王曉紅

江西省上饒市第二人民醫(yī)院檢驗科，江西上饒 334000

肺結(jié)核是臨床呼吸內(nèi)科常見的一類慢性傳染性疾病，主要是由于結(jié)核分枝桿菌感染肺部而引起，主要癥狀包括發(fā)熱、咳痰、疲乏無力、血液系統(tǒng)異常等，此病亦是中青年人群的重要死因之一，對患者的生命健康造成嚴重威脅[1-2]。目前對于肺結(jié)核的診斷，多采用醫(yī)生詢問體征及有無病史結(jié)合痰結(jié)核分枝桿菌檢查，以及影像學檢查等[3]。肺結(jié)核發(fā)病率居高不下，引起國內(nèi)外廣泛關注，以往通過傳統(tǒng)痰涂片痰培養(yǎng)診斷肺結(jié)核，但此種方法存在檢測陽性率低，所需時間長等不足之處，為臨床診治帶來了難度，因此提高肺結(jié)核的診斷陽性率以及診治速度尤為關鍵[4-5]。本研究主要探究PCR熒光探針法聯(lián)合DNA微陣列芯片法檢測在肺結(jié)核診斷和治療中的應用效果，旨在尋找臨床診斷肺結(jié)核及耐藥鑒定快速準確的實驗指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月至10月上饒市第二人民醫(yī)院收治的128例肺結(jié)核患者為觀察組，另外選取同期40例非肺結(jié)核患者為對照組。對照組中，男30例，女10 例；年齡 24～80 歲，平均（52.15±5.02）歲。觀察組中，男 96例，女 32例；年齡 23～81歲，平均（54.05±4.85）歲。兩組的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)上饒市第二人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。納入標準：①觀察組患者經(jīng)臨床診斷并結(jié)合影像學資料、實驗室檢查，確診為肺結(jié)核患者；②所有對象均留取晨痰、血清標本進行痰涂片抗酸染色結(jié)核抗體PCR熒光探針法及DNA微陣列芯片法檢測；③患者及其家屬知曉本次研究，并簽署知情同意書。排除標準：①患有惡性腫瘤者；②合并心、肝、腎等重要器官功能障礙者；③合并患有其他傳染疾病者。

1.2 檢測方法

（1）痰涂片抗酸染色法：取痰液標本涂在載玻片上，使用抗酸染色液（珠海貝索生物技術有限公司，生產(chǎn)批號：20191021）進行染色，染色完成后置于顯微鏡下觀察，連續(xù)觀察300個不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌為抗酸桿菌陰性（－），否則為抗酸桿菌陽性（＋）。（2）PCR熒光探針法：①收集患者痰液標本，加入等量4%NaOH溶液于離心管中震蕩搖勻，室溫下液化30 min后放入離心機（1200 r/min）中離心5 min，棄上清液后加入1 ml生理鹽水后離心，重復以上操作，棄上清液后加入核酸提取液50 μl，混勻后放入DNA提取儀震蕩5 min，取出放在95℃水浴鍋中加熱5 min；將提取好的核酸加入反應體系中，進行PCR擴增程序，分別為37℃，30 s；94℃，180 s；94℃，15 s；60℃，30 s； 檢測時選擇FAM、VIC通道，采集熒光點在60℃，30 s。當Ct值＜40為陽性，擴增曲線非S型或者Ct值為40（或者無數(shù)值）則為陰性[6]。（3）結(jié)核抗體檢測：采用結(jié)核抗體檢測試劑盒（上海奧普生物醫(yī)藥股份有限公司，生產(chǎn)批號：20190915）進行檢測，在反應板的反應孔中間，依次加入2滴封閉液、40 μl血清標本、6滴洗滌液、2滴金標液、6滴洗滌液，等待薄膜吸入。結(jié)果讀?。罕∧ぶ虚g有紅圓點為陽性，否則為陰性。（4）DNA微陣列芯片法：對PCR擴增出結(jié)核分枝桿菌的提取液和結(jié)核基因芯片反應液進行擴增，擴增產(chǎn)物進行芯片雜交，之后采用結(jié)核分枝桿菌耐藥基因盒（成都博奧晶芯生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：20191102）進行利福平和異煙肼耐藥性檢測[7]，洗板使用微陣列掃描儀和相應軟件進行信號的讀取及結(jié)果判讀，所有操作過程都嚴格按照說明書執(zhí)行。

