安雯，潘四維，段石杰，劉鵬飛，徐惠綿

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科，沈陽 110001）

胃癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分別位居第五位和第三位［1］。早期胃癌患者5年生存率可達90%以上，但由于胃癌起病隱匿、癥狀不典型，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已處于進展期［2］。了解胃癌的異質(zhì)性，對精準(zhǔn)評估預(yù)后及個性化臨床診療至關(guān)重要。腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）包括腫瘤細胞、基質(zhì)細胞、免疫細胞以及細胞外基質(zhì)等成分?；|(zhì)細胞能夠促進和維持腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［3］，不同免疫細胞的浸潤水平也與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)［4］。因此，評估胃癌組織中基質(zhì)細胞含量與免疫細胞浸潤程度，分析影響基質(zhì)和免疫浸潤的差異基因（differentially expressed genes，DEGs），對于研究TME在胃癌發(fā)生和發(fā)展中潛在分子機制、預(yù)測預(yù)后具有重要意義。

本研究聯(lián)合7個高通量基因表達（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫芯片的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，通過使用表達數(shù)據(jù)估計腫瘤中的基質(zhì)細胞含量和免疫細胞浸潤程度（estimation of stromal and immune cells in malignant tumor tissues using expression data，ESTIMATE）算法估計胃癌中基質(zhì)細胞含量和免疫細胞浸潤程度［5］并計算基質(zhì)評分（stromal score，SS）和免疫評分（immune score，IS），分析評分與胃癌預(yù)后及臨床病理的相關(guān)性，篩選和驗證預(yù)后相關(guān)DEGs，探索胃癌治療新靶點。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源和SS、IS評估

使用GEO數(shù)據(jù)庫GSE15459、GSE34942、GSE35809、GSE54129、GSE57303、GSE62254、GSE64951共7個胃癌芯片，校正消除組間差異，構(gòu)建870例胃癌聯(lián)合分析數(shù)據(jù)集。利用ESTIMATE算法計算SS及IS［5］，對基質(zhì)細胞和免疫細胞相關(guān)基因的表達數(shù)據(jù)進行基因富集分析。由于芯片臨床信息記錄標(biāo)準(zhǔn)存在差異，選取樣本量最大的GSE62254臨床信息進行SS、IS與預(yù)后及臨床病理的相關(guān)性分析。

1.2 SS、IS相關(guān)關(guān)鍵DEGs篩選和功能分析

以|log2FC|＞1、P＜ 0.05為過濾條件，SS、IS中位數(shù)為界，篩選DEGs并取交集。對共同DEGs進行基因本體論（gene ontology，GO）功能富集分析以及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析?；贕SE62254芯片臨床信息，通過單因素、多因素Cox回歸分析確定與總體生存期（overall survival，OS）相關(guān)且具有獨立預(yù)后價值的DEGs，并對其中新型胃癌預(yù)后分子HLADRA進行免疫組化驗證。

1.3 免疫組化

收集2009年3月至2012年6月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科行胃癌根治術(shù)的原發(fā)性胃癌患者標(biāo)本105例，進行HLA-DRA免疫組化染色，作為獨立驗證數(shù)據(jù)集。105例患者中，男81例，女24例；平均年齡（60.1±11.2）歲；隨訪時間0～89個月，中位隨訪時間34（14～66）個月?；颊咝g(shù)前未接受任何抗腫瘤治療。本研究獲得中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

組織切片經(jīng)過二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3%過氧化氫孵育20 min，檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）加熱2 min抗原修復(fù)，10%山羊血清孵育30 min。使用HLA-DRA抗體（1 ∶500，多克隆兔抗，美國Proteintech公司）4 ℃孵育過夜。次日生物素標(biāo)記IgG聚合物室溫20 min，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶室溫30 min，鏡下DAB染色1 min，蘇木素染色2 min，鹽酸乙醇返藍，漂洗，脫水封片。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用R 3.5.1軟件和SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。臨床相關(guān)性分析采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析，生存分析采用Kaplan-Meier法并進行l(wèi)og-rank檢驗，采用Cox風(fēng)險回歸模型預(yù)測獨立預(yù)后因素。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SS、IS評估及預(yù)后、臨床病理相關(guān)性分析

通過ESTIMATE算法計算胃癌聯(lián)合分析數(shù)據(jù)集中樣本的SS、IS，分別以SS、IS中位數(shù)為界，將GSE62254芯片中300例胃癌組織樣本分為高分組和低分組。生存分析顯示，高SS患者比低SS患者預(yù)后差（P=0.015，圖1A），IS與預(yù)后無顯著相關(guān)性（P=0.899，圖1B）。

臨床病理相關(guān)性分析（圖1C～1J）中，SS和IS與腫瘤TNM分期、T分期、M分期、Lauren分型、EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染顯著相關(guān)（P＜ 0.05），SS與以腹膜種植為第一復(fù)發(fā)位點、Borrmann分型顯著相關(guān)（P＜ 0.05），而IS并不相關(guān)。此外，二者與N分期均無相關(guān)性（P＞ 0.05）。以上結(jié)果說明，免疫浸潤程度和基質(zhì)細胞含量一定程度上影響著胃癌侵襲、遷移等方面的病程發(fā)展。

圖1 SS和IS的Kaplan-Meier生存分析和臨床相關(guān)性分析Fig.1 Kaplan-Meier survival analysis and correlation analysis of clinical features of the stromal and immune scores

