張訓(xùn)樂 王姍姍 趙佳惠 黃家情 聞 嫵 貢岳松

(南京中醫(yī)藥大學(xué)2016級碩士研究生，江蘇 南京 210046)

保元湯最早見于明·魏直的《博愛心鑒》，是治療元氣虛弱的著名方劑，組方包含黃芪、人參、甘草、肉桂4味藥，全方可大補(bǔ)元氣，尤補(bǔ)后天脾、肺之氣，健脾保肺溫腎，能治一切元氣虛弱之癥，故名保元湯，并通過歷代醫(yī)家的臨床運(yùn)用，驗證了其確切的臨床效果[1-2]。隨著現(xiàn)代研究的不斷深入，保元湯的臨床應(yīng)用也日益廣泛，相關(guān)研究表明保元湯在免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及抗氧化等方面有較好的作用[3-5]。我們基于這些研究推測，保元湯具有一定的抗衰老作用。線蟲是廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域的模式生物，用于揭示先天免疫、氧化脅迫效應(yīng)、環(huán)境暴露與損傷的機(jī)制，其中秀麗隱桿線蟲具有生活周期短、易飼養(yǎng)、生物學(xué)終點多、在實驗室可大量培養(yǎng)等特點，已成為衰老研究中常用的模式生物，并擁有與哺乳動物同源的抗氧化脅迫機(jī)制和相關(guān)基因[6-7]。因此，我們嘗試?yán)眯沱愲[桿線蟲作為模型，觀察保元湯提取物對秀麗隱桿線蟲壽命的延長作用，探討保元湯可能的抗衰老作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 蟲株與菌株 野生型N2秀麗隱桿線蟲，采用線蟲生長培養(yǎng)基(NGM)，以大腸桿菌Escherichia coli OP50 飼喂，由美國賓夕法尼亞大學(xué)提供。

1.2 實驗藥物及試劑

1.2.1 實驗藥物 保元湯藥物組成：黃芪、人參、甘草、肉桂，比例6∶2∶2∶1(北京同仁堂南京藥店有限公司)。

1.2.2 實驗試劑 NGM培養(yǎng)基配方：氯化鈉(NaCl)3 g，蛋白胨2.5 g，瓊脂17 g，磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀(K2HPO4-KH2PO4)緩沖液(1 mol/L，pH 6.0)25 mL，雙蒸水(ddH2O)975 mL，滅菌處理后加膽固醇溶液(5 mg/mL)1 mL，硫酸鎂溶液(MgSO4)(1 mol/L)1 mL，氯化鈣溶液(CaCl2)(1 mol/L)1 mL。S-培養(yǎng)基配方：K2HPO4-KH2PO4緩沖液(1 mol/L，pH 6.0)50 mL，NaCl 5.9 g，加水定容至1 L，滅菌處理后加膽固醇溶液(5 mg/mL)1 mL，混勻后量取977 mL混合液，加1M檸檬酸鉀緩沖液(pH 6.0)10 mL，痕量金屬溶液10 mL，MgSO4(1 mol/L)3 mL，CaCl2(1 mol/L)3 mL。線蟲M9緩沖液：KH2PO43 g，磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 6 g，NaCl 5 g，1 ml MgSO4，加 ddH2O至1 L，121℃滅菌。

1.3 實驗儀器 超凈工作臺(蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司)；顯微鏡(日本Olympus公司)；高壓滅菌鍋[致微(廈門)儀器有限公司]；生化培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琦有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 藥物提取 依據(jù)保元湯方藥物比例稱取藥材30 g，研成粉末，加10倍量水采用回流提取法提取1 h，提取3次，合并3次藥液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至100 mL，最后采用真空冷凍干燥法獲得保元湯粗提物。

