魯燕，陳永權

(皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院麻醉科，安徽 蕪湖 241000)

慢性疼痛定義為“一種不愉快的感覺和情緒上的感受,伴有或潛在的組織損傷”，疼痛如果持續(xù)3～6個月以上則稱為慢性疼痛,慢性疼痛常伴有心理或精神改變甚至功能障礙，但其具體機制不明。研究發(fā)現[1]，神經病理性疼痛導致海馬突觸結構和功能受損是認知障礙的重要病理基礎。而血管內皮生長因子C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)在調控神經干細胞分化、軸突發(fā)育等方面發(fā)揮著重要功能。VEGF-C的主要分布在星形膠質細胞上，在神經損傷大鼠模型中其在大鼠海馬組織中常呈低表達[2]。

本研究通過大鼠在體實驗，構建慢性疼痛認知功能障礙模型，檢測慢性疼痛所致認知功能障礙時大鼠VEGF-C分泌情況，同時檢測GFAP、Nestin、NeuN的表達情況。體外干預星形膠質細胞中VEGF-C的分泌水平，檢測其對共培養(yǎng)神經干細胞的分化以及軸突發(fā)育的影響，同時檢測共培養(yǎng)體系GFAP、Nestin、NeuN的表達水平，旨在通過體外體內實驗深入闡述VEGF-C在介導慢性疼痛認知功能障礙發(fā)生發(fā)展過程中的作用，為慢性疼痛認知功能障礙的臨床診斷和治療應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

BCA試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，兔抗GFAP、兔抗Nestin、兔抗NeuN 一抗(均為美國LSBio)，通用型二抗試劑盒(上海博蘊生物科技有限公司)，離心機( JW3021HR，安徽嘉文儀器裝備有限公司)，酶標儀(美谷分子儀器有限公司)，倒置顯微鏡(德國徠卡公司)，電子顯微鏡(日本Hitachi公司)，SM2010R型切片機(德國徠卡公司)，FACSVantage SE分選型流式細胞儀(美國BD公司)，引物由上海桑貢合成生物工程技術服務有限公司(中國上海)制作及合成，重組載體和病毒包裝質粒購自愛康得生物科技有限公司(中國蘇州)。

1.2 實驗動物

60只8周齡雄性SD大鼠，體質量為180～220 g，購自上海實驗動物中心(SLAC)，所有實驗大鼠置于通風的動物室內，保持22 ℃，正常飲水，維持正常的晝夜節(jié)律。該實驗已獲得動物倫理審批，審批編號為20191287。

1.3 大鼠慢性疼痛認知功能障礙模型制造

60只大鼠隨機分為兩組(n=30)：對照組與實驗組。按照Decosterd等[3]的方法，實驗通過手術暴露大鼠的坐骨神經，同時結扎脛神經和腓總神經，對坐骨神經分別進行機械性疼痛刺激、針刺刺激、冷痛覺刺激及熱痛覺刺激，術后24 h內即可出現痛覺超敏反應。

1.4 Morris水迷宮測試認知功能

采用Morris水迷宮實驗測定大鼠的空間記憶和學習記憶能力，進而分析大鼠的認知功能。定向航行實驗測量大鼠獲取學習記憶的能力。根據目前國內主流的設計方法[4]，設計特制的水迷宮。大鼠完成定向航行訓練后，對實驗組大鼠進行相應處理干預。空間搜索實驗用于測量學會尋找平臺后，保持對平臺空間位置記憶的能力。選取大鼠在定位航行術后1、3、5 d的逃避潛伏期作為學習能力監(jiān)測指標，并在空間搜索中的術后第6天穿環(huán)次數作為空間記憶能力監(jiān)測指標。

1.5 ELISA法檢測血清VEGF-C濃度

處死大鼠前用非抗凝真空管取尾靜脈血2 mL。獲取血樣后，采用ELISA法檢測血清VEGF-C濃度。

1.6 蛋白印跡法檢測Nestin、GFAP、NeuN蛋白表達情況

處死大鼠并取大鼠腦組織，提取組織蛋白，用BCA試劑盒進行蛋白濃度定量。將蛋白質提取物在樣品中煮沸緩沖液10 min，在10%聚丙烯酰胺上分離凝膠，并轉移到 PVDF 膜。膜用5%牛血清白蛋白，并與稀釋后的Nestin(1∶1000)、GFAP(1∶10 000)、NeuN(1∶1500)一抗孵育。然后膜在 TBST 中洗滌并與相應的溫育二抗。GAPDH被用作內部參考。使用WB曝光儀檢測膜。評估圖像使用Image J 軟件。

1.7 大鼠原代星形膠質細胞及神經干細胞的分離和培養(yǎng)

