余海洋 梅峻豪 秦立昊 劉純 周熠 趙紅斌 李辰凱 賈中芝

慢性創(chuàng)面的修復(fù)一直是臨床亟待解決的難題，需要一種經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、有量產(chǎn)前景的人工皮膚[1]。近年來，3D打印技術(shù)逐漸應(yīng)用于人工皮膚支架的制備，而使用該技術(shù)將海藻酸鈉(Sodium alginate，SA)和明膠制成不同規(guī)格的皮膚支架的研究較少[2]。本研究采用RegenHU 3D生物打印機(jī)，制備不同規(guī)格的SA-明膠皮膚支架，并對(duì)其生物相容性及對(duì)大鼠皮膚成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)，試圖為慢性創(chuàng)面的修復(fù)提供一種可降解的3D打印皮膚。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

大鼠皮膚成纖維細(xì)胞(中科院細(xì)胞庫)。SA和明膠(麥克林生化科技有限公司)；無血清細(xì)胞凍存液(蘇州新賽美生物科技有限公司)；Live/Dead試劑盒(Invitrogen，美國(guó))；羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒(南京建成生物研究所)；大鼠白介素6酶聯(lián)免疫分析試劑盒(武漢酶免生物科技有限公司)。

1.2 SA-明膠皮膚支架的制備

按照SA的質(zhì)量百分比制成不同規(guī)格的SA-明膠皮膚支架。分別將質(zhì)量百分比為3%、4%、5%的SA粉末與去離子水加入裝有明膠顆粒的燒杯中，40 ℃水浴電磁攪拌2 h，充分混勻后置于37 ℃?zhèn)溆?。使?D打印機(jī)配套BioCAD軟件設(shè)計(jì)模型：15 mm×15 mm，厚度4層，間距0.8 mm。將SA和明膠原料放入熱熔針筒中，針筒加熱至40 ℃，調(diào)節(jié)溫度為37 ℃恒溫，氣壓0.25 MPa，距離2 mm，打印速度6 mm/s，針頭25 G，分別打印3%、4%、5%的SA-明膠皮膚支架。

1.3 SA-明膠皮膚支架的表征

利用掃描電鏡觀察皮膚支架表面形貌，比較不同規(guī)格的SA-明膠皮膚支架的表面形貌特征。

1.4 大鼠皮膚成纖維(RS1s)細(xì)胞的培養(yǎng)

將復(fù)蘇后的大鼠RS1s細(xì)胞移入25 mL培養(yǎng)瓶中，加入10 mL含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM basic完全培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2 d換液，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至85%時(shí)，胰酶消化并傳代。

1.5 生物相容性檢測(cè)

將皮膚支架置于12孔板內(nèi)，孔內(nèi)加入2 mL DMEM basic完全培養(yǎng)基，將大鼠RS1s細(xì)胞以1×105/孔的密度接種于12孔板內(nèi)，與皮膚支架共培養(yǎng)2 d后，使用Live/Dead染色，倒置熒光顯微鏡下觀察材料表面細(xì)胞黏附情況；與材料共培養(yǎng)5 d后，掃描電鏡觀察材料表面細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)情況。材料置于12孔板內(nèi)，將大鼠RS1s細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種于12孔板內(nèi)，分別與材料共培養(yǎng)1、3和5 d，加入CCK-8，檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.6 膠原蛋白表達(dá)量的檢測(cè)

材料置于12孔板內(nèi)，將大鼠RS1s細(xì)胞以4×104個(gè)/孔的密度接種于12孔板內(nèi)，分別與材料共培養(yǎng)1、2和3 d后，使用羥脯氨酸試劑盒檢測(cè)膠原蛋白的含量(膠原蛋白的主要成分為羥脯氨酸)，細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)過消化液充分消化后，使用酶標(biāo)儀在550 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)光密度(OD)值。羥脯氨酸含量=(測(cè)定管OD-空白管OD)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD-測(cè)定管OD)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)。

1.7 IL-6表達(dá)水平檢測(cè)

材料置于12孔板內(nèi)，將大鼠RS1s細(xì)胞以4×104個(gè)/孔的密度接種于12孔板內(nèi)，分別與材料共培養(yǎng)1、2和3 d后，使用大鼠白介素6酶聯(lián)免疫分析試劑盒測(cè)定IL-6表達(dá)水平，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出OD值對(duì)應(yīng)濃度后乘以稀釋倍數(shù)，最終得到IL-6表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 皮膚支架的宏觀與微觀結(jié)構(gòu)

