吳倩，陳媛媛，張弘弢，高穎，徐闖

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319）

黃曲霉毒素（Aflatoxin）是由黃曲霉及寄生曲霉產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，現(xiàn)已鑒定出的黃曲霉毒素有20多種[1-2]。黃曲霉毒素又稱倉儲型毒素，長期儲存在高溫且潮濕環(huán)境下的飼料被黃曲霉菌污染的幾率更高，據(jù)聯(lián)合國糧食和農(nóng)業(yè)組織的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球大約1/4的農(nóng)作物及農(nóng)產(chǎn)品會受到霉菌毒素的污染[3-4]。其中黃曲霉毒素B1（AFB1）分布范圍最廣，毒性最強，尤其對禽類更敏感[5]。

AFB1能夠引起畜禽的急性慢性中毒，破壞肝臟、腎臟、脾臟等解毒器官，抑制生長發(fā)育，降低免疫力，誘導肝臟和代謝性疾病的發(fā)生，甚至導致毒素殘留于肉類產(chǎn)品中。長期食用被黃曲霉毒素污染的食物可導致癌癥等疾病的發(fā)生[6]。幼齡動物比成年動物對AFB1的易感性更強，造成的危害也更嚴重[7]。肉雞采食受AFB1污染的飼料會導致生產(chǎn)性能和脂肪消化率降低，肝臟機能受損，血清中谷丙、谷草轉(zhuǎn)氨酶顯著升高，降低總蛋白、白蛋白、球蛋白的濃度[8-10]。

AFB1的性質(zhì)極其穩(wěn)定，一經(jīng)污染就很難去除，是十分棘手的食品安全問題[11]。去除AFB1的方法有很多，過去使用的傳統(tǒng)物理或化學方法存在著許多缺點，例如影響食品的營養(yǎng)構(gòu)成、適口性等，因此需要尋找去除效果顯著并且安全無毒的方法[12]。乳酸菌在自然界中分布極為廣泛，在動物體內(nèi)，乳酸菌作為腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群，其調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，提高機體免疫力且無副作用的特點已被越來越多的研究者所關注[13-15]。近些年以來，利用乳酸菌及其代謝產(chǎn)物去除黃曲霉毒素成為較為安全有效的新方法，也是去除毒素的新研究方向之一。

試驗通過乳酸菌分離培養(yǎng)技術和一系列鑒定方法，從健康肉雛雞盲腸分離乳酸菌，為了驗證其對AFB1中毒雛雞的保護效果，選取1日齡肉雛雞，每天給與0.3 mg·kg-1AFB1飼糧的同時給與1×108CFU·mL-1的乳酸菌，探討乳酸菌對其生長性能、血液生化指標的影響，為禽類腸道乳酸菌制劑的研究及霉菌中毒保護劑的研發(fā)探究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用1日齡健康白羽肉雛雞，購自哈爾濱益農(nóng)禽業(yè)有限公司。

1.2 實驗試劑

AFB1（Sigma公司），MRS固體培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒、細菌微量生化鑒定管（青島海博生物技術有限公司），16S rDNA乳酸菌通用引物（吉林庫美生物科技有限公司），Taq Master－Mix（康為世紀），DNA marker 2000（索萊寶），瓊脂糖（上海生工生物工程有限公司），溴化乙錠（上海生工生物工程有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的分離純化培養(yǎng)

將雛雞頸靜脈放血處死，解剖后分離腸道，在超凈臺中用滅菌生理鹽水沖洗后取盲腸內(nèi)容物，置于10 mL滅菌生理鹽水中混勻，靜置10 min后，取上清液。將上清液做10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7稀釋度，分別從各稀釋度吸取100 μL菌液均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基中，做好標記后，常氧條件下在37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h。挑取乳白色、圓形、凸起、表面光滑濕潤、邊緣整齊且具有芳香氣味的單菌落三角劃線接種于MRS固體培養(yǎng)基進行細菌純培養(yǎng)，每一個菌株純化2次。

