楊瀾波 鄒春雨 米豫飛 黃 濤 王戰(zhàn)朝

骨關(guān)節(jié)炎是一種慢性的關(guān)節(jié)退行性疾病，以軟骨細(xì)胞減少與進(jìn)展性軟骨退變?yōu)橹饕卣鱗1]。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細(xì)胞，其凋亡直接參與骨關(guān)節(jié)炎的病理過(guò)程[2]。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)是軟骨的主要組成部分，也是骨關(guān)節(jié)炎的主要靶點(diǎn)。因此，抑制軟骨細(xì)胞凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)降解是預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎的有效途徑。多項(xiàng)研究表明，Wnt/β-catenin通路不僅影響軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解，在軟骨細(xì)胞凋亡中亦扮演著重要角色，被認(rèn)為是骨關(guān)節(jié)炎治療的潛在靶點(diǎn)[3]。同時(shí)，研究顯示，泛素特異性蛋白酶49(ubiquitin specific proteases 49，USP49)具有抗腫瘤、抗病毒等多種作用，但尚無(wú)作用于骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)報(bào)道[4,5]。本研究首先通過(guò)NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，USP49在骨關(guān)節(jié)炎患者中存在異常表達(dá)。以此為基礎(chǔ)，了解USP49在IL-1β預(yù)處理的軟骨細(xì)胞中的表達(dá)水平，進(jìn)一步檢測(cè)上調(diào)USP49能否對(duì)Wnt/β-catenin通路、軟骨細(xì)胞凋亡和軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)蛋白表達(dá)產(chǎn)生影響，通過(guò)本研究了解USP49在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的具體作用。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑：4周齡SD大鼠由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005，本研究經(jīng)中國(guó)人民解放軍第989醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審批后實(shí)施。RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)，胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，Revert Aid First Strand cDNA Synthesis試劑盒及SYBR Green PCR 試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher公司)，兔抗鼠Collagen II、SOX9、β-actin抗體(英國(guó)Abcam公司)，兔抗鼠USP49、MMP-1及MMP-13單克隆抗體(美國(guó)Affinity公司)，兔抗鼠β-catenin單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling公司)，重組IL-1β蛋白(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，pcDNA3.1(+)-USP49真核表達(dá)質(zhì)粒(上海基爾頓生物科技有限公司)。

2.USP49在骨關(guān)節(jié)炎患者中的表達(dá)：基于NCBI基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)中的GSE57218數(shù)據(jù)集，使用 GEO2R 工具做差異分析，定義組別為骨關(guān)節(jié)炎組及正常組，比較 USP49 在正常樣本與骨關(guān)節(jié)炎樣本中的表達(dá)差異[6]。

3.軟骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定：處死SD大鼠，無(wú)菌取出膝關(guān)節(jié)軟骨，經(jīng)0.25% 胰蛋白酶及0.2% Ⅱ型膠原酶消化后獲得細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2、飽和濕度)中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～80%融合時(shí)，按照1∶3比例傳代。軟骨細(xì)胞爬片，固定并使用0.5% Triton X-100滲透后分別加入Collagen Ⅱ及SOX9抗體孵育過(guò)夜，之后加入Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG室溫孵育2h，DAPI與抗熒光淬滅劑封片，激光掃描顯微鏡觀(guān)察。

4.RT-PCR及Western blot法檢測(cè)IL-1β對(duì)USP49表達(dá)的影響：取生長(zhǎng)活躍的軟骨細(xì)胞，分別加入PBS，5、10、20ng/ml的IL-1β孵育24h。采用Trizol 法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為內(nèi)參，配置反應(yīng)體系25μl，RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10min，95℃變性15s，60℃變性45s，共40個(gè)循環(huán)。USP49 mRNA水平計(jì)算的方法為2-ΔΔCt。USP49及β-actin引物由上海捷瑞生物有限公司合成，序列如下：β-actin上游引物：5′-GTCCCTGTATGCCTCTGG-3′，下游引物：5′-ATGTCACGCACGATTTCC-3′。USP49上游引物：5′-GTAACAGCAAACGACGAAAG-3′，下游引物：5′-GTAGTGTCCTGAGCCAAACC-3′。取生長(zhǎng)活躍的軟骨細(xì)胞，分別加入PBS，5、10、20ng/ml的IL-1β孵育24h，采用RIPA法提取總蛋白。將25μg待測(cè)蛋白及7μl marker加入10% SDS-PAGE預(yù)制膠中，以β-actin為內(nèi)參，電泳約80min，待樣品跑至底部時(shí)停止電泳。轉(zhuǎn)膜封閉后加入U(xiǎn)SP49的一抗(1∶1000)后置于4℃濕盒中孵育過(guò)夜。加入HRP標(biāo)記的二抗溶液(1∶1000)，室溫下?lián)u動(dòng)孵育1h。滴加ECL發(fā)光液，使用Tanon-5200 ECL記錄蛋白印跡，使用Image J軟件計(jì)算相對(duì)蛋白水平。