1.4.2 線蟲培養(yǎng) 于空白的NGM培養(yǎng)基中央滴入50 μL左右的大腸桿菌菌液，用涂布器將菌液均勻涂布，注意菌液邊緣不宜太過，應(yīng)距離平板邊緣5 mm左右，采用團(tuán)塊法將秀麗隱桿線蟲接種在含大腸桿菌的NGM培養(yǎng)基上，20 °C培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)[8]。

1.4.3 同步化處理 用液體NGM沖下培養(yǎng)基中的L4期秀麗隱桿線蟲成蟲，轉(zhuǎn)至10 mL無菌離心管中，高心機(jī)1300×g離心1 min,洗滌2次，保留與約0.25 mLNGM,加無菌水3.75 mL,加堿裂解液[氫氧化鈉(NaOH)(5 mol/L)0.5 mL，漂白劑(Bleach)1 mL]至混勻振蕩，每2 min至于顯微鏡下觀察秀麗隱桿線蟲線蟲裂解狀態(tài)，裂解時間不超過6 min。1300×g離心1 min，液體NGM洗滌2次，S-培養(yǎng)基洗滌2次，移除上清，加S-培養(yǎng)基8 mL，置于20 ℃培養(yǎng)箱中振搖孵育24 h，從而得到生長同期化的秀麗隱桿線蟲[9]。

1.4.4 實驗分組 將同期化的秀麗隱桿線蟲分為空白對照組、溶劑對照組、保元湯組，空白組對照組不加任何藥物，溶劑對照組加二甲基亞礬溶劑，保元湯組分別加1000、500、200、100、50 μg/mL的保元湯提取物藥液培養(yǎng)，條件20 ℃恒溫，選用96孔板液體培養(yǎng)法進(jìn)行給藥干預(yù)培養(yǎng)。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 壽命實驗[10-11]比較各組秀麗隱桿線蟲的壽命變化情況，采用同期化的L4期秀麗隱桿線蟲觀察。同步化處理的秀麗隱桿線蟲由卵成長至L4期后，各組進(jìn)行給藥干預(yù)，每組100條左右，給藥當(dāng)日年齡標(biāo)記為0。每日顯微鏡觀察秀麗隱桿線蟲的狀態(tài)，記錄存活、死亡數(shù)量，計算平均壽命。觀測前將96孔板置于搖床上輕輕振搖2 min，秀麗隱桿線蟲死亡判定標(biāo)準(zhǔn)為振動或強(qiáng)光刺激秀麗隱桿線蟲不彎曲身體或頭部不擺動，身體呈僵直狀態(tài)。

1.5.2 生殖力測定[12-13]比較各組秀麗隱桿線蟲的生殖力變化情況，采用同期化的L1期秀麗隱桿線蟲觀察。同步化處理的秀麗隱桿線蟲由卵成長至L1期后，各組進(jìn)行給藥干預(yù)。藥物干預(yù)48 h后，用移液器吸取秀麗隱桿線蟲，轉(zhuǎn)至標(biāo)注好的1.5 mL離心管中，1300×g離心1 min。移除上清，加線蟲M9緩沖液，1300×g離心1 min，重復(fù)2次。移液器吸取秀麗隱桿線蟲至空白NGM培養(yǎng)皿上，每板1條，每組15條，轉(zhuǎn)移至20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察統(tǒng)計每塊培養(yǎng)皿上的蟲卵數(shù)目。

1.5.3 運(yùn)動能力測定[14-15]比較各組秀麗隱桿線蟲的運(yùn)動能力變化情況，正常情況下其以S形向前移動，衰老后運(yùn)動能力下降，運(yùn)動彎曲的頻率減少，可反映其生命活力，采用同期化的L4期秀麗隱桿線蟲觀察。同步化處理的秀麗隱桿線蟲由卵成長至L4期后，各組進(jìn)行給藥干預(yù)。藥物干預(yù)6 d后，用移液器吸取線蟲，轉(zhuǎn)至標(biāo)注好的1.5 mL離心管中，1300×g離心1 min。移除上清，加線蟲M9緩沖液，1300×g離心1 min，重復(fù)2次。移液器吸取秀麗隱桿線蟲至空白NGM培養(yǎng)皿上，每板5條，每組15條，讓其自由運(yùn)動1 min，顯微鏡下統(tǒng)計秀麗隱桿線蟲1 min內(nèi)運(yùn)動S形的個數(shù)(即1 min內(nèi)走過的峰數(shù))，重復(fù)3次。

