■張 航 張騰龍 王雨瓊 魏曼琳 ?；?/p>

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028000；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

乳腺炎是導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)下降的一種疾病，嚴(yán)重影響奶牛生產(chǎn)效益。當(dāng)前主要使用抗菌藥物治療奶牛乳腺炎，但其易產(chǎn)生耐藥性、藥物殘留等問(wèn)題，所以尋找天然藥物尤為重要。共軛亞油酸（Conjugated linoleic acids，CLA）是具有共軛雙鍵的亞油酸的位置和幾何異構(gòu)體的總稱。在CLA 的同分異構(gòu)體中，c9，t11-CLA 和t10，c12-CLA 是最主要的兩種。共軛亞油酸作為一種長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸，參與機(jī)體內(nèi)一系列生理活動(dòng)，具有抗癌、抗炎、降低體脂、調(diào)節(jié)血糖、提高免疫力等諸多重要的生理學(xué)功能。

CLA的抗炎作用已被廣泛報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，CLA能夠通過(guò)免疫抑制炎性因子的產(chǎn)生和預(yù)防免疫誘導(dǎo)改變免疫應(yīng)答[1-2]，可以通過(guò)調(diào)控免疫應(yīng)答和免疫細(xì)胞因子影響宿主免疫調(diào)節(jié)，延緩機(jī)體免疫能力的衰退[3-4]。在小鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型中添加c9，t11-CLA 可有效減少腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）和白介素6（IL-6）的產(chǎn)生，降低關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度[5]。日糧中添加CLA可顯著增加抗炎細(xì)胞因子白介素（IL-10）的mRNA 表達(dá)水平，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[6]。研究表明，CLA 可以調(diào)節(jié)參與炎癥反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生[7]。但CLA對(duì)奶牛乳房炎是否有一定的作用還不清楚，因此本研究以奶牛乳腺上皮細(xì)胞（BMECs）為體外模型，通過(guò)添加不同濃度的c9，t11-CLA確定其對(duì)細(xì)胞增殖和炎癥細(xì)胞因子的影響，為進(jìn)一步探討CLA的抗炎機(jī)制和開(kāi)發(fā)新型奶牛乳腺炎預(yù)防藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

BMECs 由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)自治區(qū)高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)組織塊培養(yǎng)法分離鑒定所得。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液、膠原酶Ⅱ、胰蛋白酶/EDTA 和雙抗（均由GIBCO公司提供）；氫化可的松、表皮生長(zhǎng)因子、催乳激素（均由SIGMA公司提供）；PBS溶液（HyClone公司）、兩性霉素（AMRESCO 公司）；無(wú)脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）（Equitech-Bio 公司）；RNAprep pure Cell/Bacteria Kit（天根生化科技有限公司）；Prime?Script RT Master Mix 和SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（TaKaRa公司）；CCK-8活力檢測(cè)試劑盒（Dojindo分子技術(shù)公司）；TNF-α、IL-6、白介素8（IL-8）、IL-10活性檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 c9，t11-CLA對(duì)BMECs增殖能力的影響

c9，t11-CLA由無(wú)水乙醇溶解，用0.22 μm的無(wú)菌濾器過(guò)濾后分裝于10 mL 無(wú)菌離心管。臨用前用DMEM/F12完全培養(yǎng)基稀釋成工作濃度。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BMECs 用0.25%胰酶消化計(jì)數(shù)后，每孔按4×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板中，加入含有不同濃度（0、50、100、200、400、800 μmol/L）c9，t11-CLA的DMEM/E12 培養(yǎng)液，在37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中處理24 h，再將每孔中加入10 μL的CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)下的OD值。每組6個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.2.2 c9，t11-CLA對(duì)BMECs炎癥因子的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BMECs 用0.25%胰酶消化計(jì)數(shù)后，每孔按1.0×105的細(xì)胞密度接種于6孔板中。試驗(yàn)分為0、50、100、200 μmol/L 4個(gè)濃度處理組。將細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，按照ELISA 試劑盒的指示操作，測(cè)定BMECs 中TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10的濃度。每個(gè)樣品重復(fù)6次，取平均值。

1.2.3 c9，t11-CLA對(duì)BMECs促炎因子mRNA表達(dá)量的影響

同上述方法1.2.2 收集細(xì)胞和試驗(yàn)分組，按照總RNA 提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA 的濃度和純度后用TaKaRa 試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。按照SYBR Green 試劑盒檢測(cè)促炎基因的mRNA 表達(dá)水平。PCR 反應(yīng)條件為：實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的反應(yīng)程序?yàn)椋?5.0 ℃預(yù)變性30 s；95.0 ℃變性30 s，Tm退火20 s，72.0 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生物生工進(jìn)行測(cè)序。引物序列見(jiàn)表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 所測(cè)基因的引物序列[8]

1.3 數(shù)據(jù)分析

首先通過(guò)Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，隨后采用SAS 9.0 軟件包中的單因素方差分析（one-way ANOVA，LSD）對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用Duncan’s 法進(jìn)行多重比較。所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P<0.05 表示差異顯著。用2-ΔΔCt計(jì)算基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 c9，t11-CLA對(duì)BMECs增殖能力的影響（見(jiàn)圖1）

