孫冬紅，洪玉曉，陳洪鐸，高興華

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，沈陽 110001）

山藥可用于治療心血管疾?。?］、糖尿病［2］，同時具有降血壓［3］、抑制乳腺癌、胃癌細(xì)胞生長［4-5］、減輕抗生素相關(guān)性腹瀉［6］、提高記憶力［7］和免疫調(diào)節(jié)活性［8-10］等功能。山藥中的主要成分有淀粉、多糖、蛋白質(zhì)、皂苷、尿囊素、多巴胺和黃酮類化合物等［11-12］。山藥黏液的主要成分為糖蛋白生物大分子［13］。

山藥汁液接觸到皮膚，人會感覺到強(qiáng)烈的瘙癢。瘙癢是一種引發(fā)搔抓的不適感［14］。組胺及其受體是近幾十年研究最透徹的神經(jīng)介質(zhì)和受體，在多種瘙癢性皮膚病中起關(guān)鍵作用，組胺導(dǎo)致的瘙癢往往同時伴隨風(fēng)團(tuán)、紅斑和潮紅［15］。許多瘙癢的發(fā)生往往不伴隨風(fēng)團(tuán)的出現(xiàn)，且這些瘙癢抗組胺治療無效，是由非組胺依賴途徑引起的［16］。目前，山藥引起人體皮膚瘙癢的原因和機(jī)制尚未明確。

在20世紀(jì)50年代，SHELLEY等［17］研究表明，來自豆科攀緣植物黑藜豆夾毛刺中的一種蛋白酶mucunain可以引起人體瘙癢，這種瘙癢合并燒灼感，且不伴隨風(fēng)團(tuán)的出現(xiàn)［18］。研究［19-20］表明多種植物的蛋白酶，包括菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶和木瓜蛋白酶等，可引發(fā)瘙癢，并且瘙癢模式與山藥引發(fā)的瘙癢一致。本研究以新鮮山藥為原料，采用陰離子交換層析分離純化、皮膚瘙癢評價、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和生物信息學(xué)分析等方法篩選出潛在具有致癢作用的蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮山藥（河南山藥種植基地）；土豆（遼寧大潤發(fā)超市）；考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒（上海碧云天公司）；Q-HPR（武漢匯研公司）；AKTA primer（美國GE公司）；電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；凝膠成像系統(tǒng)（北京六一公司）；Orbitrap Fusion質(zhì)譜（美國Thermo公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 山藥蛋白的分離純化：

1.2.1.1 樣品預(yù)處理 山藥洗凈切片，-20 ℃冷凍24 h，取500 g室溫解凍，加入1 L純化水勻漿20 min，得到固液混合物，離心（11 500 r/min，4 ℃，25 min）取上清，測定上清pH為6.35，電導(dǎo)率為3.0 mS/cm，此即樣品溶液1；將其用3×103超濾膜濃縮至200 mL，以NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0，依次按照0.8 μm、0.45 μm進(jìn)行膜過濾得到樣品溶液2。

1.2.1.2 純化過程 用20 mmol/L Tris，pH 8.0溶液（溶液A）清洗Q-HPR預(yù)裝柱，將樣品溶液2上樣，收集完流穿液后，用溶液A平衡預(yù)裝柱，用20 mmol/L Tris，1.0 mmol/L NaCl，pH 8.0溶液（溶液B）進(jìn)行線性洗脫5個柱體積，收集不同的洗脫峰。

1.2.1.3 SDS-PAGE電泳 將樣品溶液2及各組洗脫產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色檢測純化分離條帶。

1.2.2 瘙癢評價：分別將樣品溶液1、樣品溶液2及各分離產(chǎn)物以1 mg/mL用純化水溶解。新鮮土豆與純化水以1 mg ∶1 mL勻漿，離心（3 000 r/min，25 min）取上清為陰性對照。將各組進(jìn)行人體皮膚瘙癢評價：用浸有上述樣品的濾紙片分別貼于健康受試者（共19例）前臂30 min，兩濾紙間隔5 cm以上，用數(shù)字評分分級法量表進(jìn)行評分。本研究獲得中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批。

1.2.3 蛋白質(zhì)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定：

1.2.3.1 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析 對山藥樣品進(jìn)行蛋白提取和胰酶酶解，使用液相色譜流動相溶解肽段，超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。肽段經(jīng)超高效液相系統(tǒng)分離后注入NSI離子源中進(jìn)行電離，Orbitrap Fusion質(zhì)譜分析。

1.2.3.2 質(zhì)譜結(jié)果數(shù)據(jù)庫檢索 使用Maxquant（https：//www.maxquant.org）對二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索。

雙流機(jī)場車站為某城際客運(yùn)專線中間站，車站總長943 m，有效站臺長450 m，標(biāo)準(zhǔn)段寬55.2 m，有效站臺中心里程處基坑深20.2 m。有效站臺與T2航站樓斜拱樁基承臺邊緣凈距為15 m左右。雙流機(jī)場站與T2航站樓平面位置如圖1所示。