1.5.4 頭部擺動測定[16-17]比較各組秀麗隱桿線蟲的頭部擺動變化情況，頭部擺動行為定義為頭部擺動方向改變且改變角度大于90°，采用同期化的L4期秀麗隱桿線蟲觀察。同步化處理的秀麗隱桿線蟲由卵成長至L4期后，各組進(jìn)行給藥干預(yù)。藥物干預(yù)6 d后，用移液器吸取線蟲，轉(zhuǎn)至標(biāo)注好的1.5 mL離心管中，1300×g離心1 min。移除上清，加線蟲M9緩沖液，1300×g離心1 min，重復(fù)2次。移液器吸取秀麗隱桿線蟲至空白NGM培養(yǎng)皿上，每板5條，每組15條，讓其自由運(yùn)動1 min后，觀察記錄其在1 min 內(nèi)頭部擺動次數(shù)。

1.5.5 熱應(yīng)激[18-19]比較各組秀麗隱桿線蟲的熱應(yīng)激能力變化情況，采用同期化的L4期秀麗隱桿線蟲觀察。同步化處理的秀麗隱桿線蟲由卵成長至L4期后，各組進(jìn)行給藥干預(yù)。藥物處理2 d后，每組15條，去除封口膜，將96孔板上秀麗隱桿線蟲一起轉(zhuǎn)移到35 ℃培養(yǎng)箱中熱應(yīng)激10 h，然后再將其轉(zhuǎn)移到20 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每日顯微鏡下觀察記錄秀麗隱桿線蟲死亡、存活條數(shù)，直至空白對照組秀麗隱桿線蟲存活率<10%。存活率(%)=(總數(shù)-死亡數(shù)目)/總數(shù)×100%。

1.5.6 氧化應(yīng)激[13,18]比較各組秀麗隱桿線蟲的氧化應(yīng)激能力變化情況，采用同期化的L4期秀麗隱桿線蟲觀察。同步化處理的秀麗隱桿線蟲由卵成長至L4期后，各組進(jìn)行給藥干預(yù)。。藥物處理2 d后，每組15條，各組分別加入20 mmol/L百草枯，進(jìn)行氧化應(yīng)激處理，培養(yǎng)24 d后，開始每日顯微鏡下觀察統(tǒng)計秀麗隱桿線蟲死亡、存活條數(shù)，直至空白對照組秀麗隱桿線蟲存活率<10%。

2 結(jié)果

2.1 各組秀麗隱桿線蟲壽命情況比較 見表1。

表1 各組秀麗隱桿線蟲壽命情況比較

由表1可見，溶劑對照組秀麗隱桿線蟲平均壽命與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。保元湯各組中100 、200、500 μg/mL組秀麗隱桿線蟲平均壽命較空白對照組均明顯延長，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但3組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；50、1000 μg/mL組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組秀麗隱桿線蟲生殖力情況比較 見表2。

表2 各組秀麗隱桿線蟲生殖力情況比較

由表2可見，溶劑對照組及保元湯各組秀麗隱桿線蟲平均產(chǎn)卵量與空白對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，保元湯各組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 各組秀麗隱桿線蟲運(yùn)動能力情況比較 見表3。

表3 各組秀麗隱桿線蟲運(yùn)動能力情況比較

由表3可見，溶劑對照組秀麗隱桿線蟲1 min平均運(yùn)動峰數(shù)與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。保元湯各組中200、500、1000 μg/mL組秀麗隱桿線蟲1 min平均運(yùn)動峰數(shù)較空白對照組均明顯增多，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但3組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；50、100 μg/mL組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 各組秀麗隱桿線蟲頭部擺動情況比較 見表4。

