王 東 鄭 威 馮 曄 王春雷 王 丹 高麗輝 張建華包額爾敦嘎 張 超 金 虎 丁 寧 劉涵淼

（通遼市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 內(nèi)蒙古通遼028015）

玉米是我國(guó)第一大作物，隨著人口的增加和耕地的不斷減少，生產(chǎn)上對(duì)高效、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)的玉米品種的需求日趨迫切，這就要求我們出好品種、快出品種。而常規(guī)育種周期較長(zhǎng)、選擇效率較低，育成一個(gè)玉米新品種需要經(jīng)歷10 年左右，其中選育優(yōu)良自交系要經(jīng)歷5～7 年，這樣很難滿足出好品種、快出品種的要求。單倍體技術(shù)、基因工程技術(shù)、分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，大大縮短了自交系的選育年限，使常規(guī)選系的5～7 年縮短為 1～2 年。

1 單倍體誘導(dǎo)技術(shù)

單倍體誘導(dǎo)技術(shù)在育種中的應(yīng)用主要分為兩個(gè)階段：一是優(yōu)良基礎(chǔ)群體材料的誘導(dǎo)階段。本階段根據(jù)基礎(chǔ)材料的不同，可以選擇F1代或F2代、F3代進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)時(shí)，以基礎(chǔ)材料為母本、優(yōu)良誘導(dǎo)系為父本進(jìn)行雜交，秋季挑選胚乳糊粉層紫色胚無(wú)色的籽粒為準(zhǔn)單倍體備用加倍處理；胚乳糊粉層紫色胚紫色的籽粒和胚乳糊粉層無(wú)色胚無(wú)色的籽粒均淘汰。二是擬單倍體的加倍過程。準(zhǔn)單倍體的加倍方法主要有自然加倍法和人工藥物處理加倍法。由于自然加倍率很低，現(xiàn)在大多數(shù)科研單位均采用人工藥物加倍方法，其中采用最多的是秋水仙素加倍處理方法。

秋水仙素是誘導(dǎo)多倍體效果最好的藥劑之一。它的作用機(jī)理：當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行分裂時(shí)，一方面能使染色體的著絲點(diǎn)延遲分裂，于是已復(fù)制的染色體兩條單條分離，而著絲點(diǎn)仍點(diǎn)連在一起，形成“X”形染色體圖像；另一方面是引起分裂中期的紡錘絲斷裂，或抑制紡錘體的形成，結(jié)果到分裂后期染色體無(wú)微管牽引不能移向兩極，而重組成一個(gè)雙倍性細(xì)胞核。這時(shí)，細(xì)胞加大而不分裂，或者分裂成一個(gè)無(wú)細(xì)胞核的子細(xì)胞和一個(gè)有雙倍性細(xì)胞核的子細(xì)胞。經(jīng)過一個(gè)時(shí)期以后，這種染色體數(shù)目加倍了的細(xì)胞再分裂增長(zhǎng)時(shí)，就構(gòu)成了雙倍性的細(xì)胞和組織。

2 秋水仙素加倍流程

2.1 試劑和設(shè)備工具的準(zhǔn)備

試劑主要包括：Col（秋水仙素）、DMSO（二甲基亞砜）、蒸餾水、酒精、次氯酸鈉；設(shè)備工具主要包括人工發(fā)芽室、冰箱、通風(fēng)櫥、防毒面具、手套、量筒、燒杯、帶封閉蓋的大玻璃瓶、大片濾紙、毛巾、托盤、噴壺、刀片、小沙網(wǎng)袋、浸泡桶等。

2.2 種子發(fā)芽前處理

首先把準(zhǔn)單倍體種子浸泡在溫清水中6 h；其次是在托盤上放置一條沾濕的毛巾，在毛巾上放一層沾濕的濾紙，把浸泡結(jié)束的種子胚面向上整齊擺放在濾紙上，再在種子上面蓋一層沾濕的濾紙，然后將毛巾蓋在上面的濾紙上，寫好標(biāo)簽；最后把裝有準(zhǔn)單倍體種子的發(fā)芽盤擺放在發(fā)芽室 （發(fā)芽室溫度控制在28℃左右）精心管理適時(shí)適量噴水。