圖1 不同濃度c9，t11-CLA對(duì)BMECs增殖的影響

由圖1 可知，不同濃度的c9，t11-CLA 對(duì)BMECs的增殖效果不同。與對(duì)照組相比，50、100 μmol/L 和200 μmol/L c9，t11-CLA對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖能力有一定的促進(jìn)作用，而400 μmol/L 和800 μmol/L c9，t11-CLA 時(shí)細(xì)胞增殖能力顯著降低（P<0.05），所以選用50、100 μmol/L 和200 μmol/L c9，t11-CLA 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 c9，t11-CLA對(duì)BMECs炎癥因子的影響（見(jiàn)圖2）

由圖2可知，不同濃度的c9，t11-CLA對(duì)BMECs中促炎細(xì)胞因子IL-6和抗炎細(xì)胞因子IL-10含量沒(méi)有顯著影響（P>0.05）。與對(duì)照組相比，添加200 μmol/L c9，t11-CLA顯著降低促炎細(xì)胞因子IL-8和TNF-α含量（P<0.05），添加50 μmol/L 和100 μmol/L c9，t11-CLA 顯著增加促炎細(xì)胞因子TNF-α含量（P<0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明，c9，t11-CLA 對(duì)BMECs 的抗炎作用可能存在一定的劑量選擇性。

圖2 不同濃度c9，t11-CLA對(duì)BMECs炎癥因子的影響

2.3 c9，t11-CLA 對(duì)BMECs 促炎因子mRNA 表達(dá)量的影響（見(jiàn)圖3）

由圖3 可知，不同濃度c9，t11-CLA 對(duì)IL-6 的mRNA 表達(dá)量無(wú)顯著影響。與對(duì)照組相比，添加100 μmol/L 的c9，t11-CLA 可以顯著提高IL-8 的mRNA表達(dá)量（P<0.05），200 μmol/L的c9，t11-CLA顯著降低IL-8和TNF-α的mRNA表達(dá)量（P<0.05）。

圖3 不同濃度c9，t11-CLA對(duì)BMECs促炎因子mRNA表達(dá)量的影響

3 討論

奶牛乳腺炎是危害奶牛健康的發(fā)生率最高的疾病之一，嚴(yán)重影響了乳產(chǎn)量和乳品質(zhì)。所以，找到高效無(wú)毒的乳腺炎治療藥物成為畜牧獸醫(yī)科研人員的研究熱點(diǎn)。CLA 作為一種天然存在于生物體內(nèi)的極具應(yīng)用價(jià)值的功能性脂類(lèi)物質(zhì)，有著抗炎、抗氧化、提高免疫力等作用，但其作用劑量和機(jī)制等還不清楚。

本研究初步進(jìn)行了c9，t11-CLA對(duì)BMECs抗炎作用劑量的探索。研究結(jié)果顯示，添加200 μmol/L c9，t11-CLA顯著降低BMECs促炎細(xì)胞因子IL-8和TNF-α的含量及mRNA 表達(dá)量，100 μmol/L 的c9，t11-CLA顯著提高TNF-α的含量和IL-8 的mRNA 表達(dá)量。細(xì)胞炎癥因子可以提供一種快速、可靠和高靈敏度的檢測(cè)手段，因此炎癥因子的表達(dá)與調(diào)控已成為當(dāng)前炎癥相關(guān)研究的熱點(diǎn)之一。IL-6 促進(jìn)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的趨化轉(zhuǎn)移，可以降低中性粒細(xì)胞的有害作用和免疫機(jī)制的發(fā)生[8]。IL-8 是趨化家族的因子，對(duì)中性粒細(xì)胞有細(xì)胞趨化作用而實(shí)現(xiàn)其對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。TNF-α是炎癥感染早期產(chǎn)生的最主要細(xì)胞因子，可以幫助宿主抵抗感染[9]，與大腸桿菌引起的急性乳房炎有關(guān)[10]。Yu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，CLA在小鼠的巨噬細(xì)胞中可以降低TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA 表達(dá)量。Dipasquale 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，LPS 誘導(dǎo)BMECs 產(chǎn)生炎性反應(yīng)后，添加50 μmol/L的c9，t11-CLA可以顯著降低促炎性因子IL-6、TNF-α和抗炎因子IL-10 的mRNA表達(dá)量。本研究結(jié)果顯示，添加50 μmol/L c9，t11-CLA 顯著提高了BMECs 促炎性因子TNF-α的含量，對(duì)IL-6、IL-8、TNF-α的表達(dá)量沒(méi)有顯著影響。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)比較不同濃度c9，t11-CLA對(duì)BMECs中細(xì)胞炎癥因子含量和mRNA 表達(dá)量，確定200 μmol/L c9，t11-CLA 顯著降低BMECs 中促炎因子IL-8 和TNF-α含量和mRNA表達(dá)量，表明該濃度對(duì)促炎細(xì)胞因子有明顯的抑制作用，該結(jié)果可為研究c9，t11-CLA對(duì)BMECs抗炎作用機(jī)理提供數(shù)據(jù)支撐。