表4 各組秀麗隱桿線蟲頭部擺動情況比較 次，

由表4可見，溶劑對照組秀麗隱桿線蟲1 min平均擺動次數(shù)與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。保元湯各組中200、500、1000 μg/mL組秀麗隱桿線蟲1 min平均擺動次數(shù)較空白對照組均明顯增多，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但3組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；50、100 μg/mL組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 各組秀麗隱桿線蟲熱應(yīng)激測試比較 熱應(yīng)激測試后的第1、2天空白對照組和溶劑對照組秀麗隱桿線蟲均出現(xiàn)明顯死亡，而保元湯各組可以顯著提高秀麗隱桿線蟲的耐熱能力，其中200、500、1000 μg/mL組存活率均明顯高于空白對照組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。熱應(yīng)激測試第3天空白對照組和溶劑對照組秀麗隱桿線蟲幾乎全部死亡，而保元湯各組還有約10%以上存活率，其中200、500、1000 μg/mL組存活率明顯高于空白對照組(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組秀麗隱桿線蟲熱應(yīng)激測試比較(*P<0.05)

2.6 各組秀麗隱桿線蟲氧化應(yīng)激測試比較 氧化應(yīng)激測試第1、2、3天空白對照組和溶劑對照組秀麗隱桿線蟲均出現(xiàn)明顯死亡，而保元湯各組可以顯著提高秀麗隱桿線蟲的抗氧化應(yīng)激損傷的能力，其中200、500、1000 μg/mL組存活率均明顯高于空白對照組。氧化應(yīng)激測試第4天空白對照組和溶劑對照組秀麗隱桿線蟲幾乎全部死亡，而保元湯各組還有約10%以上的存活率，其中200、500、1000 μg/mL組存活率明顯高于空白對照組(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組秀麗隱桿線蟲氧化應(yīng)激測試比較(*P<0.05)

3 討論

中醫(yī)學(xué)對衰老的認(rèn)識和研究源遠(yuǎn)流長，早在《內(nèi)經(jīng)》中就有“”正氣存內(nèi)，邪不可干”的論述，認(rèn)為氣是構(gòu)成人體和維持人體生命活動的基本物質(zhì)，機(jī)體正氣充足，則抵御外邪能力強(qiáng)，從而身強(qiáng)體健不易發(fā)病而可得“天年”，氣虛、氣不足可導(dǎo)致機(jī)體的臟腑功能減退，加速衰老[20-21]。中醫(yī)學(xué)歷經(jīng)幾千年的臨床實踐，在如何延年益壽和抗衰老方面積累了豐富的用藥經(jīng)驗，其中保元湯作為補(bǔ)氣劑的代表方，經(jīng)歷代醫(yī)家的臨床運(yùn)用驗證，療效確切，可益氣補(bǔ)虛培元，主治虛損勞怯、元氣不足、倦怠乏力等[22-23]。方中人參性稟中和，益元氣而生精血，善補(bǔ)脾肺之氣；黃芪則側(cè)重補(bǔ)益衛(wèi)表之氣，固腠理而補(bǔ)元氣，與人參相須為用，增強(qiáng)補(bǔ)氣之功；肉桂鼓舞命門真氣，鼓動氣血運(yùn)行，可助心陽和溫化水飲；甘草益氣和中，調(diào)和諸藥。四藥合用，補(bǔ)元氣，生精血，陰陽兼顧，徹里徹外，通補(bǔ)無瀉，而奏氣足、精充、神旺的功效?，F(xiàn)代藥理研究證實，保元湯在免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及抗氧化作用等方面均有較好的藥理作用[24-25]。

