張欣雨 王智宇 趙文元 馬保錄 陶 濤

(1 青海省交通醫(yī)院泌尿外科，西寧市 810008，電子郵箱：mnwk5825@sohu.com；2 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，河南省鄭州市 450000；3 青海大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，西寧市 810008)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，臨床上常采用手術(shù)聯(lián)合經(jīng)膀胱灌注進(jìn)行治療，雖然該方法的療效較好，但是腫瘤復(fù)發(fā)仍然是膀胱癌治療中亟待解決的一大難題[1-4]。姜黃素是從姜黃科植物中提取得到的有效成分，在莪術(shù)、姜黃等中藥材的根莖中含量較多。有研究表明，姜黃素對(duì)宮頸癌、卵巢癌及淋巴癌細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制效果，是較為廣譜的腫瘤抑制化合物，且毒性及副作用很小[5-8]。但目前有關(guān)姜黃素對(duì)膀胱癌的治療作用及其作用機(jī)制的研究相對(duì)較少。有學(xué)者指出，機(jī)體微環(huán)境氧化應(yīng)激反應(yīng)亢進(jìn)和抗氧化酶的活力受損在膀胱癌的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，此外，炎癥反應(yīng)也參與了膀胱癌的發(fā)展過(guò)程[9-13]。本研究分析姜黃素對(duì)膀胱癌模型大鼠的干預(yù)效果，以及對(duì)膀胱癌大鼠機(jī)體炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，為膀胱癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取100只健康雄性5周齡SD大鼠(購(gòu)自中科院動(dòng)物研究所，許可號(hào)：2019A210)，體重140～160 g，實(shí)驗(yàn)前于21℃～24℃飼養(yǎng)條件下，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 N-丁基-N-(4-羥丁基)亞硝基胺[N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine,BBN]購(gòu)自日本化成工業(yè)株式會(huì)社(批號(hào)：20190203)，姜黃素購(gòu)自西安正東生物科技有限公司(純度>98%，批號(hào)：458-37-7)，白細(xì)胞介素1β(interleukin,IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(批號(hào)：20190217)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)ELISA試劑盒(批號(hào)：20190621)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)ELISA試劑盒(批號(hào)：20201202)均購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司，自由基一氧化氮(批號(hào)：20181208)、丙二醛(批號(hào)：20200211)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(批號(hào)：20191211)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20200209)均購(gòu)自日本同仁化學(xué)公司。酶標(biāo)儀(SuPerMax 3000FL)購(gòu)自上海閃譜生物科技有限公司，電動(dòng)移液器購(gòu)自北京金時(shí)速儀器設(shè)備有限公司，高速離心機(jī)(型號(hào)：MiniSpin)購(gòu)自浙江納德科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及建模方法：按照隨機(jī)數(shù)字表法，將100只雄性SD大鼠分為對(duì)照組、模型組、60 mg/kg姜黃素組、120 mg/kg姜黃素組，各25只。使用200 mg/0.5 mL BBN(按乙醇：水為1 ∶4的比例，配制成BBN混懸液)，以200 ms/0.5 mL的速度對(duì)模型組和姜黃素組大鼠進(jìn)行灌胃，對(duì)照組大鼠給予等量的生理鹽水進(jìn)行灌胃，2次/周，每次時(shí)間間隔為2～3 d，連續(xù)灌胃8周。8周后通過(guò)CT掃描觀察大鼠膀胱組織，正常膀胱組織黏膜光滑，未見(jiàn)腫塊，若組織黏膜出現(xiàn)異常，并有新生腫塊證明膀胱癌建模成功。本實(shí)驗(yàn)中模型組和姜黃素組大鼠均建模成功。

1.3.2 干預(yù)方法：從第一次BBN開(kāi)始灌胃的前7 d開(kāi)始，給予60 mg/kg姜黃素組和120 mg/kg姜黃素組大鼠相應(yīng)劑量的200 μL姜黃素進(jìn)行灌胃干預(yù)，1次/d，連續(xù)干預(yù)8周，之后給予200 μL生理鹽水進(jìn)行灌胃，1次/d，持續(xù)操作8個(gè)月；對(duì)照組及模型組大鼠則在相同時(shí)間段給予200 μL生理鹽水進(jìn)行灌胃，1次/d，持續(xù)操作8個(gè)月。各組中由于灌胃引發(fā)內(nèi)臟受損或死亡的大鼠予以剔除，最終納入對(duì)照組20只、模型組25只、60 mg/kg姜黃素組24只、120 mg/kg姜黃素組24只。

1.3.3 標(biāo)本采集：灌胃結(jié)束后，收集各組大鼠股靜脈血1～2 mL，室溫條件下靜置 25 min，隨后在4℃下以2 000 r/min離心15 min，取上清分裝于0.5 mL的EP管中，并儲(chǔ)存于-20℃的冰箱中備用。

