霍 達 劉晶晶 范國慶 曾律滔 劉媛媛 蔡劍平 黃建東 崔 菊

細胞內(nèi)物質(zhì)運輸是細胞中重要的生物學過程，涵蓋了細胞內(nèi)多種物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、細胞器以及染色體等的細胞定位，因而對細胞內(nèi)的多種生理活動具有重要的調(diào)節(jié)作用。驅(qū)動蛋白作為馬達蛋白的一種，參與并負責細胞內(nèi)沿微管的物質(zhì)運輸，在有絲分裂期間調(diào)控染色體的運動，故而調(diào)節(jié)細胞的正常生長及增殖[1～3]。KIF5B是驅(qū)動蛋白家族kinesin-1的成員，主要負責胞質(zhì)中沿微管的物質(zhì)運輸，與神經(jīng)細胞中的軸突運輸相關(guān)，在有絲分裂期間可通過BICD2蛋白依賴的方式拮抗動力蛋白并調(diào)控胞核與中心體的分離[4～6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，KIF5B可能不單單只是起著物質(zhì)運輸?shù)淖饔?，在犬腎上皮連續(xù)細胞系(madin-daby canine kidney cells，MDCK)細胞中KIF5B的敲低可誘發(fā)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，乳腺癌中的研究也證明KIF5B能夠影響癌細胞的EMT[7,8]。而EMT能夠賦予上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞遷徙和轉(zhuǎn)移的能力，臨床表現(xiàn)為原發(fā)灶的癌擴散成為轉(zhuǎn)移灶，使得治療難度大大增加[9～11]。

結(jié)直腸癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，病死率較高，通常因為癌轉(zhuǎn)移與癌細胞耐藥性使得患者預后較差[12]。鑒于KIF5B在MDCK細胞和乳腺癌細胞EMT過程的作用，筆者推測KIF5B對于結(jié)直腸癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力有重要影響，因此本研究擬通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)來建立KIF5B沉默與KIF5B過表達的結(jié)直腸癌細胞系，檢測KIF5B對結(jié)直腸癌細胞增殖的影響，為后續(xù)研究KIF5B對于結(jié)直腸癌細胞EMT過程的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1.實驗細胞：HCT116細胞株，使用培養(yǎng)基為IMDM培養(yǎng)基(+10%FBS)。SW480細胞株，使用培養(yǎng)基為IMDM培養(yǎng)基(+10%FBS)。293T細胞株，使用培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基(+10%FBS)。LOVO細胞，使用培養(yǎng)基為F12K培養(yǎng)基(+10%FBS)。細胞分組情況如下：①正常組細胞：未經(jīng)轉(zhuǎn)染的正常結(jié)直腸癌細胞；②對照組細胞：轉(zhuǎn)染了陰性對照載體的結(jié)直腸癌細胞；③sh1組細胞: 轉(zhuǎn)染了攜帶有KIF5B-sh1的慢病毒的結(jié)直腸癌細胞；④sh2組細胞: 轉(zhuǎn)染了攜帶有KIF5B-sh2的慢病毒的結(jié)直腸癌細胞；⑤過表達組細胞: 轉(zhuǎn)染了過表達KIF5B載體的結(jié)直腸癌細胞。

2.主要試劑：IMDM培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基與F12K培養(yǎng)基為Hyclone產(chǎn)品；慢病毒載體(GV358和GV112)、輔助質(zhì)粒(Helper1.0和Helper2.0)和感受態(tài)細胞購自上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司；胎牛血清購自美國Thermo Fisher Scientific公司；KIF5B兔抗人單克隆抗體為本實驗室自制；tubulin與actin抗體，HRP標記山羊抗兔二抗皆購自北京康為世紀科技有限公司；嘌呤霉素購自美國Sigma-Aldrich公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收純化試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶購自New England Biolabs公司(北京)；DNA聚合酶購自日本TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購自美國Thermo Fisher Scientific公司；CCK-8試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

3.細胞培養(yǎng)與傳代:復蘇的結(jié)直腸癌細胞1000r/min離心5min后去除凍存液，加10ml完全培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)于CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，約2天傳代。