衰老是指生物體在正常狀況下發(fā)育成熟后，隨著年齡的繼續(xù)增加，機(jī)體的生理功能出現(xiàn)逐漸下降的表現(xiàn)，最終導(dǎo)致生命體死亡的過程，因此在延緩衰老的研究中壽命的長短可作為其一個定量指標(biāo)[26]。本實驗結(jié)果顯示，保元湯在100 、200、500 μg/mL劑量時可明顯延長秀麗隱桿線蟲的壽命，表明保元湯對秀麗隱桿線蟲而言有延緩衰老的作用。

在衰老領(lǐng)域，長壽和生殖總是被聯(lián)系在一起，且普遍認(rèn)為壽命與其生殖能力成反比關(guān)系，對大多數(shù)生物體而言，當(dāng)生殖期結(jié)束則機(jī)體就逐漸開始呈現(xiàn)衰老。有研究認(rèn)為，包括線蟲、黑腹果蠅、人類等有機(jī)體都有通過干預(yù)生殖功能來實現(xiàn)延長壽命的可能性，但目前這個觀點還有頗多爭議[27]。本實驗結(jié)果顯示，保元湯在延緩秀麗隱桿線蟲衰老的同時并沒有影響其產(chǎn)卵量，說明保元湯對秀麗隱桿線蟲并沒有生殖毒性，也不是通過抑制生殖來延長壽命。

運(yùn)動能力可反映秀麗隱桿線蟲的生命活力，秀麗隱桿線蟲在運(yùn)動過程中以正弦曲線S的形式向前移動，當(dāng)秀麗隱桿線蟲出現(xiàn)衰老時其運(yùn)動能力也會明顯下降，因此我們通過觀察秀麗隱桿線蟲運(yùn)動來輔助證明藥物延緩衰老的作用。同時秀麗隱桿線蟲頭部擺動能力在一定程度上反映秀麗隱桿線蟲的衰老，其頭部擺動與身體肌壁組織、攝食行為有一定的關(guān)系，擺動次數(shù)越多說明，說明其生命活力越強(qiáng)。本實驗結(jié)果顯示，保元湯在200、500、1000 μg/mL劑量時能提高秀麗隱桿線蟲的活動能力，增加頭部擺動次數(shù)，這些可能是抑制了衰老過程中神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉的退化，延長秀麗隱桿線蟲壽命的同時提高生命活力。

有研究表明，壓力應(yīng)激抵抗能力的提高與生物體壽命延長有關(guān)[18]，幾乎所有已知的長壽突變體線蟲在熱應(yīng)激、氧化應(yīng)激、重金屬毒性、紫外線放射的壓力下，都顯示出了更強(qiáng)的抵抗外界環(huán)境壓力的能力。因此，壓力應(yīng)激實驗的結(jié)果可作為檢測藥物延壽作用的常規(guī)指標(biāo)之一。本實驗結(jié)果顯示，各組用百草枯制作氧化應(yīng)激損傷，而保元湯在200、500、1000 μg/mL劑量時可明顯提高秀麗隱桿線蟲抗氧化應(yīng)激能力，提高存活率。除了氧化應(yīng)激外，熱應(yīng)激也是衰老研究中常用的實驗指標(biāo)之一，在相關(guān)線蟲長壽突變株的研究中發(fā)現(xiàn)，提高熱激轉(zhuǎn)錄因子1(HSF-1)表達(dá)，也能延長線蟲的壽命和提高應(yīng)激抗性[28-29]。本實驗結(jié)果顯示，在熱應(yīng)激條件下，保元湯在200、500、1000 μg/mL劑量時表現(xiàn)出了明顯的抗熱應(yīng)激能力。這一結(jié)果預(yù)示保元湯抗線蟲衰老的作用可能與提高HSF-1有關(guān)，其相互關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，保元湯能夠有效延長秀麗隱桿線蟲的平均壽命，而不影響其生殖功能，具有延緩衰老的作用，其機(jī)制可能與提高秀麗隱桿線蟲抗應(yīng)激能力有關(guān)。然而有關(guān)保元湯更多的抗衰老作用機(jī)制有待將來進(jìn)一步研究。