丁凱雯 顏培正 張 敏

[山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(山東省千佛山醫(yī)院)產(chǎn)科，山東 濟(jì)南 250014]

近年來(lái)，不孕癥發(fā)病率呈現(xiàn)出不斷上升趨勢(shì)，但其發(fā)病原因仍不明確。有研究認(rèn)為[1-2]，不孕癥的發(fā)生可能與體內(nèi)炎癥因子變化及免疫學(xué)因素相關(guān)。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)屬于非組蛋白，其含量豐富且高度保守。近年來(lái)研究顯示，HMGB1可調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)過(guò)程，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種免疫因子的變化影響不孕癥的發(fā)展[3-4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯對(duì)不孕癥模型大鼠免疫HMGB1及自噬蛋白Beclin-1的表達(dá)及血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1(IL-1)、干擾素γ(IFN-γ)、免疫球蛋白G(IgG)的調(diào)控作用，探討當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯治療不孕癥的基本機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性Wistar大鼠60只，3月齡，體質(zhì)量(180±20)g，由濟(jì)南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(魯)2019-0001。自由進(jìn)食、飲水，室溫(23±2)℃，相對(duì)濕度60%。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯藥物組成：當(dāng)歸45 g，桂枝45 g，白芍45 g，細(xì)辛25 g，通草30 g，吳茱萸140 g，生姜125 g，大棗25枚，炙甘草30 g。置于涼水中浸泡2 h，蒸煮30 min后濃縮至濃度為0.5 g/mL的藥液。丙酸睪酮注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H12020532)；枸櫞酸氯米芬片(Medochemie Ltd.，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)H20140688)；TNF-α酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：K1052-100)、IL-1 ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：BEK-2309-1P)、IFN-γELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：BEK-2119-1P)、IgGELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：BEK-2104-2P)，均購(gòu)自武漢艾美捷科技公司；兔抗大鼠HMGB1抗體(批號(hào)：H00003141-M)、兔抗大鼠自噬蛋白Beclin-1抗體(批號(hào)：R-141-100)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體(批號(hào)：A470012)，均購(gòu)自北京博爾西科技有限公司；20%烏拉坦溶液(3 mL/kg)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；4%多聚甲醛溶液(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó)Thermo公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組 將60只Wistar大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，空白組、模型組、枸櫞酸氯米芬片組、當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯組，每組各15只。

1.3.2 造模 除空白組大鼠外，其余3組大鼠均參照文獻(xiàn)[5-6]制備不孕癥大鼠模型：大鼠頸背部皮下注射丙酸睪酮注射液0.2 mL，隔日1次，連續(xù)注射7 d。末次注射后,用無(wú)菌棉簽擦取大鼠陰道脫落細(xì)胞，觀察是否出現(xiàn)角化上皮細(xì)胞，持續(xù)出現(xiàn)5 d即提示不孕癥大鼠造模成功，剔除造模失敗大鼠。

1.3.3 給藥治療 造模結(jié)束后第2天開始灌胃給藥，枸櫞酸氯米芬片組予枸櫞酸氯米芬片溶液治療，按人鼠比例換算制備成0.83 mg/mL溶液，按照0.83 mg/100 g灌胃治療，每次2 mL,每日1次。當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯組予當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯濃縮藥液灌胃，濃度0.5 g/mL，每次2 mL，每日2次?？瞻捉M、模型組予0.9%氯化鈉注射液，每次2 mL，每日1次灌胃。各組大鼠均連續(xù)灌胃治療15 d。

1.4 標(biāo)本采集及檢測(cè)

1.4.1 大鼠子宮組織觀察 末次給藥24 h后，予20%烏拉坦溶液7.5 mL/kg麻醉并處死大鼠，取血后剖取各組大鼠子宮，4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，200倍顯微鏡下觀察大鼠子宮組織形態(tài)學(xué)變化，Digimizer(醫(yī)學(xué)圖像分析軟件)4.5.2測(cè)量子宮內(nèi)膜厚度。

1.4.2 大鼠血清IgG及炎癥因子測(cè)定 處死大鼠后，取大鼠靜脈血10 mL置于離心機(jī)中做離心處理，離心半徑10 cm，轉(zhuǎn)速3000 r/min，離心10 min，取上清液，ELISA法檢測(cè)并記錄各組大鼠血清TNF-α、IL-1、IFN-γ、IgG含量。