1.3.4 炎癥、氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)：采用ELISA法檢測(cè)血清炎癥指標(biāo)IL-1β、CRP以及TGF-β1水平，采用硝酸還原酶法檢測(cè)血清一氧化氮水平，采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)血清丙二醛水平，采用水溶性四唑鹽法檢測(cè)血清SOD水平，采用Fe3+還原法檢測(cè)血清T-AOC水平，所有操作步驟均嚴(yán)格按照試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.3.5 大鼠膀胱組織的病理變化：股動(dòng)脈采血后采用頸椎脫臼法處死各組大鼠，剝離完整的大鼠膀胱，用10%的甲醛溶液固定膀胱組織后進(jìn)行石蠟包埋，制作4 μm石蠟切片，常規(guī)進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，顯微鏡下觀察組織的病理變化，觀察上皮組織增厚現(xiàn)象、膀胱細(xì)胞的層次、細(xì)胞核的大小均勻情況等，并行病理檢測(cè)診斷膀胱癌的類(lèi)型，包括浸潤(rùn)性尿路上皮癌與非浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠血清炎癥指標(biāo)水平的比較 4組大鼠血清IL-1β、CRP及TGF-β1等炎癥指標(biāo)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。其中，模型組、60 mg/kg姜黃素組大鼠的血清IL-1β、CRP和TGF-β1水平均高于對(duì)照組(均P<0.05)，而120 mg/kg姜黃素組大鼠的血清IL-1β、TGF-β1水平與對(duì)照組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，但血清CRP水平高于對(duì)照組(P<0.05)；60 mg/kg姜黃素組、120 mg/kg姜黃素組大鼠血清IL-1β、CRP及TGF-β1水平均低于模型組(均P<0.05)，且120 mg/kg姜黃素組大鼠血清IL-1β、CRP及TGF-β1水平均低于60 mg/kg姜黃素組(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4組大鼠血清炎癥指標(biāo)水平的比較(x±s)

2.2 4組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的比較 4組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。其中，模型組、60 mg/kg姜黃素組大鼠血清一氧化氮、丙二醛水平均高于對(duì)照組，血清SOD、T-AOC水平均低于對(duì)照組(均P<0.05)，而120 mg/kg姜黃素組大鼠血清丙二醛水平高于對(duì)照組、SOD水平低于對(duì)照組(均P<0.05)；60 mg/kg姜黃素組、120 mg/kg姜黃素組大鼠血清一氧化氮、丙二醛水平均低于模型組，血清SOD和T-AOC水平均高于模型組，且120 mg/kg姜黃素組大鼠血清一氧化氮、丙二醛水平均低于60 mg/kg姜黃素組，血清SOD、T-AOC水平均高于60 mg/kg姜黃素組(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 4組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的比較(x±s)

2.3 各組大鼠膀胱組織的病理變化情況 HE染色后，顯微鏡下可見(jiàn)對(duì)照組大鼠的膀胱組織正常(圖1A)，而模型組和不同劑量姜黃素組大鼠的膀胱組織出現(xiàn)程度不同的癌變現(xiàn)象，均能夠觀察到增厚的被覆移行上皮組織，并且膀胱細(xì)胞的層次變多，細(xì)胞核的大小出現(xiàn)不均勻現(xiàn)象(圖1B、C、D)；但與模型組相比，60 mg/kg姜黃素組大鼠膀胱組織的細(xì)胞層次變少(圖1C)，120 mg/kg姜黃素組大鼠膀胱組織中部分細(xì)胞形態(tài)規(guī)則并且表現(xiàn)為不典型增生(圖1D)。

圖1 4組大鼠膀胱病理學(xué)改變(HE染色，×100)注：A、B、C、D分別表示對(duì)照組、模型組、60 mg/kg姜黃素組、120 mg/kg姜黃素組。

模型組、60 mg/kg姜黃素組、120 mg/kg姜黃素組大鼠膀胱癌病理類(lèi)型比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中120 mg/kg姜黃素組非浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌的比例高于模型組，而浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌的比例低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 4組大鼠膀胱癌類(lèi)型的比較[n(%)]

