范荒原，詹宛瑩，候立恒，柴文戍

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 錦州 121000)

感染性疾病在臨床實(shí)踐中具有挑戰(zhàn)性和普遍性，是社區(qū)和醫(yī)院中最常見(jiàn)的疾病之一。革蘭氏陰性菌仍然為感染性疾病最多見(jiàn)病原體，包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌和非腸桿菌科細(xì)菌的銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等。感染性疾病分為簡(jiǎn)單和復(fù)雜性感染，不幸的是，許多復(fù)雜性感染與高復(fù)發(fā)率相關(guān)，對(duì)現(xiàn)有口服抗生素耐藥性增加，迫使許多臨床醫(yī)生求助于靜脈注射藥物，如碳青霉烯類抗菌藥物[1]。碳青霉烯類抗生素具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、腎毒性低等特點(diǎn)，已經(jīng)成為臨床治療中、重度細(xì)菌感染的主要藥物之一[2]。隨著臨床耐藥菌的不斷產(chǎn)生，合理經(jīng)驗(yàn)性應(yīng)用抗生素是阻斷其傳播的重要手段。為更好地了解我院常見(jiàn)分離菌對(duì)不同藥物的抗菌活性，盡可能減少耐藥菌產(chǎn)生機(jī)會(huì)，以期在治療感染性疾病臨床經(jīng)驗(yàn)性用藥當(dāng)中，提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥品

觀察藥品：比阿培南(安信)南京先聲東元制藥有限公司；對(duì)照藥品：美羅培南(美平)Sumitomo Dainippon Pharma Co.；亞胺培南(泰能)杭州默沙東制藥公司；厄他培南(怡萬(wàn)之)Laboratoires Merck Sharp&Dohme -Chibret；頭孢他啶(復(fù)達(dá)欣)GlaxoSmithKline Manufacturing S.p.A；頭孢吡肟(恒蘇)江蘇恒瑞醫(yī)藥公司；頭孢哌酮/舒巴坦(凡琳，1∶1)楊子江藥業(yè)公司；哌拉西林/他唑巴坦(邦達(dá)，8∶1)齊魯天和惠世制藥公司；環(huán)丙沙星(西普樂(lè))Bayer Schering Pharma AG；左氧氟沙星(左克)楊子江藥業(yè)公司；阿米卡星(米英杰)浙江莎普愛(ài)思藥業(yè)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株來(lái)源與鑒定

試驗(yàn)菌株均來(lái)自本院2019年9月至2020年9月住院患者的痰液(193例)、尿液(154例)、腹腔積液(94例)、血液(69例)、傷口膿液(44例)及其他(11例)標(biāo)本分離到的致病菌(相同患者相同部位只收集1次)，所有菌株均經(jīng)我院檢驗(yàn)科微生物室細(xì)菌檢定儀(西門(mén)子Microscan WalkAway-96Plus)鑒定。利用低溫冷凍保存法收藏細(xì)菌，每次試驗(yàn)前予菌株復(fù)活，分離純化良好后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 培養(yǎng)基

藥敏試驗(yàn)用MH肉湯培養(yǎng)基(上海廣銳生物科技有限公司)；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(北京百歐博偉生物科技有限公司)；血瓊脂平板培養(yǎng)基(上海哈靈生物科技有限公司)。

1.4 試驗(yàn)方法

參照Sarker等的試驗(yàn)方法[3]，挑取經(jīng)18～24 h培養(yǎng)，生長(zhǎng)完好的單個(gè)菌落進(jìn)行菌懸液配制，通過(guò)濁度儀調(diào)制成0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫?約1.5×108CFU/mL),再倍比稀釋終濃度為6.1×105CFU/L備用。所有試驗(yàn)藥品按藥品說(shuō)明書(shū)用生理鹽水配置成終質(zhì)量濃度7680 mg/L備用。在96孔無(wú)菌培養(yǎng)板第1橫的第1列加入290 μL MH肉湯培養(yǎng)基，其他至第2橫的第10列中加入150 μL MH肉湯培養(yǎng)基，第1橫的第1列再加入10 μL配置好的藥品，由左至右逐一進(jìn)行倍比稀釋，最終達(dá)到256～0.016 mg/L的試驗(yàn)藥品梯度，再最后每孔加入5 μL菌懸液。其中第2橫的5～7列為只含菌液、培養(yǎng)基，無(wú)藥物的陽(yáng)性對(duì)照孔，8～10列為只含培養(yǎng)基，無(wú)菌液無(wú)藥物的陰性對(duì)照孔。適當(dāng)混勻，35 ℃孵育18 h后應(yīng)用酶標(biāo)儀讀取各孔的吸光度值(A)，與陰性對(duì)照孔進(jìn)行比較，相同者即為該藥物對(duì)該株菌的最低抑菌濃度(MIC)，若藥物濃度為256 mg/L與陽(yáng)性對(duì)照孔的A值完全相同時(shí)，視為MIC大于256 mg/L。

