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        芪麝丸對背根節(jié)神經(jīng)元COX2-PGE2-EP信號通路影響的體外研究*

        2021-12-30 10:35:32陳蘋華唐占英袁薇娜胡志俊
        西部中醫(yī)藥 2021年11期
        關(guān)鍵詞:根性背根神經(jīng)痛

        陳蘋華,唐占英,劉 丹,袁薇娜,李 攀,胡志俊

        上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院,上海230000

        神經(jīng)根型頸椎病往往是由頸背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)或脊神經(jīng)后根(dorsal root,DR)受到傷害性刺激所產(chǎn)生的以疼痛、麻木為主的綜合征,有學(xué)者[1]曾采用WHOQOL-BREF量表(世界衛(wèi)生組織生活質(zhì)量測定量表簡表)追蹤調(diào)查了神經(jīng)根型頸椎病患者不同維度的生活質(zhì)量,研究發(fā)現(xiàn)生理領(lǐng)域得分最低,并且隨著病程的延長,其得分越低,由此可見,神經(jīng)根受壓所帶來的一系列癥狀,如頸部伴上肢的麻木、疼痛、感覺異常等嚴(yán)重并長期影響著人們的生活質(zhì)量。其病理變化多為脊神經(jīng)節(jié)受到機械壓迫或炎性因子刺激等而引起的缺血、水腫等神經(jīng)功能異常,屬于根性神經(jīng)痛的一種。DRG在根性神經(jīng)痛中起不可或缺的作用。DRG神經(jīng)元不僅可以自身釋放炎性介質(zhì),存在于其膜上的離子通道也介導(dǎo)痛覺異常的發(fā)生發(fā)展。芪麝丸是基于施杞教授提出的“以氣為主、以血為先”的理論而研發(fā)的中成藥,由黃芪、川芎、人工麝香、青風(fēng)藤、防己和人工牛黃為主要成分制成,主要用于治療氣虛血瘀型神經(jīng)根型頸椎病。本研究基于環(huán)氧合酶2-前列腺素E2的受體(cyclooxygenase 2-prostaglandin E2-E-prostanoid,COX2-PGE2-EP)信號通路探究芪麝丸對DRG的影響,進一步驗證芪麝丸對根性神經(jīng)痛的臨床療效。

        1 材料與方法

        1.1 動物SPF級SD大鼠1周齡(雌雄不限),體質(zhì)量(23±3)g,購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司,實驗動物許可證號:2007000542991,動物實驗場所合格證號:上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室(SYXK滬2003-0002)。

        1.2 藥物芪麝丸(上海黃海制藥有限責(zé)任公司,批號:161101,規(guī)格:25丸/袋)。

        1.3 主要試劑DMEM/F-12培養(yǎng)基(1∶1)(上海源培生物科技股份有限公司,F(xiàn)40515/L320KJ);0.25%胰蛋白酶EDTA溶液(上海源培生物科技股份有限公司,CA4061/S310KJ);青霉素-鏈霉素溶液(碧云天生物技術(shù)有限公司,100X,1709239/030311B);阿糖胞苷(Macklin公司);胎牛血清(Gibco公司,1715752/10099141);腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α,上海鑫樂生物,1707JZ31rMH/xlEr0359);Super Script VILO cDNA Synthesis Kit、PowerUp SYBR Green Master Mix(vazyme,7E252D8/R12301);Pierce BCA蛋白濃度測定試劑盒A/B(日本TaKaRa公司,A4801A/T9300A1、A1101B/T9300A2);PTGS2(COX-2)Antibody COX2抗體(boster公司,31296I11P56/ba0738);Anti-Prostaglandin E Receptor EP4抗體(abcam公司,GR2738291/ab93486)。

        1.4 主要儀器SZX7型體視顯微鏡(Olympus奧林巴斯公司);HFsafe-1500LC型生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司);371型CO2培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司);TDZ5-WS型臺式低速離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司);IX73型倒置相差顯微鏡(Olympus奧林巴斯公司);ViiA7型熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司);Spectramax plus384型酶標(biāo)儀(江蘇美達實驗室設(shè)備有限公司);AI600型Western掃膜系統(tǒng)(General Electric公司)。

        1.5 芪麝丸藥液的配制將芪麝丸與DMEM/F-12培養(yǎng)基按照1 g/2 mL的比例加入到2 mL離心管中,勻漿機中勻漿,并充分混勻;37℃條件下水浴2 h;4℃冰箱內(nèi)靜置24 h;過200目,70 μm的細(xì)胞過濾器過濾除菌,制成母液,濃度為50%,分裝保存于-20℃的冰箱內(nèi)。