3 討 論

膀胱癌是全球發(fā)病率位居第10的癌癥，同時(shí)也是泌尿系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率排名第1的疾病[14]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，相較于1990年，2017年全球膀胱癌的發(fā)病人數(shù)增長(zhǎng)90%以上，死亡人數(shù)增長(zhǎng)70%左右，60歲的老年人群發(fā)病率更高，隨著我國(guó)進(jìn)入老齡化社會(huì)，膀胱癌的發(fā)病以及死亡人數(shù)均呈上升的趨勢(shì)[15]。膀胱癌的高發(fā)病率與環(huán)境和生產(chǎn)、生活習(xí)慣等息息相關(guān)，如何降低膀胱癌的發(fā)病率與復(fù)發(fā)率，已成為目前研究的熱點(diǎn)。本研究采用BBN灌胃建立膀胱癌大鼠模型，結(jié)果顯示模型組和不同劑量姜黃素組大鼠的膀胱組織均出現(xiàn)不同程度的癌變現(xiàn)象，表明建模成功。與模型組相比，60 mg/kg姜黃素組大鼠膀胱組織的細(xì)胞層次變少，120 mg/kg姜黃素組大鼠膀胱組織中部分細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，并且細(xì)胞表現(xiàn)不典型增生，表明姜黃素能夠抑制膀胱細(xì)胞的癌變過(guò)程，大劑量姜黃素能夠更為有效地減緩膀胱組織惡化的進(jìn)程。此外，本研究結(jié)果顯示，120 mg/kg姜黃素組大鼠中非浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌的比例高于模型組，而浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌的比例低于模型組(P<0.05)，進(jìn)一步表明較高濃度的姜黃素對(duì)浸潤(rùn)性膀胱癌的發(fā)生與發(fā)展具有抑制作用。

相關(guān)研究表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)與膀胱癌的發(fā)展有關(guān)[16-18]。Gecit等[17]研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者的血清T-AOC水平較健康者明顯降低，而血清一氧化氮及丙二醛水平較健康者明顯升高。呂夷松等[18]研究發(fā)現(xiàn)，與浸潤(rùn)性膀胱癌患者相比，非浸潤(rùn)性膀胱癌患者血清T-AOC和SOD水平均明顯升高，丙二醛水平明顯降低。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清T-AOC及SOD水平均較對(duì)照組大鼠降低，而一氧化氮和丙二醛水平較對(duì)照組大鼠上升(P<0.05)，與上述研究結(jié)果相似。而經(jīng)姜黃素灌胃干預(yù)后，60 mg/kg姜黃素組、120 mg/kg姜黃素組大鼠血清一氧化氮、丙二醛水平均低于模型組，血清SOD和T-AOC水平均高于模型組(均P<0.05)，表明姜黃素對(duì)膀胱癌發(fā)展的抑制作用可能與其抑制機(jī)體自由基產(chǎn)生、阻止機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化物的堆積以及激發(fā)抗氧化酶的活性有關(guān)。此外，本研究中120 mg/kg姜黃素組大鼠血清一氧化氮、丙二醛水平均低于60 mg/kg姜黃素組，血清SOD、T-AOC水平均高于60 mg/kg姜黃素組，說(shuō)明較高濃度的姜黃素更能有效地抑制膀胱癌大鼠機(jī)體自由基的產(chǎn)生，具有更好的抗氧化效果。

膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中會(huì)伴有不同程度的炎癥反應(yīng)。有學(xué)者采用顯微鏡對(duì)膀胱癌及癌旁組織的病理現(xiàn)象進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)由膀胱癌旁組織開(kāi)始就已經(jīng)出現(xiàn)炎性細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)[19]。還有研究表明，炎癥基因(TP53、IL-6等)的多態(tài)性與膀胱癌之間存在相關(guān)性，表明膀胱癌的發(fā)生與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切[20]。李慶等[21]研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者腫瘤組織中TGF-β1的表達(dá)水平與腫瘤臨床分期、病理組織分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況存在明顯的相關(guān)性。CRP作為促炎因子刺激肝臟時(shí)可產(chǎn)生急性時(shí)相蛋白，當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染、創(chuàng)傷或者腫瘤時(shí)其水平上升尤其明顯，Grimm等[22]發(fā)現(xiàn)，CRP水平越高，膀胱癌患者的預(yù)后越差，術(shù)后總生存時(shí)間越短。此外，IL-1β也是細(xì)胞內(nèi)重要的促炎因子[23]。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌模型大鼠血清IL-1β、CRP、TGF-β1水平均高于對(duì)照組大鼠，而60 mg/kg姜黃素組、120 mg/kg姜黃素組大鼠血清IL-1β、CRP及TGF-β1水平均低于模型組(均P<0.05)，這提示膀胱癌大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)水平升高，而姜黃素可降低膀胱癌大鼠血清IL-1β、CRP及TGF-β1水平，姜黃素抑制膀胱癌模型大鼠的腫瘤發(fā)展可能與其對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制相關(guān)；同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，120 mg/kg姜黃素組大鼠血清IL-1β、CRP及TGF-β1水平均低于60 mg/kg姜黃素組(均P<0.05)，說(shuō)明較高濃度姜黃素對(duì)膀胱癌大鼠炎癥反應(yīng)的抑制效果更佳。

綜上所述，姜黃素能夠抑制膀胱癌大鼠的組織病理學(xué)進(jìn)展，可能與其抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。然而，姜黃素對(duì)膀胱癌的治療效果及作用機(jī)制，還需要結(jié)合臨床試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。