取對照組大鼠,在無菌條件下斷頭取出腦組織，剪去腦干僅留大腦半球，充分剪碎腦組織,再移入50 mL含胰酶的PBS離心管中,用吸管反復吹打消化至肉眼觀察無明顯的腦組織團塊；加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化,再次反復吹打制成單細胞懸液,加定量完全培養(yǎng)液制成細胞懸液，并置于5% CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并在鏡下觀察細胞的生長和存活情況。通過免疫熒光染色法鑒定星形膠質細胞及神經干細胞。

1.8 慢病毒轉染干預VEGF-C分泌水平

本實驗選擇慢病毒過表達載體pLV-puro以及shRNA干擾載體pEco-Lenti-U6-shRNA-(Puro)，根據starbase數據庫中提供的VEGF-C的核酸序列，利用Primerpremier 5.0設計引物進行PCR得到VEGF-C的DNA序列，引物序列為左:5′-TCAAGGACAGAAGAGACTATAAAATTTGC-3′，右:5′-ACTCCAAACTCC-CCCCACAT-3′，雙酶切構建過表達VEGF-C的過表達載體，構建其shRNA的重組載體，用重組載體轉染細胞。根據是否轉染的重組載體，將細胞分為過表達組、敲減組和空載組。

1.9 細胞增殖成球實驗檢測神經干細胞分化

用細胞球形成效率(sphere formation efficiency，SFE)表示神經干細胞在合適的條件培養(yǎng)基中自我更新的能力。將共培養(yǎng)的細胞接種于6孔板培養(yǎng)，DMEM培養(yǎng)基，37 ℃孵育2 w后，用0.1%晶體紫的固定染色細胞，計算細胞團的個數。

1.10 鏡檢軸突發(fā)育

全腦組織或者體外培養(yǎng)細胞，用鹽水洗凈并固定用2.5%戊二醛溶液。海馬在倒置顯微鏡下切下組織。海馬 CA1區(qū)1 mm 3組織切片用 2.5%戊二醛溶液固定，洗滌用磷酸緩沖鹽水(PBS)，脫水，嵌入，切片并用檸檬酸鉛和乙酸染色。用電子顯微鏡觀察海馬 CA1 區(qū)突觸體周圍的超微結構，突觸體的數量由物理檢查員進行計數和分析。

1.11 流式細胞儀檢測神經干細胞周期

取培養(yǎng)細胞，用胰蛋白酶消化制備成細胞懸液，1000 r離心10 min，棄上清液。加入70%乙醇固定液重懸細胞，固定30 min。再次離心、洗滌后，用RNA酶消化細胞，用碘化丙錠作為染料，處理細胞20 min。在流式細胞儀488 nm激發(fā)波長下測定。觀察并記錄處于分裂期(含S期及G2/M期)的細胞百分數。

1.12 蛋白印跡法檢測Nestin、GFAP、NeuN蛋白表達情況

裂解并研磨細胞，提取細胞中蛋白，余處理同組織WB檢測。

1.13 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 兩組Morris水迷宮測試結果

Morris水迷宮實驗顯示，逃避潛伏期隨著訓練時間增加而縮短，但對照組和實驗組兩組間逃避潛伏期差異無統(tǒng)計學意義。對實驗組進行處理后，實驗組逃避潛伏期高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

*與對照組比較:*P<0.05

2.2 血清VEGF-C濃度比較

對照組血清VEGF-C值為(48.66±6.54)pg/mL，實驗組為(27.08±2.60) pg/mL，兩者組間差異有統(tǒng)計學意義(F=10.25，P=0.016，0.05)。

2.3 兩組腦組織GFAP、Nestin、NeuN蛋白表達情況

實驗組GFAP蛋白表達顯著高于對照組，而Nestin、NeuN表達量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、圖2。

圖2 對照組與實驗組GFAP、Nestin、NeuN的WB表達情況

表1 對照組與實驗組GFAP、Nestin、NeuN表達量

2.4 細胞增殖成球實驗及軸突發(fā)育計數結果

3組間SFE及及軸突發(fā)育計數兩兩比較，敲減組的SFE及軸突發(fā)育計數均低于空載組級過表達組，過表達組SFE及軸突發(fā)育計數稍高于空載組，過表達組處于分裂期細胞顯著多于其余兩組，差異有統(tǒng)計學意義、見表2。

表2 3組間SFE及軸突發(fā)育計數

2.5 3組細胞GFAP、Nestin、NeuN蛋白表達情況

3組間GFAP、Nestin、NeuN表達量兩兩比較，過表達組Nestin、NeuN表達量顯著高于空載組，GFAP低于空載組，敲減組Nestin、NeuN表達量顯著低于空載組，GFAP高于空載組，差異有統(tǒng)計學意義，見圖3、表3。