        1.6 芪麝丸藥液濃度的篩選收集背根節(jié)神經(jīng)元,分別加入0.5%、0.35%、0.25%和0.1%4個濃度梯度的芪麝丸藥液,結(jié)果顯示0.35%的芪麝丸對背根節(jié)神經(jīng)元的毒性作用小,可以有效抑制DRG神經(jīng)元中COX2-PGE2-EP信號通路中環(huán)氧合酶2的信使核糖核酸(cyclooxygenase 2 messenger RNA,COX2 mRNA)、EP2 mRNA、EP4 mRNA和 環(huán) 氧合酶2(cyclooxygenase,COX2)蛋白、EP4蛋白的表達,故本實驗選擇最佳濃度為0.35%的芪麝丸藥液。

        1.7 背根節(jié)取材、培養(yǎng)與分組

        1.7.1 背根節(jié)取材與培養(yǎng)1)無菌條件下解剖并游離大鼠脊柱,沿著脊柱前、后正中線剖開成兩部分,并向兩側(cè)翻開;2)在體視顯微鏡(40×)下,輕牽拉脊髓翻向外側(cè),可在脊柱內(nèi)部側(cè)方的凹槽內(nèi)發(fā)現(xiàn)一膨大結(jié)構(gòu),即DRG;3)分離周圍組織,盡可能留下膨大部分,即得到完整的背根節(jié);4)用0.25%胰蛋白酶EDTA消化,接種于6孔板中,標(biāo)記為對照組、模型組和芪麝丸組,放入36℃,5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。定時換液,培養(yǎng)48 h后加入10 μmol/L的阿糖胞苷溶液純化,第7天時收集細(xì)胞備用。

        1.7.2 分組將培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元分為對照組、模型組和芪麝丸組。對照組不施加干預(yù)因素;模型組加入100 ng/mL的TNF-α溶液;芪麝丸組加入100 ng/mL的TNF-α溶液及0.35%的芪麝丸藥液。

        1.8 檢測指標(biāo)

        1.8.1 背根節(jié)COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA的檢測制備并分選背根節(jié)神經(jīng)元,接種于6孔板中,各組干預(yù)后于第7天收集細(xì)胞,采用實時定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction,PCR法)檢測COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA的表達。

        1.8.2 背根節(jié)COX2蛋白、EP2蛋白、EP4蛋白的檢測制備并分選背根節(jié)神經(jīng)元,接種于6孔板中,各組干預(yù)后于第7天收集細(xì)胞,采用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)法檢測COX2蛋白、EP4蛋白的表達。

        1.9 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù),在正態(tài)性和方差齊性下采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),以±s表示,組間比較采用LSD法,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;不滿足條件的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗,以中位數(shù)M表示,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 離體培養(yǎng)的背根節(jié)神經(jīng)元對照組DRG神經(jīng)元胞體較大,呈橢圓形,胞體中間顏色深,邊緣顏色較淡,呈透明狀光暈樣;DRG神經(jīng)元有的呈單個散在分布,有的聚集成島狀;DRG神經(jīng)元發(fā)出神經(jīng)纖維軸突較粗,相互連接交互形成神經(jīng)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);散見少量呈紡錘形的雪旺細(xì)胞以及形狀不規(guī)則的成纖維細(xì)胞。模型組加入100 ng/mL TNF-α溶液后,DRG神經(jīng)元發(fā)出的神經(jīng)軸突聚集成簇狀分布,神經(jīng)元胞體也聚集成島狀,數(shù)目相對減少;加入中藥芪麝丸藥液后,DRG神經(jīng)元胞體多呈串珠樣分布,胞體顏色加深,神經(jīng)纖維網(wǎng)絡(luò)較前稀疏,但神經(jīng)纖維增粗。見圖1。

        圖1 各組DRG神經(jīng)元變化情況

        2.2 各組背根節(jié)神經(jīng)元中COX2-PGE2-EP信號通路表達情況模型組中COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA的表達均有所增加,COX2蛋白和EP4蛋白表達上調(diào);與對照組比較,COX2 mRNA的表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),EP4蛋白表達差異顯著(P<0.01);EP2 mRNA、EP4 mRNA、COX2蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示TNF-α成功誘導(dǎo)背根節(jié)神經(jīng)元發(fā)生“炎癥性改變”。與模型組比較,芪麝丸組DRG神經(jīng)元中COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA表達下降,其中COX2 mRNA表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,芪麝丸組DRG神經(jīng)元中COX2蛋白和EP4蛋白含量有所降低,其中EP4蛋白表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1、圖2—3。

        表1 各組背根節(jié)神經(jīng)元COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA、COX2蛋白和EP4蛋白的表達情況(±s)

        表1 各組背根節(jié)神經(jīng)元COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA、COX2蛋白和EP4蛋白的表達情況(±s)

        注:與對照組比較,*表示P<0.05,**表示P<0.05,△表示P>0.05

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        圖2 對照組與模型組大鼠DRGns中蛋白表達