1.2.4 生物信息學(xué)分析：

1.2.4.1 基因本體論（gene ontology，GO）分析 GO對蛋白質(zhì)組學(xué)層面的注釋來源于UniProt-GOA數(shù)據(jù)庫（http：//www.ebi.ac.uk/GOA/）［21］。使用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對蛋白進(jìn)行富集分析。蛋白結(jié)構(gòu)域注釋使用基于蛋白序列算法的軟件InterProScan以及相應(yīng)的InterPro結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）［22］對鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域注釋及富集分析。

1.2.4.2 蛋白-蛋白互作分析 使用STRING（http：//string-db.org）［23］進(jìn)行分析，設(shè)置信度閾值＞0.4，得到鑒定蛋白之間的互作關(guān)系。使用在線韋恩分析工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）對分離后各組分蛋白進(jìn)行差異分析。

1.2.5 蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)Ρ龋涸赑fam數(shù)據(jù)庫中（https：//pfam.xfam.org/search）查詢，并與注釋到的蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行對比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 21和Graphpad Prism 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及繪圖，對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)檢驗，對于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，使用非參數(shù)檢驗（符號秩和檢驗）進(jìn)行差異分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 山藥蛋白質(zhì)分離純化

采用Q-HPR陰離子交換柱，得到4個較明顯的色譜峰，分別命名為洗脫峰1～4（E1～4）。山藥樣品溶液2的分離純化圖譜見圖1。

圖1 山藥蛋白分離純化圖譜Fig.1 Plot showing isolation and purification of yam proteins

2.2 電泳蛋白分離

對樣品溶液2、分離組分1、分離組分2、分離組分3及分離組分4進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，其中，樣品溶液2、分離組分1和分離組分2中蛋白主要分布于25×103～35×103，分離組分3蛋白主要分布在75×103，分離組分4蛋白主要分布于30×103～35×103。見圖2。

圖2 蛋白SDS-PAGE電泳分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the isolated yam proteins

2.3 瘙癢評價結(jié)果

經(jīng)正態(tài)性檢驗，陰性對照組、樣品溶液2和分離組分（2、3和4）瘙癢評分?jǐn)?shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，采用配對樣本比較的Wilcoxon符號秩檢驗。瘙癢評分：土豆水提液均值0.21（陰性對照組）、樣品溶液1均值4.58（P＜ 0.05）、樣品溶液2均值3.89（P＜ 0.05）和分離組分1均值3.21（P＜ 0.05）；分離組分2均值0.37（P＞0.05）、分離組分3均值0.37（P＞ 0.05）、分離組分4均值0.26（P＞ 0.05）。見圖3。

圖3 瘙癢評分統(tǒng)計圖Fig.3 Statistical chart showing pruritus score

2.4 山藥總蛋白定性組學(xué)分析結(jié)果

2.4.1 山藥蛋白質(zhì)鑒定：通過質(zhì)譜分析，得到29 695張二級譜圖，經(jīng)蛋白理論數(shù)據(jù)搜庫后，得到可利用有效譜圖10 869張。通過譜圖解析，共鑒定到7 121條肽段，其中特異性肽段6 191，鑒定出1 529個蛋白質(zhì)。

2.4.2 山藥蛋白注釋：從GO、蛋白結(jié)構(gòu)域及蛋白描述等方面進(jìn)行了詳細(xì)的注釋。發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶2（cysteine proteinase 2，CCP2）、B樣組織蛋白酶2（cathepsin B-like protease 2，CATHB2），和Oryzain α鏈（oryzain alpha chain，Os04g0650000）屬于木瓜蛋白酶家族，蛋白功能結(jié)構(gòu)域為半胱氨酸蛋白酶。

2.4.3 山藥蛋白GO功能分析及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域富集分析：為了明確這1 529個蛋白主要涉及的功能，將鑒定到蛋白進(jìn)行了GO富集分析。GO富集分析顯示生物學(xué)過程（biological processes，BP）主要富集在檸檬酸鹽代謝、二磷酸核苷磷酸化和嘌呤核苷酸生物合成過程等；細(xì)胞組分（cellular component，CC）主要富集在多聚核糖體胞漿小核糖體亞單位、細(xì)胞連接和呼吸鏈復(fù)合體等；分子功能（molecular function，MF）主要富集在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶激活、銅離子結(jié)合和氧化還原酶激活等（圖4A～4C）。蛋白結(jié)構(gòu)域（protein domain，PD）富集到了磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、Ⅲ類轉(zhuǎn)氨酶和木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶等（圖4D）。

圖4 山藥蛋白GO功能富集和蛋白結(jié)構(gòu)域富集結(jié)果Fig.4 GO function enrichment and protein domain enrichment of yam proteins