4.慢病毒載體的構(gòu)建：(1)shRNA的合成：根據(jù)人源KIF5B基因設(shè)計兩段siRNA序列5′-GCTCAACAGATGGCGTAAT-3′與5′-GAAGGGATCAAGACAATAT-3′，其陰性對照病毒序列為5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′，根據(jù)siRNA序列分別合成6條shRNA寡核苷酸單鏈,具體序列詳見表1。將成對的引物干粉溶解于退火緩沖液中，90℃水浴15min后冷卻至室溫得到配對的shRNA。(2)人KIF5B基因(NM_004521)擴增:通過PCR引物KIF5B(20820-3)-P1：5′-GAGGATCCCCGG-GTACCGGTCGCCACC-ATGGCGGACCTGGCCGAGTGC-AAC-3′和引物KIF5B(20820-3)-P2：5′-TCCTTGT-AGTCCATACCCACTTGTTTGCCTCCTCCACCTCGC-3′擴增人KIF5B基因。(3)載體構(gòu)建與測序：將(1)中的退火產(chǎn)物(或酶切后的PCR產(chǎn)物)與線性化載體按照體系連接，或于冰水浴中配置(2)中PCR產(chǎn)物與載體的交換體系，用所得連接產(chǎn)物(或交換反應產(chǎn)物)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌后氨芐西林藥篩培養(yǎng)，挑取單菌落進行PCR鑒定，對陽性克隆培養(yǎng)后取菌液測序。

表1 合成的KIF5B基因shRNA寡核苷酸單鏈信息

5.病毒包裝與檢測：(1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與病毒收獲 293T細胞以合適豐度鋪板貼壁，無血清培養(yǎng)2h后加入三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染液(包括GV載體質(zhì)粒20μg、pHelper 1.0載體質(zhì)粒15μg、pHelper 2.0載體質(zhì)粒10μg以及相應體積的吉凱轉(zhuǎn)染試劑)，輕柔混勻，6h后換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2～3天，收集上清，離心后再以0.45μm濾器過濾上清液，超速離心去除上清，加入病毒保存液輕柔重懸，溶解后10000r/min高速離心5min，取上清按要求分裝保存。(2)效價分析：取梯度稀釋的病毒溶液感染96孔板中的293T細胞，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，感染后72h加入抗性藥物嘌呤霉素，維持藥物濃度5μg/ml繼續(xù)培養(yǎng)1天，通過感染后的活細胞數(shù)量來計算病毒效價，病毒效價=活細胞數(shù)/病毒原液量。

6．細胞轉(zhuǎn)染：2.5%胰酶消化細胞，用含血清的培養(yǎng)基終止消化，1000r/min離心5min后棄上清，用完全培養(yǎng)基稀釋到(1～5)×105個/毫升并鋪板于6孔板中，并按照比例加入慢病毒與慢病毒感染增強液，于CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，12～16h后棄去舊培養(yǎng)基并加入不含病毒的新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，36～54h后加入嘌呤霉素至終濃度為2μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)至少5天以篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

7.Western blot法檢測：胰酶消化1500r/min離心1min收集細胞，用PBS洗1遍后取細胞沉淀，加入RIPA裂解液重懸細胞沉淀，冰上放置30min裂解細胞，期間可渦旋震蕩促進細胞裂解，12000×g離心20min后取上清，BCA法測濃度后加入上樣緩沖液混勻后100℃加熱變性10min。取20μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，80mV恒壓10～20min待條帶進入分離膠后轉(zhuǎn)120mV恒壓至條帶接近制膠板下緣停止電泳，取出膠260mA恒流轉(zhuǎn)膜150min將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉(TBST配置)中封閉1.0～1.5h，裁剪目的條帶加一抗4℃孵育過夜，TBST洗后加二抗室溫孵育1h，TBST洗后顯影觀察。

8.CCK-8實驗：取對數(shù)生長期細胞胰酶消化后1500r/min離心1min收集細胞，用PBS洗1遍后重懸于新鮮培養(yǎng)基中，細胞計數(shù)后稀釋細胞濃度為2×104個/毫升，細胞懸液混勻后每孔100μl加入96孔板中，每組6個復孔，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔一段時間取出1個96孔板棄舊培養(yǎng)基，加入100μl新培養(yǎng)基(混有10μl的CCK-8試劑)，放回37℃培養(yǎng)箱孵育2h，檢測450nm和620nm處的吸光度(A)值。

