臧青民， 何玉妃， 章燁雯 ， 呂其壯， 盧成淑

（玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院，廣西玉林 537000）

中草藥飼料添加劑是將中獸醫(yī)理論結(jié)合于畜牧養(yǎng)殖，起到防治疾病、增強生產(chǎn)性能以及提高飼料品質(zhì)作用的一類添加劑 （張新連，2019； 張亮，2017），具有天然、綠色的特點，兼具藥物和營養(yǎng)的雙重性（孫曉磊，2021；宿國強等，2021）。 目前，中草藥飼料添加劑多為粗制品，即原料藥粉碎、攪拌后直接添加在飼料中，這種方法投用量較大，不利于生產(chǎn)和運輸（張志強等，2019；車清明，2012）。因此采用提純、 精制等手段獲得中草藥中的有效成分， 加強提取工藝的研發(fā)， 成為近年的研究熱點（夏詩琪等，2020；梁方方等，2019）。

復(fù)方柴胡飼料添加劑由柴胡等中草藥組成。柴胡是傘形科植物柴胡（Bupleurum chinese DC.）的干燥根 （中國藥典，2020）， 其含有多種活性成分，如皂苷、黃酮類、生物堿、木脂素、揮發(fā)油、多糖類、氨基酸等（辛國等，2018）。 柴胡皂苷為五環(huán)三萜類齊墩果烷型衍生物，具有良好的抗炎、抗病毒、抗細菌內(nèi)毒素等作用 （吳紅偉等，2020； 張耀峰，2020）。 其中，主要生物活性物質(zhì)柴胡皂苷 a（SSa）、柴胡皂苷d （SSd） 是柴胡含量測定的指標性成分（尹鑫等，2018）。綜上，本研究以 SSa、SSd 的轉(zhuǎn)移率為指標，采用正交設(shè)計優(yōu)化復(fù)方柴胡飼料添加劑的提取工藝，通過精制手段獲得有效成分，以期為復(fù)方柴胡飼料添加劑在畜牧業(yè)的應(yīng)用提供依據(jù)，也為中草藥飼料添加劑的開發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀（LC-16AT，日本島津國際貿(mào)易有限公司），電子天平（JA11002，上海皓莊儀器有限公司），高速粉碎機（FW135，天津市泰斯特儀器有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2，常州國華電器有限公司）， 循環(huán)水式多用真空泵（SHZ-Ⅲ，鄭州生化儀器有限公司）。

柴胡 （亳州市遠光中草藥飲片廠， 批號：1904074）， 經(jīng)鑒定為傘形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC.）的干燥根。

SSa、SSd 購于上海華藍化學(xué)科技有限公司；氨水、甲醇、無水乙醇等試劑均為分析純；乙腈為色譜純。

1.2 SSa、SSd 高效液相色譜含量測定方法學(xué)考察

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相見表 1；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

表1 高效液相色譜的流動相

1.2.2 供試品溶液的制備 稱取復(fù)方柴胡最粗粉50 g，加10 倍量80%乙醇，回流提取1 h，得濾液，定容至1000 mL，搖勻，過濾。

1.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取SSa、SSd 對照品適量， 加甲醇溶解配制成每毫升含SSa、SSd各 0.2 mg 的溶液，搖勻，過濾。

1.2.4 空白樣品溶液的制備 取80%乙醇溶液，搖勻，過濾。

1.2.5 專屬性考察 按1.2.1 中條件下進樣測定，結(jié)果表明，空白樣品無干擾，SSa、SSd 色譜峰與其他色譜峰均達到基線分離（圖1）。

圖1 HPLC 專屬性考察

1.2.6 線性關(guān)系考察 精密稱取SSa、SSd 對照品各6 mg 置于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋，搖勻，得儲備液。分別精密量取一定量的儲備液并配制成一系列濃度的溶液，按1.2.1 中條件進樣測定，以峰面積為縱坐標，分別以SSa、SSd 質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.7 精密度考察 分別取SSa、SSd 對照品溶液，按1.2.1 中條件連續(xù)進樣5 次，記錄峰面積，計算 RSD。 SSa 的 RSD 為 0.34%，SSd 的 RSD 為0.35%，表明精密度良好。

1.2.8 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液，按1.2.1 中條件分別在 0、3、6、9、12、24 h 進樣，記錄峰面積，計算 RSD。 SSa 的 RSD 為 1.57%，SSd 的 RSD 為2.64%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.9 重復(fù)性考察 按1.2.2 中條件制備供試品溶液5 份，按1.2.1 中條件進樣測定，記錄峰面積，計算 RSD。 SSa 的 RSD 為 1.30%，SSd 的 RSD 為1.86%，表明制備方法重復(fù)性良好。

1.2.10 加樣回收率考察 精密量取已知濃度的供試品溶液25 mL， 另精密加入接近SSa、SSd 濃度的對照品溶液25 mL，平行操作6 份，按1.2.1中條件下進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率和 RSD。 SSa 的平均回收率為 98.74%，RSD 為1.80%，SSd 的平均回收率為 102.45%，RSD 為2.93%，表明制備方法準確性良好。