2.4.4 蛋白-蛋白互作分析（protein-protein interaction，PPI）：為研究蛋白間的相互作用，使用STRING構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)CCP2、CATHB2和Os04g0650000處于網(wǎng)絡(luò)的相對核心位置（圖5）。

圖5 山藥蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Protein-protein interaction network of yam proteins

2.5 分離純化后各組分蛋白質(zhì)譜鑒定及致癢組分的成分分析

2.5.1 質(zhì)譜鑒定：具有致癢活性的蛋白組分通過質(zhì)譜分析，共鑒定到990條肽段，其中特異性肽段為872，鑒定到235個蛋白質(zhì)。另外3個非致癢組分：組分2鑒定到257個蛋白，組分3鑒定到328個蛋白，組分4鑒定到240個蛋白。見表1。為了鑒別致癢活性組分中的差異蛋白，利用在線韋恩分析工具對4個組分進(jìn)行分析，識別出致癢組分中含有91個非重疊蛋白，其中包含CCP2（圖6）。

圖6 4個組分韋恩圖結(jié)果Fig.6 Venn diagram showing the results of the four components

表1 各組份質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計表Tab.1 Statistical table showing MS results of each component

2.5.2 模塊化分析：為進(jìn)一步研究具有致癢活性組分蛋白的相互作用關(guān)系，通過STRING構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行模塊化分析，發(fā)現(xiàn)CCP2是連接2個獨(dú)立網(wǎng)絡(luò)的核心分子。見圖7。

圖7 致癢活性組分的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Protein-protein interaction network of the itch-inducing active component

2.5.3 CCP2結(jié)構(gòu)域匹配：使用Pfam數(shù)據(jù)庫對CCP2結(jié)構(gòu)域進(jìn)行匹配，在Pfam數(shù)據(jù)庫中輸入CCP2的氨基酸序列。結(jié)果顯示，該蛋白注釋到“木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶”，CCP2全長198個氨基酸，1-195氨基酸與“木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶”模型（模型全長218個氨基酸）的23-218序列相匹配。

3 討論

通過對山藥蛋白組學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)1 529個山藥蛋白中存在木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶（CCP2、CATHB2和Os04g0650000）。蛋白結(jié)構(gòu)域富集到木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶。對山藥蛋白進(jìn)行分離純化及瘙癢評價，發(fā)現(xiàn)分離后組分1具有致癢活性，質(zhì)譜定性分析鑒定到該組分含有235個蛋白，通過STRING構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)和模塊化分析，發(fā)現(xiàn)CCP2處于網(wǎng)絡(luò)的核心位置且是連接2個獨(dú)立網(wǎng)絡(luò)的核心分子。在Pfam數(shù)據(jù)庫中，該蛋白注釋為“木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶”。以上結(jié)果提示山藥蛋白中存在半胱氨酸蛋白酶。在分離純化后的活性組分中，核心分子CCP2的一級氨基酸序列與木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶具有高度同源性。

CCP2在玉米中可以促進(jìn)玉米種子的發(fā)芽和成熟過程［24］。研究［25］表明，植物在自然衰老或耐受脅迫下會導(dǎo)致CCP2mRNA升高，而在極端脅迫條件下CCP2mRNA的含量減少，導(dǎo)致蛋白酶活性降低，從而減少蛋白的循環(huán)利用并減少代謝產(chǎn)物向植物其余部分的輸出。因此，CCP2在植物耐受性上可能起著重要作用。

CCP2作為一種半胱氨酸蛋白酶，其在瘙癢方面的研究未見相關(guān)報道。目前已有的研究［26-27］指出，植物中的一些蛋白酶可引發(fā)皮膚瘙癢，主要有菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、木瓜蛋白酶及從黑藜豆毛刺中提取的Mucunain，其均屬于半胱酸蛋白酶類。研究［19，28-29］表明，半胱氨酸蛋白酶引發(fā)的瘙癢是通過G蛋白偶聯(lián)受體家族的蛋白酶激活受體（protease activated receptor，PAR）激活引起。該家族由4個成員組成，PAR1～PAR4，它們被蛋白酶水解激活，并向下游傳遞信號，引起外周機(jī)械反應(yīng)C纖維瘙癢通路的激活。

山藥致癢模式為快速出現(xiàn)的瘙癢同時伴有燒灼感，這種瘙癢在皮膚首次接觸新鮮山藥汁數(shù)十秒至數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)，并且瘙癢時沒有風(fēng)團(tuán)。山藥引起的瘙癢模式和上述蛋白酶引起的瘙癢模式極為相似?；谝延械奈墨I(xiàn)報道和山藥分離后的活性評價及成分分析，初步推測山藥中CCP2為山藥致癢活性成分。山藥引起瘙癢的機(jī)制可能是山藥中的蛋白酶通過PAR的激活引起的非組胺依賴性瘙癢［18，30］。因此，山藥蛋白致癢成分，特別是CCP2的進(jìn)一步研究有助于建立非組胺依賴的瘙癢模型，為探討?zhàn)W機(jī)制提供有利工具。