1.5 試驗(yàn)結(jié)果判斷

按CLSI M100-S30(2020)[4]進(jìn)行抗菌藥物臨界濃度標(biāo)準(zhǔn)的判讀，計(jì)算出細(xì)菌的敏感率和耐藥率，按照Livermore DM等[5]報(bào)道，比阿培南對(duì)腸桿菌科細(xì)菌的折點(diǎn)選取與亞胺培南、美羅培南一致，即≤1 mg/L為敏感，≥ 4 mg/L為耐藥，對(duì)銅綠假單胞菌和和鮑曼不動(dòng)桿菌，也參考了亞胺培南和美羅培南對(duì)相應(yīng)菌屬/種的折點(diǎn),對(duì)亞胺培南、美羅培南其中一種耐藥的菌株，視為碳青霉烯類藥物耐藥菌株[6]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件計(jì)算MIC50、MIC90及MICrange，比阿培南與其他對(duì)照藥物敏感率比較采用χ2檢驗(yàn)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。質(zhì)控菌株校正藥敏試驗(yàn)準(zhǔn)確性。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)菌株和質(zhì)控菌株

實(shí)驗(yàn)菌株：通過(guò)細(xì)菌鑒定儀鑒定本次試驗(yàn)產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase，ESBL)大腸埃希菌123株，占大腸埃希菌56.9%(123/216)，大腸埃希菌總檢出率38.2%(216/565)為本次試驗(yàn)最多見(jiàn)菌株，與2019年CHINET三級(jí)醫(yī)院細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)中大腸埃希菌占革蘭氏陰性桿菌構(gòu)成比最大相同，但檢出率略低于報(bào)道[7]，本研究樣本量受限有關(guān)；碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯桿菌(carbapenem-resistant klebsiella pneumoniae，CRKP)占肺炎克雷伯桿菌19.3%(22/114)，占總菌株的3.9%(22/565)；非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌銅綠假單胞菌的檢出率14.1%(80/565)，鮑曼不動(dòng)桿菌9.6%(54/565)，其中碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌(carbapenem-resistant pseudomonas aeruginosa，CRPA)占銅綠假單胞菌的28.8%(23/80)，占總菌株數(shù)的4.0%(23/565)，碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(carbapenem-resistant acinetobacter baumannii，CRAB)占鮑曼不動(dòng)桿菌的68.5%(37/54)，占總菌株數(shù)的6.5%(37/565)；陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、奇異變形桿菌各占總菌株數(shù)的7.0%(40/565)、4.8%(27/565)、6.0%(34/565)。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853本院檢驗(yàn)科微生物室提供。