5.USP49過(guò)表達(dá)(over-expressed USP49, oeUSP49)軟骨細(xì)胞的構(gòu)建與驗(yàn)證：取位于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的軟骨細(xì)胞，將oeUSP49質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒分別與Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑混勻，室溫靜置20min后加入軟骨細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)60h。RT-PCR及Western blot法檢測(cè)未轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞(對(duì)照組)、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞(空白組)、USP49過(guò)表達(dá)軟骨細(xì)胞(oeUSP49組)中USP49的mRNA水平及蛋白表達(dá)，方法同前。

6.IL-1β對(duì)正常軟骨細(xì)胞及oeUSP49軟骨細(xì)胞的影響：于原代軟骨細(xì)胞中加入PBS，空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞、oeUSP49軟骨細(xì)胞中加入10ng/ml IL-1β，共同孵育24h。待測(cè)軟骨細(xì)胞洗滌后先后加入5μl Annexin V-FITC 4℃避光孵育15min及5μl PI 4℃避光孵育5min后上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算凋亡細(xì)胞的百分比。Western blot法檢測(cè)USP49、β-catenin、MMP-1和MMP-13的蛋白表達(dá)，方法同前。

結(jié) 果

1.USP49在骨關(guān)節(jié)炎患者中的表達(dá)(圖1)：骨關(guān)節(jié)炎患者樣本(8.646±0.525，n=33)較正常人樣本(9.764±1.047，n=7)，USP49表達(dá)顯著降低(P=0.000)。

圖1 GSE57218數(shù)據(jù)庫(kù)中USP49在正常與骨關(guān)節(jié)炎樣本中的表達(dá)差異A.數(shù)據(jù)庫(kù)中各樣本USP49基因的表達(dá)量；B.正常人與骨關(guān)節(jié)炎患者USP49的表達(dá)差異

2.原代軟骨細(xì)胞的鑒定：Collagen Ⅱ在胞質(zhì)中均勻分布，而SOX9集中表達(dá)于細(xì)胞核(圖2)。Collagen Ⅱ與SOX9分別是軟骨細(xì)胞胞質(zhì)與胞核中的標(biāo)志性抗原，故所培養(yǎng)細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。

圖2 原代培養(yǎng)大鼠軟骨細(xì)胞的Collagen Ⅱ和SOX9免疫熒光鑒定(×400)

3.IL-1β對(duì)USP49表達(dá)的影響：RT-PCR檢測(cè)(圖3A)顯示，IL-1β干預(yù)后軟骨細(xì)胞中USP49 mRNA水平與PBS比較顯著降低，其中10ng/ml及20ng/ml IL-1β干預(yù)后USP49 mRNA降低非常顯著(P=0.000)；同時(shí)，10ng/ml較5ng/ml IL-1β干預(yù)后USP49 mRNA顯著下調(diào)(P<0.05)。Western blot法結(jié)果顯示，與PBS比較，IL-1β處理軟骨細(xì)胞后USP49表達(dá)明顯下調(diào)(圖3B和圖3C)。另外，與5ng/ml比較，10ng/ml IL-1β干預(yù)后USP49表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。

圖3 IL-1β對(duì)軟骨細(xì)胞USP49的mRNA及蛋白表達(dá)的影響A.USP49 mRNA表達(dá)水平；B、C.USP49蛋白表達(dá)水平。與PBS比較，*P<0.05，**P<0.01，***P=0.000;與5ng/ml IL-1β比較，#P<0.05

4.USP49過(guò)表達(dá)軟骨細(xì)胞的構(gòu)建與驗(yàn)證：與未轉(zhuǎn)染和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染比較，RT-PCR(圖4 A)與Westernblot法檢測(cè)(圖4B)顯示，oeUSP49質(zhì)粒轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞中USP49 mRNA與USP49蛋白水平顯著上調(diào)(P=0.000)。轉(zhuǎn)染后USP49表達(dá)明顯上調(diào)，過(guò)表達(dá)USP49軟骨細(xì)胞構(gòu)建成功。

圖4 USP49過(guò)表達(dá)軟骨細(xì)胞的USP49 mRNA及蛋白表達(dá)水平A.USP49 mRNA表達(dá)水平；B.USP49蛋白表達(dá)水平。與對(duì)照組及空白組比較，*P=0.000

5.IL-1β對(duì)正常軟骨細(xì)胞及oeUSP49軟骨細(xì)胞的影響：流式檢測(cè)(圖5)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，空白組凋亡軟骨細(xì)胞明顯增多(P=0.000)；與空白組比較，oeUSP49組凋亡軟骨細(xì)胞顯著減少(P=0.000)。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示(圖6、圖7)，與對(duì)照組比較，空白組軟骨細(xì)胞中USP49表達(dá)顯著降低(P<0.01)；而oeUSP49組較空白組軟骨細(xì)胞中USP49表達(dá)明顯升高(P=0.000)。與對(duì)照組比較，空白組軟骨細(xì)胞中β-catenin，MMP-1、MMP-13水平顯著上調(diào)(P=0.000)；而oeUSP49組較空白組軟骨細(xì)胞中β-catenin(P=0.000)，MMP-1(P<0.01)、MMP-13(P<0.01)水平顯著下調(diào)。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)IL-1β誘導(dǎo)的USP49過(guò)表達(dá)軟骨細(xì)胞凋亡與對(duì)照組比較，*P=0.000; 與空白組比較，#P=0.000