1.3.2 純化菌株的鑒定

（1）革蘭氏染色

經(jīng)革蘭氏染色后，菌體呈陽性，短粗桿狀，單個散在或形成鏈狀，無運動性，無芽孢和鞭毛的符合乳酸桿菌特征。

（2）生化鑒定

將單菌落分別接種于七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖和乳糖的生化管中，接種完后用封口膜封口，置于36℃水浴鍋中培養(yǎng)24 h，觀察生化管變化，參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[16]和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[17]。

（3）16s rDNA序列分析

PCR擴增體系如表1所示，以液體培養(yǎng)后的菌液作為模版，乳酸菌16S rDNA通用引物：上游：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；下游：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’。

表1 PCR擴增體系Table 1 PCR amplification system

PCR擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，循環(huán)30次；72℃延伸10 min，4℃保溫。

取5 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳并觀察結(jié)果，將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測得基因序列在NCBI上進行BLAST初步確定屬種，與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進行同源性比對，最后利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.3.3 動物實驗

（1）實驗分組

選取1日齡健康白羽肉雛雞42只，隨機分為7組，每組6只，即對照組；AFB1組；AFB1+M1組；AFB1+M2組；AFB1+M3組；AFB1+M4組；AFB1+M5組和AFB1+M8組。對照組飼喂基礎日糧，AFB1組每天飼喂含0.3 mg·kg-1AFB1飼料的基礎飼糧。AFB1+M1組；AFB1+M2組；AFB1+M3組；AFB1+M4組；AFB1+M5組和AFB1+M8組飼喂含0.3 mg·kg-1AFB1飼料基礎飼糧的同時在飲水中添加1×108CFU·mL-1的乳酸菌M1、M2、M4、M5和M8。試驗期為28 d，在黑龍江八一農(nóng)墾大學動物飼養(yǎng)房適應性飼養(yǎng)一周后開始實驗。

（2）樣品采集及處理

試驗期間觀察雛雞健康狀況；屠宰前一日晚上斷料，供足飲水，次日早晨稱體重；心臟采血，2 500 r·min-1離心10 min，分離血清，-80℃冰箱保存；屠宰后摘取心臟、肝臟、脾臟并在生理鹽水中洗去血液，用濾紙吸干水分后稱重。

（3）測定指標及方法

采用全自動生化分析儀（齊齊哈爾中醫(yī)院）檢測血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶含量。

臟器指數(shù)計算公式：器官相對重量=器官鮮重/活體重×100

（4）數(shù)據(jù)處理

用SPSS17.0軟件包處理數(shù)據(jù)，以單因素方差分析各組間的顯著性，P<0.05具有統(tǒng)計學意義。試驗所得結(jié)果以“平均數(shù)（標準差”形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)觀察結(jié)果

取培養(yǎng)后的平板觀察，有5株疑似為乳酸菌，分別命名為M1、M2、M4、M5、M8，其菌落邊緣整齊、表面光滑濕潤、圓形有凸起呈乳白色且具有芳香氣味（圖1）。

圖1 菌落形態(tài)觀察結(jié)果Fig.1 Colony morphology observation

2.2 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

菌落形態(tài)觀察疑似為乳酸菌的菌落經(jīng)革蘭氏染色后，在油鏡下觀察可見革蘭氏陽性菌體呈短粗桿狀，單個散在或形成鏈狀，無芽孢和鞭毛，結(jié)果顯示M1、M2、M4、M5、M8符合乳酸桿菌特征（圖2）。

圖2 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Fig.2 Gram staining results

2.3 生化實驗結(jié)果

生化實驗結(jié)果如表2所示：M1、M2、M4、M5、M8這5株菌株的生化特性與乳酸菌一致，與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[16]和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[17]對照后初步確定為乳酸菌。

表2 生化結(jié)果Table 2 Biochemical result

2.4 PCR鑒定結(jié)果

1%瓊脂糖凝膠電泳顯示（圖3），擴增產(chǎn)物在約1 500 bp處看到清晰條帶，與預期目的片段大致相符，可鑒定實驗分離菌株為滿足測序要求。

圖3 菌株的16Sr DNA PCR擴增結(jié)果Fig.3 16Sr DNA PCR amplification results of strains

2.5 序列及進化樹分析

2.5.1 序列分析

將PCR擴增產(chǎn)物測得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行BLAST同源性比對，結(jié)果顯示，菌株M1、M4、M5、M8與敏捷乳桿菌（Lactobacillus agilisM58803.2）同源性較高，同源性分別為93.7%、87.3%、90.7%、94.8%，菌株M2與腸乳桿（Lactobacillus intestinalisLC096206.1）同源性較高，為92.1%。