結(jié) 果

1.KIF5B-GV358載體的鑒定：經(jīng)AgeⅠ酶切的GV-358質(zhì)粒與擴增得到的人KIF5B基因進行同源重組，得到KIF5B-GV358重組質(zhì)粒。PCR鑒定重組質(zhì)粒，進行電泳可見1040bp大小的產(chǎn)物(圖1)。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定KIF5B過表達載體1.陰性對照(ddH2O)；2.陰性對照(空白載體自連對照組)；3.陽性對照(GAPDH)；4.marker蛋白；5～12.1～8號轉(zhuǎn)化子

2.shKIF5B-GV112載體的鑒定：將AgeⅠ與EcoRⅠ酶切后的GV112載體與含有AgeⅠ與EcoRⅠ酶識別序列的干擾片段連接得到shKIF5B-GV112重組載體。轉(zhuǎn)化后挑選陽性克隆送測序，KIF5B-sh1與KIF5B-sh2的測序結(jié)果如圖2所示。

圖2 測序結(jié)果A.KIF5B-sh1測序峰圖；B.KIF5B-sh2測序峰圖

3.KIF5B-GV358載體表達情況：KIF5B-GV358重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，在熒光顯微鏡下觀察，能檢測到綠色熒光(圖3)，證明轉(zhuǎn)染成功。

圖3 熒光顯微鏡下鑒定KIF5B-GV358質(zhì)粒(×100)A.明場視野；B.綠色熒光視野

4.慢病毒效價：過表達重組質(zhì)粒與干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細胞進行嘌呤霉素藥篩，確定包裝的慢病毒效價結(jié)果如表2所示。

表2 慢病毒效價

5.KIF5B蛋白表達水平檢測：將KIF5B干擾慢病毒轉(zhuǎn)入HCT116細胞與SW480細胞中，KIF5B過表達慢病毒轉(zhuǎn)入LOVO細胞，經(jīng)過嘌呤霉素篩選分別得到穩(wěn)轉(zhuǎn)株后，收集細胞提取總蛋白進行Western blot法檢測3種細胞內(nèi)KIF5B表達水平，結(jié)果如圖4所示，對Western blot法檢測結(jié)果用Image J軟件計算灰度值后得到KIF5B蛋白相對表達量如圖5所示。在HCT116細胞中，對照組、sh1組和sh2組的KIF5B蛋白相對表達量分別為0.52±0.04、0.35±0.05和0.24±0.05；在SW480細胞中，對照組、sh1組和sh2組的KIF5B蛋白相對表達量分別為0.42±0.04、0.071±0.06和0.24±0.03；在LOVO細胞中，對照組和過表達組的KIF5B蛋白相對表達量分別為0.38±0.07和0.57±0.04。

圖4 KIF5B干擾(A)與過表達(B)慢病毒分別轉(zhuǎn)染3種不同結(jié)直腸癌細胞后的Western blot法檢測結(jié)果

圖5 KIF5B干擾與過表達慢病毒分別轉(zhuǎn)染3種不同結(jié)直腸癌細胞的效率A.HCT116細胞；B.SW480細胞；C.LOVO細胞

6.KIF5B表達水平降低后對結(jié)直腸癌細胞生長的影響：對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染KIF5B干擾慢病毒的HCT116與SW480細胞進行CCK-8檢測，結(jié)果如圖6所示。在HCT116細胞中，30h后對照組的相對A值(0.32±0.02)要低于sh1組(0.37±0.01)；在SW480細胞中，52h后對照組的相對A值(0.28±0.02)要低于sh1組(0.36±0.06)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖6 KIF5B干擾后對HCT116(A)與SW480(B)細胞增殖的影響與對照組比較，*P<0.05

7.KIF5B表達水平降低后對結(jié)直腸癌細胞內(nèi)細胞周期相關(guān)蛋白的影響：檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染KIF5B干擾慢病毒的HCT116與SW480細胞內(nèi)細胞周期相關(guān)蛋白的表達。對照組HCT116細胞和sh1組HCT116細胞的p21蛋白的相對表達量分別為0.60±0.02和0.52±0.03，p16蛋白的相對表達量分別為0.69±0.02和0.42±0.03，cyclin A2蛋白的相對表達量分別為0.60±0.05和0.57±0.06；對照組SW480細胞和sh1組SW480細胞的p21蛋白的相對表達量分別為0.62± 0.03和0.44±0.04，p16蛋白的相對表達量分別為0.92±0.04和0.71±0.06，cyclin A2蛋白的相對表達量分別為0.42±0.03和0.43±0.02。這表明敲低KIF5B后，HCT116與SW480細胞內(nèi)p21與p16蛋白表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義，而cyclin A2表達幾乎無變化,詳見圖7。