圖3 3組間GFAP、Nestin、NeuN的WB表達情況

表3 3組間GFAP、Nestin、NeuN表達量

3 討 論

一般疼痛持續(xù)3～6個月或更長時間被定義為慢性疼痛，慢性疼痛時，通常伴有持續(xù)性的有害刺激或傷害[5]，慢性疼痛常發(fā)生于創(chuàng)傷性神經、脊髓或腦損傷后，也可伴發(fā)于糖尿病、帶狀皰疹后遺神經病、多發(fā)性硬化癥、癌癥等疾病[6]。慢性疼痛常會對患者造成巨大影響，如免疫力下降、異常的應激反應、食欲減退、引發(fā)失眠、焦慮、抑郁等神經精神癥狀，嚴重時可致自殺等。同時，越來越多的臨床證據也表明，慢性疼痛可能會導致患者的認知功能受到損傷[7]。Moriarty[8]等認為，對于慢性疼痛患者，其認知會受到疼痛的負面影響，包括注意力、學習和記憶、信息處理的速度和精神運動能力、執(zhí)行功能等均會下降，這種影響將成為日?；顒雍涂祻偷闹饕系K。但目前，對于慢性疼痛導致患者認知功能受損的發(fā)病機制尚不明了，臨床也缺乏治療手段，因此，積極探索研究其發(fā)病機制，尋找新的治療靶點以及闡述其可能介導的分子機制具有重要的臨床意義。

目前的研究認為，慢性疼痛導致認知功能障礙的發(fā)生，主要因為大腦中某些區(qū)域受到損傷[9]。同時，慢性疼痛還會加速腦部老化[10]，其中大腦左右的海馬體常有受累。海馬體在人的記憶和認知等方面起到關鍵作用，受損后往往很難逆轉[11]。一系列研究表明，慢性疼痛引發(fā)的認知功能障礙和患者海馬組織的損傷是密切相關的，包括學習障礙和記憶障礙[12]，多項臨床研究數據顯示慢性疼痛患者的海馬結構和功能發(fā)生了變化[13]。神經損傷大鼠模型的海馬體神經元減突觸可塑性降低，而后者是海馬體發(fā)揮學習和記憶功能的基礎[14-15]，海馬區(qū)星型膠質細胞的數量減少可能會影響神經元的功能，進而導致認知功能障礙。

血管內皮生長因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)是血管內皮生長因子家族中的一員，在血管生成、淋巴管生成、內皮細胞生長和存活等方面具有活性，并能影響血管通透性[16-17]。此外，VEGF-C在調控神經干細胞分化、軸突發(fā)育等方面也發(fā)揮著重要功能。Heinolainen等[18]發(fā)現VEGF-C結合受體VEGFR3后可以激活靜止NSCs進入細胞周期，并產 生祖細胞，并介導細胞內AKT和ERK通路的激活，調控神經干細胞增殖。Cho等[19]發(fā)現VEGF-C的缺失對非洲爪蟾和小鼠胚胎大腦中的神經發(fā)育起損害作用，并且NSCs內VEGF-3的條件缺失將影響成年小鼠腦室下區(qū)(subventricular zone，SVZ)中的神經發(fā)生。在這一基礎上，本實驗進一步研究了VEGF-C對于神經干細胞的分化以及軸突發(fā)育的影響，以及慢性疼痛引發(fā)的認知功能障礙過程中，大鼠體內VEGF-C的分泌水平。并且通過Western Blot定性與定量檢測星形膠質細胞特異性標志蛋白GFAP以及神經干細胞特異性標志蛋白Nestin、NeuN的表達水平，旨在揭示VEGF-C的水平與神經干細胞、星形膠質細胞活性水平的關系。

本研究的結果顯示，在動物模型上，Morris水迷宮測試顯示慢性疼痛模型的大鼠出現認知功能障礙，說明模型構筑成功，同時，慢性疼痛實驗組的血清VEGF-C表達較對照組降低，這可能是海馬體星形膠質細胞受損導致VEGF-C胞外分泌減少，腦組織蛋白定量也顯示，慢性疼痛實驗組的GFAP蛋白表達升高、Nestin、NeuN的蛋白表達較實驗組降低，說明慢性疼痛不僅影響星形膠質細胞，對神經干細胞也有損傷作用。本實驗在離體細胞模型上進一步驗證VEGF-C的作用機制。分別設計VEGF-C的 shRNA以及過表達載體，通過慢病毒轉染原代星形膠質細胞，敲減和過表達VEGF-C，并與原代神經干細胞進行共培養(yǎng)，分別從上調和下調兩方面，對VEGF-C的細胞內外水平變化以及下游調控通路進行檢測。結果發(fā)現，VEGF-C敲減后，神經干細胞的分化和軸突發(fā)育均受到影響，GFAP、Nestin、NeuN等特異性標志蛋白的表達大大下降，說明VEGF-C的下調對星形膠質細胞與神經干細胞皆有負面作用，這可能是慢性疼痛引發(fā)的認知功能障礙的基礎。但本研究仍無法證實是星形膠質細胞活化引起VEGF-C的下調還是VEGF-C下調使得星形膠質細胞活化，同時，是否有其他類型VEGF分子機制參與這一過程，可能需要生物信息學分析以及進一步的實驗進行證實。