1.3 單因素試驗 以SSa、SSd 轉(zhuǎn)移率為指標，分別設(shè)置乙醇濃度（60%、70%、80%、90%）、回流時間（30、60、90、120 min）和溶劑倍量（5、10、15、20）為考察因素和水平， 篩選出影響復(fù)方柴胡飼料添加劑提取的較優(yōu)水平。

為將所有評價指標綜合為一個能反映總體效果的值，本研究采用加權(quán)評分法處理數(shù)據(jù)，引入綜合評價指標， 規(guī)定SSa、SSd 的權(quán)重系數(shù)分別為0.5、0.5。 各指標的試驗數(shù)據(jù)則按以下方程進行處理：di=Yi/Ai， 其中 di 為各評價指標的評分值，Yi為各評價指標的實測值，Ai 為各評價指標中相應(yīng)最大值（鄧翀等，2011）。

1.4 正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上以SSa、SSd 轉(zhuǎn)移率為考察指標，采用 L9（34）正交表安排試驗，因素水平見表2。

表2 正交試驗因素水平

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析 采用SPSS 20.0 軟件對正交試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制 分別以SSa、SSd 質(zhì)量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，得線性回歸方程y=3689.6x－1907.1，y=4208.20x+4663.10，結(jié)果見圖2 和 圖 3。 SSa、SSd 的 線 性 范 圍 分 別 為 9.97 ～398.72 μg/mL（R2=0.9999）、10.04 ～ 401.60 μg/mL（R2=0.9999），線性關(guān)系良好。

圖2 SSa 標準曲線

圖3 SSd 標準曲線

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對復(fù)方柴胡提取的影響 本單因素試驗固定回流時間60 min、溶劑倍量15，研究系列乙醇濃度對復(fù)方柴胡提取的影響， 結(jié)果見圖4。隨著乙醇濃度的增加，柴胡皂苷的轉(zhuǎn)移率增大，其中80%乙醇與90%乙醇提取得到的轉(zhuǎn)移率均較高且相近。

圖4 乙醇濃度對柴胡皂苷轉(zhuǎn)移率的影響

2.2.2 回流時間對復(fù)方柴胡提取的影響 本單因素試驗固定乙醇濃度80%、溶劑倍量15，研究不同回流時間對復(fù)方柴胡提取的影響，結(jié)果見圖5。在一定范圍內(nèi)，隨著回流時間的增加，柴胡皂苷的轉(zhuǎn)移率增大，但當回流時間超過60 min 時，由于SSa、SSd 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定， 長時間加熱容易降解為次生苷，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移率降低。

圖5 回流時間對柴胡皂苷轉(zhuǎn)移率的影響

2.2.3 溶劑倍量對復(fù)方柴胡提取的影響 本單因素試驗固定乙醇濃度80%、回流時間60 min，研究不同溶劑倍量對復(fù)方柴胡提取的影響，結(jié)果見圖6。 隨著溶劑倍量的增加，柴胡皂苷的轉(zhuǎn)移率增大，當溶劑倍量超過15 時，轉(zhuǎn)移率升高不明顯。

圖6 溶劑倍量對柴胡皂苷轉(zhuǎn)移率的影響

2.3 正交試驗結(jié)果

2.3.1 正交試驗設(shè)計 正交試驗設(shè)計及直觀分析結(jié)果見表3。 由極差分析可知，回流時間對柴胡皂苷提取影響較大， 各因素主次順序為回流時間>乙醇濃度>溶劑倍量，較優(yōu)提取工藝為A3B2C3。

表3 復(fù)方柴胡正交試驗設(shè)計及直觀分析

2.3.2 方差分析 由表4 可知，回流時間（B）對皂苷轉(zhuǎn)移率影響顯著（P < 0.05），乙醇濃度（A）、溶劑倍量 （C） 對皂苷轉(zhuǎn)移率影響不顯著（P >0.05）， 影響柴胡皂苷轉(zhuǎn)移率的主次因素為B >A>C，與直觀分析結(jié)果相同。 結(jié)合生產(chǎn)成本，確定復(fù)方柴胡的最佳提取工藝條件為乙醇濃度80%，回流時間60 min，溶劑倍量15 倍。

表4 正交試驗方差分析

2.3.3 提取條件的驗證 為驗證工藝的準確性和合理性，按上述最優(yōu)工藝進行提取，平行操作3 份，計算 SSa、SSd 轉(zhuǎn)移率。 結(jié)果顯示最優(yōu)工藝下，SSa、SSd 的轉(zhuǎn)移率分別為 68.72%、20.05%，RSD 分別為2.64%、4.08%， 說明該提取工藝穩(wěn)定、可行。

3 結(jié)論

由單因素試驗和正交試驗結(jié)果可知， 各因素中回流時間對柴胡皂苷轉(zhuǎn)移率影響最大， 其次是乙醇濃度。 結(jié)合生產(chǎn)成本， 確定復(fù)方柴胡飼料添加劑的提取工藝為乙醇濃度80%， 提取時間60 min， 溶劑倍量 15 倍，SSa、SSd 的轉(zhuǎn)移率分別為68.72%、20.05%，RSD 分別為 2.64%、4.08%，表明該提取工藝條件穩(wěn)定、可行。