表達(dá)于骨髓瘤細(xì)胞時(shí)，能致使細(xì)胞凋亡，而其根本途徑由自噬性死亡執(zhí)行。地塞米松是治療MM的主要藥物之一，其與硼替佐米聯(lián)合使用時(shí)促使細(xì)胞自噬水平顯著增強(qiáng)，進(jìn)而擴(kuò)增殺傷多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞［15］。

本研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)以龍葵總堿為主要成分的抗骨髓瘤靶點(diǎn)新藥提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，下一步研究將通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探究龍葵總堿如何調(diào)節(jié)相關(guān)基因促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞凋亡。