肉眼觀：3組皮膚支架呈網(wǎng)格狀，孔徑均勻(圖1)。掃描電鏡：3組皮膚支架均為多孔網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)，孔隙均勻；3%SA組皮膚支架的表面較另2組明顯粗糙(圖2)。

圖1 不同規(guī)格SA-明膠皮膚支架的大體觀Fig.1 General view of different SA-Gelatin skin scaffolds

圖2 掃描電鏡下不同規(guī)格SA-明膠皮膚支架的表面形貌(A1-C1：80×；A2-C2：500×)Fig. 2 Surface morphologies of SA-Gelatin skin scaffolds with different specifications under scanning electron microscopy (A1-C1: 80×; A2-C2: 500×)

2.2 皮膚支架的細(xì)胞黏附與增殖

Live/Dead染色：細(xì)胞與皮膚支架共培養(yǎng)2 d后，在各組皮膚支架表面均能較好地黏附與生長(zhǎng)，其中5%SA組細(xì)胞數(shù)量少于另2組；掃描電鏡：細(xì)胞與皮膚支架共培養(yǎng)5 d時(shí)，細(xì)胞能在材料表面黏附與生長(zhǎng)，其中4%SA組細(xì)胞數(shù)量多于另2組(圖3)。

所有的電器元器件都具有適用的期限，如果在超過期限的情況下使用，必然會(huì)對(duì)工程機(jī)械電氣設(shè)備的性能產(chǎn)生不利的影響，這同樣也是不可避免的情況。特別是電機(jī)與變壓器使用超過了期限，加之工作環(huán)境條件不理想，導(dǎo)致其絕緣性能受到不利的影響。交流接觸器、繼電器以及電位器在長(zhǎng)期使用以后也會(huì)出現(xiàn)觸頭電接觸不理想的情況。

A1-C1：掃描電鏡觀察(5 000×)；A2-C2：Live/Dead染色(40×)；A3-C3：Live/Dead染色(100×)；綠色：活細(xì)胞；紅色：死細(xì)胞。A1-C1: Scanning electron microscope observation (5 000×); A2-C2: Live/Dead staining (40×); A3-C3: Live/Dead staining (100×); Green: living cells; Red: Dead cells.圖3 大鼠皮膚成纖維細(xì)胞在3組皮膚支架表面的生長(zhǎng)情況Fig.3 Growth of rat epithelial fibroblasts on the surface of skin scaffolds in three groups

CCK-8檢測(cè)：如圖4所示，在細(xì)胞與皮膚支架共培養(yǎng)1、3和5 d時(shí)，4%SA組細(xì)胞增殖率顯著高于另2組，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第1天與第5天時(shí)3%SA組與5%SA組細(xì)胞增殖率無明顯差異(P>0.05)。

圖4 各組細(xì)胞與皮膚支架共培養(yǎng)1、3和5 d的增殖情況Fig. 4 Proliferation of cells in each group after co-cultured with skin scaffolds for 1, 3 and 5 days

2.3 皮膚支架對(duì)細(xì)胞膠原蛋白分泌的影響

圖5顯示，細(xì)胞與皮膚支架共培養(yǎng)1、2和3 d時(shí)，4%SA組膠原蛋白分泌量顯著高于3%SA與5%SA組(P<0.05)，第1、2和3 d時(shí)3%SA組與5%SA組膠原蛋白分泌量無明顯差異(P>0.05)。

圖5 各組細(xì)胞與皮膚支架共培養(yǎng)1、2和3 d時(shí)的羥脯氨酸分泌水平Fig.5 Hydroxyproline secretion levels of cells in each group after co-cultured with skin scaffolds for 1, 2 and 3 days

2.4 皮膚支架對(duì)細(xì)胞IL-6分泌的影響

如圖6所示，細(xì)胞與皮膚支架共培養(yǎng)1、2和3 d時(shí)，4%SA組IL-6表達(dá)水平顯著低于3%SA與5%SA組(P<0.05)，第1、2和3 d 時(shí)3%SA組與5%SA組IL-6表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)。