2.3 秋水仙素溶液配制

據(jù)研究證明，0.06%的秋水仙素浸泡胚芽加倍效果最佳。將配置秋水仙素溶液所需的Col、DMSO、量筒、燒杯、帶封閉蓋的大玻璃瓶放入通風(fēng)櫥內(nèi)，戴上防毒面具和手套等防護(hù)措施并打開通風(fēng)櫥。量取一定體積的蒸餾水加入到大玻璃瓶中，量取總體積5%的DMSO 加入到燒杯中，將Col 粉末加入到燒杯中，待充分溶解后倒入大玻璃瓶中，用蒸餾水定容到所需的Col 溶液體積并封閉用力震蕩5 min 使其充分混合；最后，把配制好的Col 溶液搬放到浸泡室備用。

2.4 準(zhǔn)單倍體幼芽胚芽鞘尖端切除

從發(fā)芽室取出幼芽長(zhǎng)度為2 cm 左右且尖端具有白色小泡的幼苗，根據(jù)紫色標(biāo)記剔除生長(zhǎng)勢(shì)很強(qiáng)且胚根和膨大胚處為紫色的假單倍體幼苗，通常非單倍體幼苗的根和芽的長(zhǎng)度是單倍體的2～3 倍。挑選出真的適合切除的單倍體幼苗，人工切去胚芽鞘尖端2 mm 左右，把不適合切除的幼苗再次放回到發(fā)芽室繼續(xù)發(fā)芽，待幼芽長(zhǎng)度達(dá)到要求后再進(jìn)行切芽處理，盡可能的仔細(xì)切除后面幼苗的胚芽鞘尖端。

2.5 秋水仙素處理

把切除胚芽鞘尖端的幼苗小心的裝入到小沙網(wǎng)袋中并做好標(biāo)記，將小沙網(wǎng)袋放入浸泡桶內(nèi)，戴好防護(hù)措施在浸泡室把配制好的Col 溶液倒入到浸泡桶內(nèi)并密閉浸泡桶，將幼苗浸泡8 h。浸泡結(jié)束后取出小紗網(wǎng)袋放入干凈的塑料盒或塑料桶內(nèi)用流動(dòng)的清水沖洗30 min 以上，待沖洗結(jié)束后取出小紗網(wǎng)袋。

2.6 藥物處理后材料的處理

秋水仙素處理結(jié)束后，將幼苗移至育苗室或日光溫室中。在塑料盒底部放置一條濕毛巾，把幼苗從小紗網(wǎng)袋中倒入塑料盒內(nèi)，均勻鋪開，上面再蓋一條濕毛巾，定期噴灑蒸餾水，也可以給幼苗噴灑一定濃度的生長(zhǎng)素，增強(qiáng)苗活力，給它提供良好的高磷培養(yǎng)環(huán)境促進(jìn)根系的發(fā)育，待幼苗生根長(zhǎng)出新的葉片時(shí)及時(shí)移栽。

3 田間管理

3.1 幼苗移栽

在幼苗藥物處理之后，田間可以作業(yè)，采用大小壟膜下滴灌模式進(jìn)行栽植。移栽前先覆好膜、滴足水，選擇氣溫不要太高的晴朗天進(jìn)行移栽，選擇上午6：00開始和下午3：00 以后進(jìn)行，避免中午高溫對(duì)幼苗的傷害。將幼苗按20 cm 的株距進(jìn)行栽植，幼苗露出地表1～2 cm，封嚴(yán)苗口，及時(shí)滴水，確保幼苗成活率。

3.2 田間精細(xì)管理

幼苗栽植后在田間有一定的緩苗期，這時(shí)一定要保證田間濕度。根據(jù)氣溫和田間土壤濕潤(rùn)程度及時(shí)澆水，防止幼苗失水而死。田間采用精細(xì)管理，及時(shí)除草、澆水、施肥、打藥防蟲等。