1.4.3 HMGB1及自噬蛋白Beclin-1蛋白表達(dá)測(cè)定 應(yīng)用免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)。大鼠處死后，取大鼠子宮內(nèi)膜組織0.5 cm×0.5 cm，將子宮內(nèi)膜組織按照每10 mg組織加入裂解液250 μL，冰上放置10 min，樣品裂解后，13 000 r/min，離心10 min，取上清，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。配制分離膠和濃縮膠，確定上樣量后凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜。加入兔抗大鼠HMGB1抗體、兔抗大鼠自噬蛋白Beclin-1抗體一抗在4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次后加入含辣根過(guò)氧化物酶綴合的羊抗兔抗體二抗室溫孵育1 h。洗膜后浸泡于ECL顯色液中進(jìn)行曝光、顯影并定影。Quantity One軟件分析各組大鼠HMGB1及自噬蛋白Beclin-1蛋白灰度值表達(dá)水平，用目標(biāo)蛋白與對(duì)應(yīng)的內(nèi)參(β-Actin)的比值，得出目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠子宮組織形態(tài)變化 空白組大鼠子宮組織細(xì)胞排列整齊，厚度均勻，間質(zhì)正常，無(wú)(少)炎性浸潤(rùn)；模型組大鼠子宮組織間質(zhì)水腫疏松，腺體稀少，細(xì)胞排列錯(cuò)亂；枸櫞酸氯米芬片組大鼠炎癥細(xì)胞減少，細(xì)胞水腫減少；當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠炎癥細(xì)胞減少，細(xì)胞排列整齊。見圖1。

圖1 各組大鼠子宮組織形態(tài)變化(HE，×200)

2.2 各組大鼠子宮內(nèi)膜厚度比較 見表1。

表1 各組大鼠子宮內(nèi)膜厚度比較

由表1可見，模型組大鼠子宮內(nèi)膜厚度低于空白組(P<0.05)；枸櫞酸氯米芬片組、當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠子宮內(nèi)膜厚度均高于模型組(P<0.05)；當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠子宮內(nèi)膜厚度高于枸櫞酸氯米芬片組(P<0.05)。

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1、IFN-γ及IgG含量比較 見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1、IFN-γ及IgG含量比較

由表2可見，模型組大鼠TNF-α、IL-1、IFN-γ及IgG含量均高于空白組(P<0.05)，枸櫞酸氯米芬片組、當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠TNF-α、IL-1、IFN-γ及IgG含量均低于模型組(P<0.05)，當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠TNF-α、IL-1、IFN-γ及IgG含量低于枸櫞酸氯米芬片組(P<0.05)。

2.4 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表達(dá)比較 見表3。

表3 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表達(dá)比較

由表3可見，模型組大鼠HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表達(dá)高于空白組(P<0.05)，枸櫞酸氯米芬片組、當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表達(dá)均低于模型組(P<0.05)，當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表達(dá)低于枸櫞酸氯米芬片組(P<0.05)。各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中HMGB1 、自噬蛋白Beclin-1蛋白表達(dá)見圖2。