1.3 觀察指標及評價標準

①比較痰涂片抗酸染色、血清結(jié)核抗體及PCR熒光探針法檢測結(jié)果及診斷效能，a、b、c、d分別表示真陽性、假陽性、假陰性、真陰性，靈敏度=a/（a+c），特異度=d/（b+d），陽性預測值=a/（a+b），陰性預測值=d（c+d），準確度=（a+d）/（a+b+c+d）。②統(tǒng)計 DNA 微陣列芯片法檢測利福平和異煙肼耐藥性結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 痰涂片抗酸染色、血清結(jié)核抗體及PCR熒光探針法檢測結(jié)果及診斷效能比較

PCR熒光探針法診斷肺結(jié)核的靈敏度、特異度、陽性預測值、準確度高于痰涂片抗酸染色和血清結(jié)核抗體，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表 1～4）。

表1 痰涂片抗酸染色檢測結(jié)果（例）

表2 血清結(jié)核抗體檢測結(jié)果（例）

表3 PCR熒光探針法檢測結(jié)果（例）

表4 三種檢測方法檢測診斷效能比較（%）

2.2 DNA微陣列芯片法檢測利福平和異煙肼耐藥性的結(jié)果

128例肺結(jié)核患者中，DNA微陣列芯片法檢出利福平敏感45例，耐藥11例；異煙肼敏感44例，耐藥12例；雙重耐藥5例。其中11例利福平耐藥標本中，利福平rpoB基因耐藥位點分布為531（TCG→TTG）位點 6例，526 （CAC→TAC） 位點 2例，526 （CAC→CTC）位點 1 例，516（GAC→GGC）位點 1 例，511（CTG→CCG）位點1例；12例異煙肼耐藥標本中異煙肼katG基因耐藥位點分布為315（AGC→ACC）位點11例，315（AGC→AAC）位點 1 例。

3 討論

肺結(jié)核是嚴重威脅公共衛(wèi)生安全的傳染病之一，兼具感染率高、死亡率高、控制進程緩慢等特點，因此早期診斷及盡早制定治療方案對治療肺結(jié)核尤為重要[8]。肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌所引起，因此目前臨床上對于發(fā)現(xiàn)結(jié)核病傳染源的主要手段是對患者痰液中的結(jié)核分枝桿菌進行檢測，常用方法有改良羅氏法、結(jié)合抗體檢測等，但這些方法在檢測陽性率、檢測周期等方法存在不足之處[9-10]。近些年來，由于分子生物技術的快速發(fā)展，相關檢測技術應用于肺結(jié)核臨床診斷中，PCR熒光探針具有檢測周期短、敏感度高等優(yōu)勢，可精準檢測患者痰液中的結(jié)核分枝桿菌；DNA微陣列芯片法操作簡單且可以同時檢測多種分枝桿菌多種耐藥情況，可有效減少患者診斷和治療時間[11-12]。

PCR熒光探針法診斷肺結(jié)核的靈敏度、特異度、陽性預測值、準確度高于痰涂片抗酸染色和血清結(jié)核抗體，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示PCR熒光探針法可作為臨床分枝桿菌感染診斷的重要檢測手段。PCR熒光探針法主要是將雙重PCR技術和Taqman探針技術相結(jié)合，再根據(jù)結(jié)核分枝桿菌的特異性序列，設計引物以及探針；探針標記不同的熒光發(fā)光基因，根據(jù)不同的熒光通道的熒光信號變化，判定是否感染結(jié)核分枝桿菌，操作簡便、快速，且準確率高[13]。本研究結(jié)果顯示，實驗組應用DNA微陣列芯片法檢出利福平敏感45例，耐藥11例；異煙肼敏感44例，耐藥12例；雙重耐藥5例，提示DNA微陣列芯片法可快速檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平異煙肼耐的耐藥性，具有較高的檢測效能。DNA微陣列芯片法是通過檢測抗結(jié)核藥物利福平和異煙肼的耐藥基因的野生型、不同突變型來判斷是否耐藥；同時可快速檢測標本中的分枝桿菌利福平基因和耐異煙肼基因突變的變位點，特異性高[14-15]；此外設計PCR擴增引物與核苷酸探針，在芯片上固定，并經(jīng)與針對性擴增受檢樣本的DNA片段雜交，通過芯片掃描儀對雜交后的芯片熒光信號進行掃描獲取菌種信息[16-17]。DNA微陣列芯片法檢測結(jié)核分枝桿菌的耐藥與傳統(tǒng)藥物敏感法有較高的一致性，較為可靠且檢測所需時間短，可以作為臨床肺結(jié)核耐藥性的快速篩查方法[12]。

綜上所述，PCR熒光探針法聯(lián)合DNA微陣列芯片法既能提高結(jié)核分枝桿菌的陽性率，也能快速檢測結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，48 h即可獲得診斷及耐藥結(jié)果，可以協(xié)助早期診斷，制定有效的治療方案，對改善肺結(jié)核患者預后具有重要意義，臨床價值高。