圖6 IL-1β預(yù)處理軟骨細(xì)胞后USP49和β-catenin的表達(dá)與對(duì)照組比較，*P<0.01，**P=0.000；與空白組比較，##P=0.000

圖7 IL-1β預(yù)處理軟骨細(xì)胞后MMP-1和MMP-13的表達(dá)與對(duì)照組比較，*P<0.01；與空白組比較，#P<0.01

討 論

骨關(guān)節(jié)炎是最為常見(jiàn)的健康問(wèn)題之一，其發(fā)病機(jī)制仍不清楚，治療以減輕癥狀為主，尚無(wú)療效明確的藥物[7]。因此，尋求可有效治療骨關(guān)節(jié)炎的靶點(diǎn)是目前的研究熱點(diǎn)。

蛋白質(zhì)合成和降解之間的平衡維持了真核細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。其中，泛素化介導(dǎo)了主要的非溶酶體胞內(nèi)蛋白降解途徑，其包括3種主要成分，即蛋白酶體全酶、若干泛素連接酶和去泛素酶[8]。泛素對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(泛素化與去泛素化)是調(diào)控細(xì)胞諸多生物學(xué)行為的一個(gè)主要方式。泛素化與去泛素化是動(dòng)態(tài)可逆的，去泛素酶通過(guò)裂解靶蛋白結(jié)合的多泛素鏈或單泛素逆轉(zhuǎn)泛素化，抑制靶蛋白經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑降解，調(diào)控體內(nèi)蛋白水平與活性，進(jìn)而影響各種生理過(guò)程[9]。研究表明，去泛素酶涉及許多疾病，如癌癥、炎癥和感染等[10]。

USP49是一個(gè)含有泛素特異性蛋白酶結(jié)構(gòu)域和鋅指連接結(jié)構(gòu)域的去泛素酶，主要存在于細(xì)胞核[11]。Zhang等[4]研究發(fā)現(xiàn)USP49與ATP酶形成復(fù)合物，通過(guò)特異性去泛素化組蛋白H2B來(lái)影響DNA的轉(zhuǎn)錄。Ye等[5]揭示USP49通過(guò)去泛素化MITA調(diào)控先天抗病毒的信號(hào)通路。Tu等[12]在心肌細(xì)胞的缺血再灌注損傷中發(fā)現(xiàn)，USP49通過(guò)去泛素化調(diào)控DUSP1-JNK1/2通路，提高心肌細(xì)胞的活力并抑制凋亡。趙彥芬等[13]研究顯示特異性沉默USP49表達(dá)可改善糖尿病大鼠痛敏反應(yīng)，其機(jī)制可能與USP49介導(dǎo)的FKBP51蛋白去泛素化有關(guān)。本研究采用NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)USP49在骨關(guān)節(jié)炎患者中表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中USP49表達(dá)顯著降低，說(shuō)明USP49可能在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。通過(guò)構(gòu)建USP49過(guò)表達(dá)軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)USP49表達(dá)上調(diào)之后軟骨細(xì)胞凋亡減弱，軟骨降解相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)，表明USP49可能通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞凋亡及軟骨降解來(lái)控制骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。

骨關(guān)節(jié)炎的病理機(jī)制中涉及多個(gè)信號(hào)通路，其中，Wnt/β-catenin通路通過(guò)激活異?；蚝偷鞍踪|(zhì)表達(dá)，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)水平，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，加速軟骨退變[14]。β-catenin作為此通路的重要成分，參與骨關(guān)節(jié)炎的病理過(guò)程[15]。研究顯示，Wnt/β-catenin通路通過(guò)上調(diào)MMP-13等MMPs表達(dá)，加速軟骨基質(zhì)降解，促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展[16]。此外，Wnt/β-catenin通路具有調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的成熟、分化和凋亡的作用[17]。條件激活Wnt/β-catenin通路可致小鼠軟骨細(xì)胞的異常分化和骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生；阻斷此通路可減少M(fèi)MPs的產(chǎn)生，改善骨關(guān)節(jié)炎[18]。Miclea等[19]研究認(rèn)為抑制Wnt/β-catenin通路可減少軟骨細(xì)胞凋亡，控制軟骨退變。所以，抑制Wnt/β-catenin通路可能是治療骨關(guān)節(jié)炎的一種選擇[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，USP49過(guò)表達(dá)可顯著下調(diào)β-catenin表達(dá)，上調(diào)軟骨降解相關(guān)蛋白表達(dá)，抑制軟骨細(xì)胞凋亡，說(shuō)明USP49可能正是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路減弱軟骨細(xì)胞凋亡及軟骨降解，控制骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。

綜上所述，USP49可能通過(guò)Wnt/β-catenin通路抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨退變。本研究揭示了USP49在骨關(guān)節(jié)炎中的表達(dá)及干預(yù)軟骨退變的機(jī)制，為下一步尋找通過(guò)干預(yù)USP49治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。