A空白組；B模型組；C枸櫞酸氯米芬片組；D當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯組

3 討論

不孕癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，除排卵障礙、精液異常、輸卵管異常外，炎性反應(yīng)、免疫抑制因素也能導(dǎo)致不孕發(fā)生[7-8]。有研究認(rèn)為，免疫抗體的陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)，對(duì)于免疫性不孕癥有重要影響[9]。不孕癥發(fā)生時(shí)，組織內(nèi)炎性因子的種類和比例發(fā)生變化，機(jī)體在免疫作用機(jī)制下出現(xiàn)免疫異常表達(dá)[10]。臨床中炎癥因子TNF-α、IL-1、IFN-γ及免疫因子IgG在免疫性不孕癥患者中普遍呈現(xiàn)升高狀態(tài)，且對(duì)疾病的發(fā)展轉(zhuǎn)歸呈現(xiàn)一定程度的表達(dá)變化。TNF-α、IL-1、IFN-γ、IgG等能通過(guò)調(diào)控多種細(xì)胞信號(hào)通路來(lái)釋放多種免疫抗體，從而達(dá)到干預(yù)組織炎性反應(yīng)的效果，是機(jī)體進(jìn)行特異性反應(yīng)的重要因子[11-12]。HMGB1是一種高度保守的核蛋白，具有十分強(qiáng)大的TATA盒(真核生物啟動(dòng)子的元件之一)啟動(dòng)子，可對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的選擇發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步影響細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、重組和基因組穩(wěn)定性[13]。HMGB1除核功能外，還可作為細(xì)胞外信號(hào)分子調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、炎癥、自噬過(guò)程[14]。組織內(nèi)發(fā)生炎性反應(yīng)時(shí)，巨噬細(xì)胞在炎癥因子刺激下能夠釋放大量HMGB1，而HMGB1又負(fù)反饋通過(guò)靶向抑制因子表達(dá)來(lái)調(diào)控炎癥因子釋放，減弱免疫因素誘導(dǎo)的不孕癥過(guò)程[15]。自噬蛋白Beclin-1在體內(nèi)能特異性調(diào)節(jié)組織中自由基活動(dòng)程度，對(duì)機(jī)體的炎性反應(yīng)和炎癥過(guò)程發(fā)揮重要作用[16]。自噬蛋白Beclin-1蛋白在胞內(nèi)能與HMGB1蛋白特異性結(jié)合阻斷多種炎性因子表達(dá)，進(jìn)而抑制炎性反應(yīng)過(guò)程[17-18]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，素體血虛、內(nèi)有久寒是導(dǎo)致不孕癥發(fā)生的重要原因。《傅青主女科》謂 “寒冰之地， 不生草木；重陰之淵，不長(zhǎng)魚龍。今胞胎既寒，何能受孕”[19]。《滇南本草》亦指出“治婦人經(jīng)行受寒， 月經(jīng)不調(diào)……不能受胎”。因此，治療不孕癥應(yīng)以養(yǎng)血通絡(luò)、散寒降逆為主。當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯出自張仲景《傷寒論》，由當(dāng)歸四逆湯合吳茱萸、生姜組成。方中當(dāng)歸補(bǔ)血活血，桂枝溫經(jīng)散寒通脈，2味為君藥；白芍助當(dāng)歸和營(yíng)補(bǔ)血，以治血虛，細(xì)辛、通草助陽(yáng)散寒，3味為臣藥；吳茱萸、生姜溫中散寒，降逆和胃，助君臣活血散寒之力，共為佐藥；大棗、炙甘草益氣健脾養(yǎng)血，調(diào)和藥性，共為使藥。全方共奏養(yǎng)血通絡(luò)、散寒降逆功效。

本研究結(jié)果顯示，空白組大鼠子宮組織細(xì)胞排列整齊，厚度均勻，間質(zhì)正常，無(wú)(少)炎性浸潤(rùn)；模型組大鼠子宮組織間質(zhì)水腫疏松，腺體稀少，細(xì)胞排列錯(cuò)亂；經(jīng)藥物治療后，枸櫞酸氯米芬片組大鼠炎癥細(xì)胞減少，細(xì)胞水腫減少；當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠炎癥細(xì)胞減少，細(xì)胞排列整齊，提示當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯對(duì)不孕癥大鼠，子宮組織形態(tài)學(xué)具有明顯改善作用。模型組大鼠子宮內(nèi)膜厚度低于空白組(P<0.05)，枸櫞酸氯米芬片組、當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠子宮內(nèi)膜厚度均高于模型組(P<0.05)，當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠子宮內(nèi)膜厚度高于枸櫞酸氯米芬片組(P<0.05)，進(jìn)一步證實(shí)當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯通過(guò)增加大鼠子宮內(nèi)膜厚度，提高受孕率。

本研究結(jié)果顯示，不孕癥大鼠造模成功后，大鼠子宮內(nèi)膜組織炎性變化明顯，炎癥因子TNF-α、IL-1、IFN-γ及免疫因子IgG含量明顯升高(P<0.05)。枸櫞酸氯米芬組和當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠治療后TNF-α、IL-1、IFN-γ、IgG含量均降低(P<0.05)，其中當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠治療效果優(yōu)于枸櫞酸氯米芬片組(P<0.05)，說(shuō)明當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯可能通過(guò)調(diào)控不孕癥大鼠的免疫應(yīng)答改變，從而在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生抗炎抑炎作用。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，造模后大鼠子宮內(nèi)膜組織中HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，說(shuō)明HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白在造模后表達(dá)出現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)，這也證實(shí)HMGB1、自噬蛋白Beclin-1及其調(diào)節(jié)機(jī)制可能與不孕癥的發(fā)病具有一定的相關(guān)性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，枸櫞酸氯米芬組、當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠治療后子宮內(nèi)膜組織中HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)，且當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯組下降更明顯(P<0.05)，這也說(shuō)明當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯可有效降低不孕癥模型大鼠子宮內(nèi)膜組織中HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控自由基釋放，從而抑制炎性反應(yīng)進(jìn)程。

綜上所述，當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯可通過(guò)調(diào)控HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表達(dá)，抑制炎癥因子TNF-α、IL-1、IFN-γ及免疫因子IgG反應(yīng)，進(jìn)而控制不孕癥大鼠炎性反應(yīng)過(guò)程。