3.3 田間去除雜株和授粉

單倍體種子在加倍過程中常常不能全株被正常加倍，因此會(huì)表現(xiàn)出葉片狹窄且?guī)в邪咨珬l紋、植株矮小、雌穗和葉序活力不夠，在拔節(jié)期開始，陸續(xù)去除田間生長(zhǎng)旺盛、葉片肥大的雜株。在雌穗吐絲前及時(shí)給雌穗套小袋，在雄穗散粉期仔細(xì)觀察每一個(gè)單株的雄穗，看其能否正常散粉，一旦發(fā)現(xiàn)雄穗有散粉的情況，立刻授粉并掛牌。

4 注意事項(xiàng)

在準(zhǔn)單倍體藥物加倍進(jìn)程和幼苗田間管理時(shí)，有許多需要注意的地方，這些細(xì)節(jié)有可能導(dǎo)致重大事故或加倍的失敗，經(jīng)過多年的試驗(yàn)，主要有以下幾個(gè)方面。

4.1 準(zhǔn)單倍體發(fā)芽期

發(fā)芽室的溫度要控制在28℃左右，溫度不能過高也不能過低，否則幼芽會(huì)徒長(zhǎng)或生長(zhǎng)緩慢，影響發(fā)芽質(zhì)量；種子灑水不能太多，以保持毛巾濕潤(rùn)，水分飽和但托盤中沒有積水為宜；發(fā)芽托盤、毛巾、濾紙需提前滅菌處理，以免種子在發(fā)芽過程中被感染。

4.2 準(zhǔn)單倍體幼芽胚芽鞘切除期

準(zhǔn)單倍體幼芽胚芽長(zhǎng)度2 cm 為最佳切除時(shí)期，切除過早，秋水仙素對(duì)其傷害太大，致死率過高；切除過晚，膨大的芽會(huì)變成幼葉不能過行切割，也會(huì)在裝紗網(wǎng)袋時(shí)容易造成斷芽。

4.3 幼芽浸泡時(shí)期

由于秋水仙素劇毒，在配制0.06%秋水仙素溶液時(shí)，一定要做好防護(hù)。保證在穿戴防毒面具的同時(shí)盡可能地在通風(fēng)櫥中操作，如果沒有通風(fēng)櫥，也要確保在空氣流通順暢的場(chǎng)地進(jìn)行。配制好的秋水仙素溶液要密封在容器中備用，浸泡桶放入切好的幼芽，倒入配制好的秋水仙素溶液后也要密閉，并且放置在通風(fēng)效果好的地方。

幼芽浸泡要嚴(yán)格控制在8 h，時(shí)間過短達(dá)不到加倍的效果，時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)加重秋水仙素對(duì)幼芽的毒害。浸泡后，用流水沖洗時(shí)，水量不宜過大，以免造成斷芽，沖洗時(shí)間在30 min 以上即可，不可時(shí)間過長(zhǎng)，以免影響幼芽活性。

4.4 幼芽田間移栽

經(jīng)過秋水仙素處理的幼芽經(jīng)過3 d 左右的活性恢復(fù)后，選擇陰天或傍晚進(jìn)行移栽，移栽后立即澆水，以免幼苗失水過多而死。移栽后的幼苗要進(jìn)行精細(xì)管理，由于幼苗栽植只有1～2 cm，根據(jù)每天的氣溫和地表土壤干旱程度適時(shí)澆水，確保幼苗能夠正常生根生長(zhǎng)。

4.5 秋水仙素的保存與處理

根所每年秋水仙素的用量臨時(shí)購(gòu)置，不要一次性購(gòu)置過多。秋水仙素購(gòu)置后，檢查密封是否完好，并嚴(yán)格的保存在冰箱或冰柜中，不可放置在室溫下或暴露在空氣中；在使用過程中如果秋水仙素不慎沾到皮膚上，必須立即用清水沖洗2 min 以上。用過的秋水仙素溶液不得隨意傾倒，用密封的塑料桶裝好放置在陰涼的角落，并做好標(biāo)記，放置1 年以上待失去藥性后方可傾倒。