2.5.2 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹

選取乳酸菌屬的15個代表菌株的16S rDNA基因序列，利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖4）。結(jié)果顯示，菌株M1、M4、M5、M8與敏捷乳桿菌（Lactobacillus agilisM58803.2）親緣關系較近，且處于同一支，結(jié)合以上鑒定結(jié)果可確定M1、M4、M5、M8與敏捷乳桿菌屬于同一分支；菌株M2與腸乳桿菌（Lactobacillus intestinalisLC096206.1）處于同一分支。

圖4 5株分離菌株的16Sr DNA序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.4 Development evolutionary tree of 16Sr DNA sequence of 5 strains

2.6 乳酸菌對肉雛雞體重和臟器指數(shù)的影響

如表3，AFB1顯著降低了雛雞的體重（P<0.001），飲水中添加乳酸菌M2、M4和M8的雛雞體重與對照組相差不大（P>0.05），AFB1+M1組和AFB1+M5組雛雞的體重指數(shù)顯著低于對照組（P<0.001）。AFB1組雛雞的心臟、肝臟和脾臟指數(shù)顯著高于對照組（P<0.01；P<0.01；P<0.001）；飲水中添加乳酸菌M2、M4和M8的雛雞心臟、肝臟、脾臟指數(shù)與對照組相差不大（P>0.05），AFB1+M1組和AFB1+M5組雛雞心臟指數(shù)顯著高于對照組（P<0.05；P<0.01），AFB1+M1組和AFB1+M5組雛雞肝臟指數(shù)顯著高于對照組（P<0.001；P<0.01），AFB1+乳酸菌M1組和AFB1+M5組雛雞脾臟指數(shù)顯著高于對照組（P<0.01；P<0.01），說明乳酸菌M1和M5對雛雞的AFB1毒性反應不能起到很好的保護作用，而乳酸菌M2、M4和M8則對雛雞AFB1的毒性反應起到很好的保護作用。

表3 乳酸菌對肉雛雞體重和臟器指數(shù)的影響Table 3 Effect of Lactic Acid Bacteria on body weight and organ index of broilers

2.7 乳酸菌對肉雛雞血液生化水平的影響

如表4所示，與對照組相比，AFB1組、AFB1+M1組和AFB1+M5組雛雞的谷草、谷丙轉(zhuǎn)氨酶顯著升高（P<0.001），AFB1+M2組、AFB1+M4組和AFB1+M8組雛雞的谷丙、谷草轉(zhuǎn)氨酶與對照組相差不大（P>0.05）。如表5所示AFB1組雛雞總蛋白、白蛋白和球蛋白顯著低于對照組（P<0.001），AFB1+M2組、AFB1+M4組和AFB1+M8組雛雞總蛋白、白蛋白和球蛋白與對照組相差不大（P>0.05）。AFB1+M1組和AFB1+M5組雛雞的總蛋白顯著低于對照組（P<0.01；P<0.001），AFB1+M1組和AFB1+M5組雛雞的白蛋白和球蛋白顯著低于對照組（P<0.05；P<0.001）。說明乳酸菌M2、乳酸菌M4和乳酸菌M8可以改善AFB1導致的血清蛋白含量的降低，而乳酸菌M1和乳酸菌M5效果則不明顯。

表4 乳酸菌對肉雛雞血清酶的影響Table 4 Effect of Lactic Acid Bacteria on serum enzymes of broiler chickens/U·mL-1

表5 乳酸菌對肉雛雞血清蛋白的影響Table 5 Effect of Lactic Acid Bacteria on serum protein of broilers/g·L-1