2.2 篩選SS、IS關(guān)鍵DEGs及功能分析、多因素Cox回歸分析

SS、IS相關(guān)DEGs分別為448個、204個，共同DEGs 59個。GO分析（圖2A）顯示，共同DEGs參與細胞對γ干擾素的反應(yīng)、單核細胞遷移等免疫相關(guān)功能。KEGG（圖2B）顯示，共同DEGs在核因子κB信號通路、趨化因子信號通路等顯著富集。

圖2 DEGs的GO功能富集分析和KEGG通路分析Fig.2 GO functional enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of DEGs

對共同DEGs進行單因素分析（表1），結(jié)果表明，ARHGEF6、C3、CCL19、CCL2、GIMAP7、HLA-DRA、RASSF2與胃癌患者預(yù)后顯著相關(guān)（P＜ 0.05），多因素Cox回歸分析顯示，C3和HLA-DRA是獨立預(yù)后因素（P=0.005，P＜ 0.001）。由于HLA-DRA與胃癌預(yù)后的相關(guān)研究尚少，本研究選擇HLA-DRA作為主要研究對象。

表1 DEGs單因素和多因素Cox回歸分析Tab.1 Univariate and multivariate Cox proportional hazard analyses of DEGs

2.3 免疫組化分析

105例胃癌患者的免疫組化分析結(jié)果（圖3）顯示，HLA-DRA高表達的胃癌患者OS顯著延長（P=0.008），HLA-DRA低表達與復(fù)發(fā)（P=0.008）顯著相關(guān)（表2）。單因素和多因素Cox回歸分析（表3）提示，HLA-DRA（HR=0.562，95%CI：0.341～0.922，P=0.023）是胃癌獨立預(yù)后預(yù)測因素。

表2 HLA-DRA的臨床特征相關(guān)性分析Tab.2 Relationship between the expression level of HLA-DRA and clinical characteristics

表3 HLA-DRA單因素和多因素Cox回歸分析Tab.3 Univariate and multivariate Cox proportional hazards analyses of HLA-DRA

圖3 HLA-DRA高表達的胃癌患者OS顯著延長Fig.3 OS of gastric cancer patients with high expression of HLA-DRA is significantly prolonged

3 討論

TME由細胞成分和非細胞成分共同構(gòu)成，其中非腫瘤細胞主要包括基質(zhì)細胞以及各種免疫細胞細胞等。他們在腫瘤組織中被重塑，從而支持腫瘤的生物學(xué)行為［6］，如癌癥相關(guān)的成纖維細胞是TME中主要的基質(zhì)細胞，它可以促進腫瘤細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使腫瘤細胞更具侵襲性［7］。腫瘤相關(guān)巨噬細胞可以通過分泌大量細胞因子和生長因子來支持腫瘤的生長、血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移［8］。本研究結(jié)果也表明，胃癌患者基質(zhì)細胞含量增加與免疫細胞的浸潤會促進腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，與TNM分期、T分期、M分期呈正相關(guān)。此外，進一步的生存分析也顯示，高SS患者預(yù)后更差。但值得注意的是，IS與患者預(yù)后并不相關(guān)，考慮可能是由不同腫瘤階段免疫細胞浸潤類型的差異導(dǎo)致的。TME中不同的免疫細胞亞群在腫瘤免疫中發(fā)揮截然不同的作用，如 CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細胞通過多種機制破壞免疫監(jiān)視，抑制抗腫瘤免疫［9］，而CD8+T細胞是發(fā)揮抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細胞，高水平的CD8+T細胞浸潤往往腫瘤預(yù)后較好［10］。因此，不區(qū)分腫瘤階段、不區(qū)分免疫細胞亞群的研究都可能影響IS的生存分析結(jié)果。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)SS和IS相關(guān)的C3和HLA-DRA是胃癌的獨立預(yù)后因素。其中，HLA-DR是一種主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅱ類抗原呈遞分子，主要在抗原呈遞細胞中表達，向CD4+T細胞呈遞抗原［11］。在腫瘤免疫中，CD8+T細胞主要識別MHCⅠ類分子呈遞的腫瘤抗原，但CD4+T細胞是CD8+T細胞的活化、記憶T細胞產(chǎn)生的關(guān)鍵。研究［12-13］發(fā)現(xiàn)，在B淋巴細胞瘤、骨肉瘤中HLA-DRA與惡性腫瘤的預(yù)后呈負相關(guān)；也有研究［14］報道，HLA-DRA是乳腺原位癌進展為浸潤性導(dǎo)管癌的危險因素，其高水平與乳腺癌復(fù)發(fā)有關(guān)。而在一項膀胱癌研究［15］中，在非肌層浸潤性和肌層浸潤性膀胱癌中HLA-DRA高表達對患者預(yù)后的影響截然相反。關(guān)于HLA-DRA與胃癌預(yù)后的關(guān)系幾乎沒有研究報道，僅有研究［16］發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1與胃癌發(fā)生的風(fēng)險顯著相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，HLA-DRA高表達的胃癌患者具有顯著的生存優(yōu)勢，低表達患者存在更差的生物學(xué)行為。

綜上所述，HLA-DRA是胃癌患者的潛在預(yù)后因子，其高表達與胃癌患者生存期延長顯著相關(guān)。但胃癌的腫瘤免疫是一個非常復(fù)雜的系統(tǒng)，HLA-DRA在胃癌中的分子機制還有待進一步研究。