圖7 KIF5B干擾后HCT116與SW480細胞內(nèi)p21、p16、cyclin A2等蛋白表達水平的變化A.Western blot法檢測結(jié)果；B.蛋白相對表達量

討 論

結(jié)直腸癌作為常見的惡性腫瘤之一，截至2020年其發(fā)生率已位居全球第3位，病死率在所有惡性腫瘤中位居第2位，成為了公共健康領(lǐng)域亟需解決的重大問題[13]。臨床治療中，癌細胞的轉(zhuǎn)移與耐藥性是結(jié)直腸癌預后差的重要原因。因此，有效預防及避免癌細胞的轉(zhuǎn)移和尋找新的藥物靶點是治療結(jié)直腸癌的主要思路。

驅(qū)動蛋白是一類馬達蛋白，負責細胞內(nèi)沿微管的物質(zhì)運輸，參與到細胞內(nèi)功能蛋白的定位、染色質(zhì)的分離以及線粒體等細胞器的分布，對于細胞的生長增殖具有十分重要的作用[14～17]。驅(qū)動蛋白以其結(jié)構(gòu)而劃分為kinesin-1～kinesin-14等14個亞家族，其中kinesin-1家族由具有典型驅(qū)動蛋白結(jié)構(gòu)的KIF5、KIF5B與KIF5C組成[18]。在MDCK細胞系中的研究發(fā)現(xiàn)KIF5B與E-cadherin蛋白有相互作用，敲低KIF5B會降低E-cadherin的表達，增加N-cadherin的表達，引發(fā)EMT。另外在乳腺癌中的研究，Moamer等研究發(fā)現(xiàn)KIF5B通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子SNAIL蛋白的核聚集來調(diào)控E-cadherin蛋白的表達，進而影響乳腺癌細胞的EMT。而KIF5B對結(jié)直腸癌進展的研究卻十分缺乏，因此，本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)來建立KIF5B沉默與KIF5B過表達的結(jié)直腸癌細胞模型，來為今后研究KIF5B在結(jié)直腸癌中的作用奠定基礎(chǔ)。

本實驗成功構(gòu)建了KIF5B沉默載體和KIF5B過表達載體，并成功轉(zhuǎn)染了3種不同的結(jié)直腸癌細胞株。另外，通過Western blot法檢測可以發(fā)現(xiàn)不同的RNAi序列對同種細胞、同種RNAi序列對不同細胞的沉默效率都不盡相同，因此需要通過基因序列分析、生信分析等手段尋找最佳沉默序列。接著在構(gòu)建了穩(wěn)轉(zhuǎn)KIF5B沉默載體的HCT116與SW480細胞系后，筆者用CCK-8實驗檢測發(fā)現(xiàn)KIF5B表達量降低導致這兩種結(jié)直腸癌細胞增殖加快，又檢測到p21與p16蛋白的表達水平隨KIF5B沉默而下降。p16蛋白與周期素依賴激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)CDK4和CDK6相互作用，并作為細胞增殖的負調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用，p21蛋白同樣參與到細胞周期的調(diào)控中并負向調(diào)節(jié)細胞增殖，在多種腫瘤細胞中表達異常[19～21]。亦有研究表明,p21與p16蛋白的表達可能與結(jié)直腸癌進展息息相關(guān)，因而筆者推測沉默KIF5B會降低p21和p16蛋白兩種細胞周期負調(diào)控蛋白的表達，加速結(jié)直腸癌細胞周期，從而促進癌細胞增殖，但其具體調(diào)節(jié)機制仍需開展進一步研究[22,23]。在今后的實驗中，筆者將繼續(xù)利用構(gòu)建好的KIF5B干擾與過表達載體研究KIF5B對結(jié)直腸癌細胞生長、凋亡與轉(zhuǎn)移的作用，為結(jié)直腸癌的臨床治療提供新的思路。