        3 討論

        根性神經(jīng)痛是臨床常見的一種病情復(fù)雜、反復(fù)發(fā)作的慢性疼痛類疾病。主要是由于DRG或DR受到傷害性刺激而產(chǎn)生疼痛癥狀,往往由于脊神經(jīng)后根,特別是脊神經(jīng)節(jié)受到機械壓迫或炎性因子刺激而引起的一種病理變化。

        無論是椎間盤突出[2]、腫瘤壓迫占位或者是外周神經(jīng)炎癥反應(yīng)等,都能夠造成DRG和DR損傷,受損的DRG和DR可在局部產(chǎn)生大量相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)和炎性因子,主要包括COX2、前列腺素E2(PGE2)[3]和TNF-α等。其中COX2限速酶能夠促進花生四烯酸合成PGE2,以此結(jié)合并激活PGE2的4個G蛋白偶聯(lián)受體EP1、EP2、EP3和EP4,進一步誘發(fā)炎癥和根性神經(jīng)痛的發(fā)生。

        圖3 模型組與芪麝丸組大鼠DRGns中蛋白表達

        研究發(fā)現(xiàn),TNF-α可以通過誘導(dǎo)COX2、PGE2和EP表達增加激活COX2-PGE2-EP信號通路。在SNI大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中,TNF-α mRNA短暫性表達增加,24~48 h后COX2和PGI2合成酶含量在內(nèi)皮細(xì)胞中增加;鞘內(nèi)注射TNF-α可以增加內(nèi)皮細(xì)胞中COX2和PGI2合成酶mRNA的含量,這些發(fā)現(xiàn)表明神經(jīng)損傷后脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中產(chǎn)生的TNF-α可能誘導(dǎo)COX2和前列腺素類合成酶產(chǎn)生,進而參與神經(jīng)性痛的產(chǎn)生[4]。在非神經(jīng)細(xì)胞中,如纖維母細(xì)胞,TNF-α可在不同時間點誘導(dǎo)產(chǎn)生COX2和PGE2[5];在人羊膜細(xì)胞中,在外源性花生四烯酸存在的條件下,TNF-α可以持續(xù)誘導(dǎo)產(chǎn)生PGE2[6];如人類上皮細(xì)胞中加入TNF-α后,可呈劑量和時間依賴性誘導(dǎo)COX2和PGE2的表達[7]。由此可認(rèn)為TNF-α能夠通過不同機制誘導(dǎo)COX2和PGE2的表達,參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生。

        中醫(yī)古籍中并無根性神經(jīng)痛的相關(guān)記載,臨床常見的根性神經(jīng)痛如神經(jīng)根型頸椎病可根據(jù)其癥狀歸于“痹癥”范疇。施杞教授認(rèn)為慢性筋骨病屬中醫(yī)“痹癥”范疇[8],并創(chuàng)立了“益氣化瘀方”的代表方劑芪麝丸。王擁軍等制備長期直立大鼠模型,發(fā)現(xiàn)模型組大鼠L5椎體邊緣發(fā)生骨質(zhì)增生改變,受壓的椎間盤與上下位椎體之間非基質(zhì)成分含量增加,Ⅰ型和Ⅲ型膠原增加,同時X型膠原蛋白(type X collegan,Col X)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及轉(zhuǎn)化生長因子β1(transform growth factorβ1,TGF-β1)表達增強,芪麝丸干預(yù)后能夠降低Col X和VEGF的表達量和椎間盤膠原α1(collagenα1,Col10α1)及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)基因的表達[9-10]。芪麝丸干預(yù)氣虛血瘀型大鼠模型后,能夠下調(diào)高表達的磷脂酶A2(PLA2)和PGE2水平,延長其游泳時間??梢哉J(rèn)為芪麝丸能改善氣虛血瘀型大鼠癥狀[11]。因神經(jīng)根型頸椎病多為突出的椎間盤或增生的骨贅壓迫刺激脊神經(jīng)根產(chǎn)生炎癥,故在體外培養(yǎng)炎性細(xì)胞-巨噬細(xì)胞模擬神經(jīng)根型頸椎病的炎性環(huán)境,發(fā)現(xiàn)芪麝丸能夠通過減少NO含量和COX2蛋白表達[12]進而抑制炎癥反應(yīng)。與其他藥物相比,芪麝丸能夠有效改善患者頸痛、上肢麻木的癥狀,且不良反應(yīng)少[13-16]。

        本實驗在離體培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中加入TNF-α模擬體外DRG或DR受壓的炎性環(huán)境。發(fā)現(xiàn)TNF-α可以促進COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA和COX2蛋白、EP4蛋白的表達,而芪麝丸藥液能夠在一定程 度 上 抑 制COX2 mRNA、EP2 mRNA、EP4 mRNA和COX2蛋白、EP4蛋白表達,提示芪麝丸可以通過調(diào)控背根節(jié)COX2-PGE2-EP信號通路發(fā)揮抗炎、改善局部水腫等緩解根性神經(jīng)痛的作用。

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