2.2 抗菌藥物對(duì)臨床常見(jiàn)分離革蘭氏陰性菌最低抑菌濃度測(cè)定及敏感性結(jié)果

比阿培南對(duì)產(chǎn)和不產(chǎn)ESBL大腸埃希菌、非碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌、非碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌及非碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌均表現(xiàn)出了良好的抗菌活性，與劉文靜等[8]、董婧等[9]報(bào)道相似，且MICrange最小(0.016～16 mg/L)，MIC50最小(0.016 mg/L)，MIC90與美羅培南相當(dāng)(0.06 mg/L)。關(guān)于不產(chǎn)ESBL大腸埃希菌，與中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)報(bào)告[10]相比，美羅培南MIC50和MIC90是報(bào)告的2倍，亞胺培南MIC50與報(bào)告相同(0.12 mg/L)，MIC90是報(bào)告的4倍，分析原因，本試驗(yàn)未再劃分大腸埃希菌是否碳青霉烯類耐藥。對(duì)于產(chǎn)ESBL大腸埃希菌碳青霉烯類抗菌藥物抗菌活性顯著高于其他對(duì)照藥物(P<0.05)(阿米卡星除外)，但其之間對(duì)比無(wú)差異性，其中比阿培南和美羅培南的MICrange和MIC50最小且相似分別為0.016～64 mg/L、0.03～64 mg/L和0.03 mg/L、0.03 mg/L，比阿培南的耐藥率僅次于美羅培南和亞胺培南。本實(shí)驗(yàn)中美羅培南、亞胺培南及阿米卡星對(duì)非碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的MIC50，是國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道[11]的1/2。對(duì)于CRKP，比阿培南敏感率顯著高于美羅培南、亞胺培南、厄他培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦(P<0.05)，與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道[12]相仿，耐藥率與環(huán)丙沙星相同，低于美羅培南、亞胺培南、厄他培南。本次試驗(yàn)對(duì)非碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌的抗菌活性比較中，比阿培南的敏感性最佳，其次阿米卡星、美羅培南，而CRPA中，比阿培南的敏感性顯著小于頭孢他啶、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、阿米卡星(P<0.05)，但敏感率高于美羅培南、亞胺培南，其耐藥率低于美羅培南、亞胺培南。對(duì)于非碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌比阿培南與亞胺培南敏感性最佳，其次美羅培南、阿米卡星，但比阿培南和美羅培南的MIC50(0.125 mg/L)最低，是亞胺培南(0.5 mg/L)的1/4、阿米卡星(1 mg/L)的1/8，比阿培南和亞胺培南的MIC90(8 mg/L)最低，是美羅培南(16 mg/L)和阿米卡星(16 mg/L)的1/2。值得一提的是在對(duì)CRAB的敏感性比較中，比阿培南和阿米卡星的敏感率最高，顯著高于美羅培南、亞胺培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢哌酮舒巴坦、哌拉西林他唑巴坦、環(huán)丙沙星及左氧氟沙星(P<0.05)，且比阿培南的耐藥率最低，均低于其他對(duì)照藥品(P<0.05)。部分腸桿菌科細(xì)菌(陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、奇異變形桿菌)比阿培南總的敏感率與美羅培南、亞胺培南及阿米卡星相近(P>0.05)，但顯著高于厄他培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢哌酮舒巴坦、哌拉西林他唑巴坦、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與戴瑋等[13]報(bào)道相仿，見(jiàn)表1～11。

表1 不同抗菌藥物對(duì)不產(chǎn)ESBL大腸埃希菌抗菌活性

表2 不同抗菌藥物對(duì)產(chǎn)ESBL大腸埃希菌抗菌活性

表3 不同抗菌藥物對(duì)非CR肺炎克雷伯菌抗菌活性

表4 不同抗菌藥物對(duì)CRKP抗菌活性

表5 不同抗菌藥物對(duì)非CR銅綠假單胞菌抗菌活性

表6 不同抗菌藥物對(duì)CRPA抗菌活性

表7 不同抗菌藥物對(duì)非CR鮑曼不動(dòng)桿菌抗菌活性

表8 不同抗菌藥物對(duì)CRAB抗菌活性

表9 不同抗菌藥物對(duì)陰溝腸桿菌抗菌活性

表10 不同抗菌藥物對(duì)產(chǎn)氣腸桿菌抗菌活性

表11 不同藥物對(duì)奇異變形桿菌抗菌活性

3 討 論

關(guān)于碳青霉烯類、頭孢菌素類、復(fù)合酶抑制劑類、喹諾酮類及氨基糖苷類等11種臨床常用抗菌藥物的抗菌活性比較研究報(bào)道較少，據(jù)2019年中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)[7]233-243了解到，革蘭氏陰性桿菌仍是臨床罹患感染性疾病的重要致病菌。本研究是一項(xiàng)評(píng)價(jià)臨床經(jīng)驗(yàn)用藥常用抗生素對(duì)醫(yī)院患者常見(jiàn)分離革蘭氏陰性桿菌及部分碳青霉烯類耐藥菌的體外抗菌試驗(yàn)研究。新型非典型β-內(nèi)酰胺碳青霉烯類抗菌藥物比阿培南，具有對(duì)腎脫氫肽酶、持續(xù)高產(chǎn)C類頭孢菌素酶以及β-內(nèi)酰胺酶甚至超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(EBSLs)較其他碳青霉烯類抗生素穩(wěn)定性更強(qiáng)的特點(diǎn)，免遭酶類降解使抗生素不易失活[1]439-444。比阿培南可與細(xì)菌細(xì)胞膜上的青霉素結(jié)合蛋白高度結(jié)合，從而抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的生物合成，破壞細(xì)菌正常結(jié)構(gòu)發(fā)揮殺菌作用。相比較其他碳青霉烯類抗生素比阿培南對(duì)革蘭氏陰性菌，特別是對(duì)銅綠假單胞菌的抗菌能力更強(qiáng)，這與本文相符，且腎毒性更小，這得益于比阿培南的2位C上修飾了三唑陽(yáng)離子，從而增加了細(xì)菌細(xì)胞膜的穿透性?，F(xiàn)如今比阿培南應(yīng)用廣泛，特別是在治療下呼吸道感染、復(fù)雜性尿路感染、復(fù)雜性腹腔感染和血液系統(tǒng)疾病所致粒細(xì)胞缺乏的中、重度感染病例上，均獲得了顯著療效[14-16]。