3 討論

不同日齡的雛雞腸道內(nèi)菌群組成是不一樣的，有研究報道，雛雞從3日齡開始其消化道內(nèi)乳酸菌逐漸增加，到16日齡時小腸前段的乳酸菌達到數(shù)量平衡，25日齡時乳酸菌在盲腸形成菌群優(yōu)勢[18]。試驗成功從30日齡肉雛雞盲腸內(nèi)分離到乳酸菌，也說明了30日齡雛雞盲腸內(nèi)已存在乳酸菌這一優(yōu)勢菌群。此外，張振瑞等[19]對健康家兔腸道益生菌的研究結(jié)果表明，盲腸內(nèi)容物中需氧及厭氧菌數(shù)量均高于回腸，表明盲腸可以作為分離乳酸菌的最佳場所。實驗使用革蘭氏染色、生化實驗等常規(guī)細菌鑒定方法初步判定分離的5株菌株為乳酸菌，通過PCR鑒定及遺傳系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析等一系列分子生物學鑒定方法[8]，確定M1、M4、M5、M8與敏捷乳桿菌（Lactobacillus agilisM58803.2）親緣關系較近，菌株M2腸乳桿菌（Lactobacillus intestinalisLC096206.1）處于同一分支。

AFB1會影響人和動物的內(nèi)臟器官，尤其是肝臟，當機體攝入過量的AFB1會引發(fā)急性中毒，出現(xiàn)急性肝炎，出血性壞死等病癥[20]，長期低劑量攝入AFB1還可能引發(fā)肝癌的發(fā)生[21]。家禽對于AFB1的敏感性要高于哺乳動物，李瑞娟等人研究了AFB1對雛雞血液生理指標的影響，用含有不同濃度AFB1的飼料連續(xù)飼喂雛雞后發(fā)現(xiàn)，含2.8 mg·kg-1AFB1日糧會導致雛雞肝臟出現(xiàn)明顯損傷，且肝指數(shù)也隨之升高，血液生理指標則顯著降低[22]。試驗選用0.3 mg·kg-1AFB1日糧同樣對雛雞臟器指數(shù)和血液生化指標造成影響。

AFB1組雛雞體重顯著低于對照組，說明AFB1對雛雞的生長發(fā)育造成了很大的影響；心臟、肝臟和脾臟指數(shù)顯著高于對照組，說明AFB1導致臟器增生、肥大；血液中谷草、谷丙轉(zhuǎn)氨酶顯著高于對照組，說明肝細胞壞死嚴重，肝功能異常；白蛋白主要由肝臟合成，其顯著降低，說明肝臟發(fā)生了炎癥反應。免疫球蛋白降低說明AFB1對雛雞的免疫系統(tǒng)造成了很大的影響。有研究表明，一些益生菌具有降低黃曲霉毒素的活性的作用[23]。2×1010CFU·L-1的乳酸菌可以將AFB1的水平降低到0.1%~13%，可能是益生菌菌體的表面成分參與了AFB1的結(jié)合[24]。并且加強益生菌干預可減輕AFB1誘導的毒性[25]。所篩選的5株乳酸菌中，乳酸菌M2、M4和M8能夠顯著減少AFB1導致的體重下降；顯著降低心臟、肝臟和脾臟的臟器指數(shù)；降低血清中谷草、谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量，說明這3株乳酸菌對AFB1導致的雛雞中毒具有很好的保護作用。而AFB1+M1組和AFB1+M5組對AFB1中毒雛雞有輕微的保護作用，但作用效果不明顯。

4 結(jié)論

試驗成功從30日齡健康白羽肉雛雞盲腸內(nèi)分離出5株乳酸菌，其中菌株M1、M4、M5、M8與敏捷乳桿菌（Lactobacillus agilisM58803.2）處于同一分支；菌株M2與腸乳桿菌（Lactobacillus intestinalisLC096206.1）處于同一分支。乳酸菌可以通過吸附或降解機制去除AFB1，利用乳酸菌作為解毒劑不僅能減輕動物的毒性反應還有利于動物腸道菌群的平衡，促進動物生長發(fā)育。在動物試驗中菌株M2、M4和M8顯著降低了AFB1中毒肉雛雞心臟、肝臟、脾臟的臟器指數(shù)及血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白、谷草、谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量，對AFB1中毒肉雛雞具有很好的保護效果，但具體的保護作用機制卻不清楚。因此，在后續(xù)的試驗中將會對這3株乳酸菌做進一步的研究，明確乳酸菌對AFB1解毒的作用機制。