圖6 各組細(xì)胞與皮膚支架共培養(yǎng)1、2和3 d時(shí)的IL-6表達(dá)水平Fig. 6 IL-6 expression levels of cells in each group after co-cultured with skin scaffolds for 1, 2 and 3 days

3 討論

隨著我國(guó)人口老齡化日益嚴(yán)重，慢性創(chuàng)面患者逐年增多，如糖尿病足潰瘍患者等，慢性創(chuàng)面的救治已經(jīng)成為臨床上棘手的難題[3-5]。人工皮膚在慢性創(chuàng)面的救治過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[6-8]。隨著3D打印技術(shù)的快速發(fā)展，3D打印人工皮膚支架逐漸走進(jìn)人們的視野，雖然目前已有3D打印皮膚支架的相關(guān)[9-10]，但對(duì)3D打印皮膚支架的研究仍處于起始階段，仍需展開相關(guān)的基礎(chǔ)與臨床研究。

3D打印皮膚支架的關(guān)鍵是生物墨水的選擇，即材料的選擇。目前最常用于人工皮膚支架的生物材料包括海藻酸鹽、明膠、膠原蛋白、殼聚糖等，以上材料各有優(yōu)缺點(diǎn)[2]。本研究采用了SA和明膠，SA是一種天然多糖，具有較高的穩(wěn)定性、溶解性、黏性和安全性等[11]。明膠是一種大分子的親水膠體，具有較高的生物相容性和生物可降解性，在體內(nèi)降解后不產(chǎn)生副產(chǎn)物、無免疫原性，并具有與膠原相同的組分和生物性質(zhì)[12]。本研究初步發(fā)現(xiàn)：SA和明膠能夠制成理想的生物墨水，并具有較好的3D打印性能，打印出的SA-明膠皮膚支架在宏觀和微觀上能夠滿足臨床使用需求。

在外觀形貌方面，本研究按照SA的質(zhì)量百分比制成了不同規(guī)格的SA-明膠皮膚支架，雖然3組皮膚支架在宏觀上差別不大，均呈網(wǎng)格狀，并且孔徑均勻，但在微觀結(jié)構(gòu)上，3組皮膚支架存在較大的差異，尤其是3%SA組的皮膚支架，表面較另2組明顯粗糙，這與SA的質(zhì)量百分比不同直接相關(guān)。

不同的微觀形貌，會(huì)對(duì)細(xì)胞的黏附與生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的影響。因此，在生物相容性方面，雖然細(xì)胞在3組皮膚支架表面均能較好地黏附與生長(zhǎng)，但4%SA組較另2組更適宜細(xì)胞的生長(zhǎng)。另外，我們還發(fā)現(xiàn)3組皮膚支架均對(duì)大鼠皮膚成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為有一定的影響，4%SA組羥脯氨酸分泌量顯著高于另2組，這與前面證實(shí)的4%SA組更適宜細(xì)胞生長(zhǎng)的結(jié)果一致。羥脯氨酸是構(gòu)成結(jié)締組織中膠原纖維的主要成分[13]，可以促進(jìn)創(chuàng)面的修復(fù)。因此，4%SA組皮膚支架具有較高的生物相容性，且有利于創(chuàng)面的修復(fù)。

IL-6是活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子，作為促炎細(xì)胞因子在體內(nèi)炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用[14]。本研究初步發(fā)現(xiàn)4%SA組皮膚支架的IL-6表達(dá)水平顯著低于另外兩組，說明4%SA組皮膚支架在一定程度上抑制了IL-6的表達(dá)，從而抑制支架局部的炎癥反應(yīng)程度，最終加快創(chuàng)面的修復(fù)。

本研究不足之處：①僅進(jìn)行了體外試驗(yàn)研究，未進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證，下一步我們將開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證4%SA組皮膚支架對(duì)慢性創(chuàng)面愈合的作用；②掃描電鏡下觀察皮膚支架上的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，這可能與皮膚支架的脫水處理導(dǎo)致細(xì)胞脫落有關(guān)；③該皮膚支架的降解時(shí)間曲線仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)利用3D擠壓式打印成功構(gòu)建了不同規(guī)格的SA-明膠皮膚支架，并初步證明了4%SA-明膠的皮膚支架具有較好的生物相容性和膠原蛋白分泌效應(yīng)，并有效抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，有望為創(chuàng)面修復(fù)提供一種可降解的3D打印皮膚支架。