本試驗(yàn)抗菌活性比較中發(fā)現(xiàn)，碳青霉烯類抗菌藥物對(duì)臨床主要分離到的腸桿菌科細(xì)菌，具有顯著優(yōu)勢(shì)。其中比阿培南與美羅培南抗菌活性相當(dāng)，較亞胺培南、厄他培南優(yōu)勢(shì)更加明顯，與艾效曼等[12]541-546研究相似。試驗(yàn)藥物比阿培南，尤其對(duì)大腸埃希菌、非碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯桿菌、非碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌、非碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌及常見(jiàn)腸桿菌科細(xì)菌的敏感率均達(dá)到90%以上，耐藥率≤5%。對(duì)于CRKP、CRPA及CRAB，比阿培南總的抗菌活性顯著高于美羅培南、亞胺培南(P<0.05)。參閱文獻(xiàn)了解到，CRKP主要耐藥機(jī)制是產(chǎn)生碳青霉烯酶[17]，后者會(huì)水解碳青霉烯類藥物，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的碳青霉烯酶主要有KPC型、IMP型、NDM-1型及OXA-48型，其中產(chǎn)KPC型肺炎克雷伯菌是CRKP中最常見(jiàn)類型[18]，而產(chǎn)OXA-48型肺炎克雷伯菌是對(duì)青霉素等窄譜β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)研究表明，頭孢菌素類、半合成青霉素類抗生素對(duì)CRKP表現(xiàn)出極高耐藥性，而比阿培南對(duì)其耐藥性，僅次于最低的阿米卡星。金屬β內(nèi)酰胺酶是目前臨床導(dǎo)致銅綠假單胞菌耐碳青霉烯類藥物的重要機(jī)制[19]，MBL同樣是通過(guò)水解抗菌藥物，產(chǎn)生耐藥特性。結(jié)果顯示，比阿培南對(duì)CRPA的抗菌活性不及頭孢菌素類和氨基糖苷類抗生素，但在碳青霉烯類藥物中敏感性突出。鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性高，臨床治療難度大，目前仍是重癥醫(yī)學(xué)科、呼吸與危重癥科、血液科等抗感染治療的難題，CRAB的產(chǎn)生與抗生素暴露及碳青霉烯類藥物使用時(shí)間呈正相關(guān)[20]，本研究中臨床分離到的CRAB占耐碳青霉烯類藥物菌的45.1%，略低于其他醫(yī)院[13]321-327。試驗(yàn)藥物比阿培南對(duì)CRAB的耐藥性明顯低于美羅培南和亞胺培南，這與美羅培南及亞胺培南臨床應(yīng)用時(shí)間較長(zhǎng)可能相關(guān)，未來(lái)還需做深一步的研究證明。試驗(yàn)部分結(jié)果與參考文獻(xiàn)部分不相一致，其主要原因?yàn)楸驹囼?yàn)菌株均來(lái)自同一家醫(yī)院，且樣本量較少。

綜上所述，比阿培南具有對(duì)腸桿菌科細(xì)菌及碳青霉烯類耐藥菌抗菌活性強(qiáng)、耐藥率低等優(yōu)勢(shì)，可成為臨床常見(jiàn)感染性疾病經(jīng)驗(yàn)性用藥中，有價(jià)值的選擇。與此同時(shí)，抗生素的合理應(yīng)用、依藥敏結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥，仍是遏制碳青霉烯類耐藥菌傳播的重要手段。